CROMATOGRAFÍA

GC SFC LC

Gas/Sólido Gas/Líquido

De Adsorción Intercambio iónico De Afinidad

(líquido/sólido)
De Reparto Exclusión por tamaños
(líquido/líquido)
 CROMATOGRAFIA
Historia

M. TSVET (1903): Separación de mezclas de

pigmentos vegetales en columnas rellenas con
adsorbentes sólidos y disolventes variados.

éter de
petróleo
mezcla de
pigmentos

CaCO3 pigmentos
separados

Cromatografia =
kroma [color] + graph [escribir]
(griego)
 CROMATOGRAFIA
Principio Básico
Separación de mezclas por interacción diferencial de sus
componentes entre una FASE ESTACIONARIA (líquido o
sólido) y una FASE MÓVIL (líquido o gas).
 CROMATOGRAFIA
Modalidades y Clasificación

Cromatografia
FM = Líquido
Líquida

Cromatografia
FM = Gas
Gaseosa (CG)

Cromatografia
Sólida
Gas-Sólido (CGS)
En CG la FE
puede ser:
Cromatografia
Líquida
Gas-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA GASEOSA
Aplicaciones

Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?

(para que una substancia cualquiera pueda ser

“arrastada” por un flujo de un gas ella debe
poder disolverse - al menos parcialmente -
en ese gas)

Mezclas cuyos constituyentes sean

VOLÁTILES (=“evaporables”)

EN GENERAL:
CG se emplea en la separación y análisis
de mezclas cuyos constituyentes tengan
PUNTOS DE EBULLICIÓN de hasta 300oC
y que sean térmicamente estables.
 Diferencias entre GC y HPLC

Tan sólo el 20% de los compuestos

orgánicos conocidos son analizados por
cromatografía de gases
 Actualmente

- Lípidos
- Fármacos
HRGC - Pesticidas
- Carbohidratos

- Fármacos
- Aminoácidos/proteínas
HPLC
- Carbohidratos
- Lípidos

“When GC can be used in a separation, GC should be used”

(Stephen J. Lehotay, Application of gas chromatography in food analysis,
2002, Trends in Analytical Chemistry, vol. 21, nº9-10, 686-697)

- alta eficacia en la separación

- gran fiabilidad en la instrumentación
- alta gama de detectores
- teoría y práctica muy estudiada
- fácil uso
- coste razonable
- gran número de analistas de GC
- etc
Análisis por Cromatografía Gaseosa
consiste esencialmente en 5 etapas:

1º/ Preparación de la muestra

2º/ Inyección de la muestra

3º/ Separación

4º/ Detección y enfriamiento

del horno

5º/ Tratamiento de los datos

 El Cromatógrafo de
Gases
1 6

3
1 – Suministro de Gas y Controles de Vacío / Presión
2 - Inyector (Vaporizador) de muestra
3 - Columna Cromatográfica y Horno
4 - Detector
5 – Amplificador de Señal (tratamiento electrónico)
6 - Registro de Señal (Registrador u Ordenador).
Observación: en rojo: temperatura controlada
 INSTRUMENTACIÓN
Gas de Arraste

Fase Móvil en CG: NO interacciona con la

muestra.

Requisitos:
INERTE No debe reaccionar con la muestra,
fase estacionaria o superfícies del instrumento.

PURO Debe estar exenta de impurezas que

puedan degradar la fase estacionaria.

Impurezas típicas en gases y sus efectos:

oxida / hidroliza algunas FE

H2O, O2 incompatibles con DCE

hidrocarburos ruido en la señal del

DIC
 INSTRUMENTACIÓN
Inyector “split/splitless”
Convencional
1
2 5 (3 mL/min)
Split/Splitless
(20-50 mL/min)

3
4

1 - Septum (silicona) FHe=1mL/min

2 - Alimentación gas portador
3 – Bloque metálico calefactado
4 - Punta de la columna cromatográfica
5- Purga del Septum
6- Glass-liner
Col. Rellenas: no split.
Col. Capilares: Inyect. con split/splitless
 - División de la muestra inyectada
SPLIT en dos partes en las que sólo una
se introduce en la columna.

Requerimientos:

- Completa vaporización de la muestra

Inyectada

- Perfecta homogeneización con el gas

portador

Linealidad (No Discriminación):

-La relación de split afecta por igual a todos
los solutos.
-Las áreas relativas son proporcionales a las
concentraciones de los solutos en la muestra.
-Cualquier cambio en las condiciones de
trabajo afecta por igual a los solutos.
 Con división-sin división

“Splitless”
“Split”
 INSTRUMENTACIÓN
Parámetros de Inyección
TEMPERATURA DEL INYECTOR debe ser lo
suficientemente elevada para que la muestra se
vaporice imediatamente sin que exista
descomposición.
Regla General: Tinj = 50oC por encima de la
temperatura de ebullición del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de
columna y del estado físico de la muestra
Muestras Muestras
COLUMNA Líquidas Gasosas

empaquetada 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL

 = 3,2 mm (1/4”)

capilar 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL

 = 0,25 mm

Sólidos: convencionalmente se disuelve en un

disolvente adecuado y se inyecta la solución
 INSTRUMENTACIÓN
Columnas: Definiciones Básicas

RELLENAS CAPILAR
 = 3 a 6 mm  = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Rellena con sólido pul- Paredes internas
verizado (FE sólida o FE recubiertas de fina
líquida depositada sobre película ( m) de FE
las partículas del relleno) líquida o sólida
Columna capilar
 INSTRUMENTACIÓN
Temperatura de la Columna

Además de su interacción con la FE, el tiempo

que un analito tarda en recorrer la columna
depende de su PRESIÓN DE VAPOR (p0).

Estructura química
del analito
p0 = f
Temperatura
de la columna

Temperatura Presión Velocidad

de la de de
columna vapor migración

ANALITO ELUYE MAS RAPIDA-

MENTE (MENOR RETENCIÓN)
 INSTRUMENTACIÓN
Horno de la Columna

Características deseables de un horno:

AMPLIO INTERVALO DE
TEMPERATURA DE USO

TEMPERATURA INDEPENDENTE DE
LOS DEMAS MÓDULOS No debe estar
afectada por la temperatura del inyector y
detector.

TEMPERATURA UNIFORME EN SU
INTERIOR Sistemas de ventilación
interna muy eficientes para mantener
uniforme la temperatura en todo el horno.
 INSTRUMENTACIÓN
Horno de la Columna

Características deseables de un horno:

FÁCIL ACCESO A LA COLUMNA la

operación de cambio de columna suele
ser frecuente
CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO
RÁPIDO Importante tanto en análisis de
rutina como durante el desarrollo de
nuevas metodologías analíticas.

TEMPERATURA ESTABLE Y
REPRODUCIBLE
La temperatura debe ser mantenida con
una exactitud y precisión de ± 0,1°C.
 INSTRUMENTACIÓN
Efecto de la Temperatura en GC

Aumento de Tª

Disminución de la intensidad de las fuerzas de

interacción de los solutos con la fase
estacionaria y los coeficientes de reparto
disminuyen
t´r

Tª
¡La variación de la retención con la Tª es
característica de cada soluto y sirve para
optimizar la separación!
 INSTRUMENTACIÓN
Programación Lineal de
Temperatura
Mezclas complejas (constituyentes con
volatilidades muy diferentes) separadas
ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAJA:
-Componentes más volátiles son
separados

- Componentes menos volá-

tiles tardan en eluir, saliendo
como picos mal definidos

TCOL ALTA:
- Componentes más
volátiles no son separados

- Componentes menos
volátiles eluyen más
rápidamente
 INSTRUMENTACIÓN
Programación Lineal de
Temperatura
La temperatura del horno puede variarse
linealmente durante la separación:

Se consigue una
buena separación
de los
componentes de la
muestra en menor
tiempo

Parámetros de una programación de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TFIM
TEMPERATURA

TFIM Temperatura Final

R
tINI Tiempo Isotérmico Inicial
TINI
tFIM Tiempo Final del Programa
tINI tFIM
R Velocidad de calefacción
TIEMPO
PTGC : Cromatografía de Gases con Tª programada
Aplicación: muestras complejas con amplio
Intervalo de volatilidad y/o polaridad en sus
componentes

-Menor tiempo de análisis

● Ventajas -Aumenta la sensibilidad
PTGC -Puede usarse para variar la selectividad
-Aumento de la vida útil de la columna
-Puede disminuir la resolución
● Inconvenientes en algunos casos.
PTGC -Deriva de la línea base
(alteración debida al aumento
de la Pvapor de la Fase
Estacionaria al elevar la Tª).

Línea Base
 Elección del Programa de Tª

Tª f (oC)
t (min)
Gradiente Tª
(oC/min)

Tª o
(oC)
t (min)

Tª inicial: próxima al punto de ebullición de los

solutos más volátiles.
Tiempo a la Tª inicial: es necesario cuando los
solutos más volátiles son difíciles de separar.
Gradiente de Tª: suele oscilar entre 1 y 10 oC/min.
Se ajusta experimentalmente.
Tª final: generalmente entre 80 y 100 oC por debajo del
punto de ebullición del soluto menos volátil.
Tiempo a la Tª final: el necesario para que se eluyan
todos los solutos.
 Interacciones más frecuentes entre el
soluto y la fase estacionaria

A) Fuerzas entre dipolos permanentes:

Se dan entre moléculas polares. Pertenecen
a este tipo los puentes de H2. Su intensidad
disminuye al elevar la Tª.

B) Fuerzas entre dipolos permanentes y

dipolos inducidos: Se dan entre moléculas
polares y apolares. También disminuyen al
elevar la Tª.

C) Fuerzas de dispersión o de London: se dan

entre moléculas no polares. Igualmente
disminuyen al elevar la Tª.
 Concepto de POLARIDAD en GC

(se utiliza en la práctica en lugar de Selectividad)

POLARIDAD de la Fase Líquida: término

poco preciso. Una fase líquida es polar
cuando sobre ella se retienen más los
solutos polares que los apolares a igualdad
de puntos de ebullición.

a) Fase polar – Soluto polar: interacciones entre

dipolos permanentes. (Fuertes: alta retención).

b) Fase no polar – Soluto no polar: interacciones

de dispersión. (Fuertes: alta retención)

c) Fase polar – Soluto no polar: interacciones

entre dipolos permanentes y dipolos inducidos.
Lo mismo entre Fase no polar y Solutos polares.
(Débiles: baja retención)
 agua
glicoles
amidas
ácidos inorgánicos
aminas
fenoles
alcoholes
aldehídos
cetonas
ésteres
hidrocarburos aromáticos
hidrocarburos insaturados
hidrocarburos saturados
Retención Retención
en fase en fase
POLAR APOLAR
 FASES ESTACIONARIAS
Conceptos Generales
LÍQUIDOS Depositados sobre la superfície de: só-
lidos porosos inertes (columnas empaquetadas) o de
tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)

FE
líquida

SOPORTE
Tubo capilar de
Sólido inerte
material inerte
poroso
Para minimizar la pérdida de FE líquida por
volatilización, normalmente es:

Entrecruzada: las Quimicamente ligadas:

cadenas las cadenas poliméricas
poliméricas están están “presas” en el
químicamente soporte mediante
ligadas entre si enlaces químicos
SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente
granulado (empaquetadas) o depositado sobre la
superfície interna de un tubo (capilar)
 FASES ESTACIONARIAS
Características de una FE ideal

SELECTIVA Debe interaccionar

diferencialmente con los componentes de la
muestra.

FE Selectiva:
separación
adecuada de los
constituyentes de
la muestra

FE poco Selectiva:
mala resolución con
columna de buena
eficacia

Regla general: la FE debe tener características lo más

próximas posibles a los solutos que queramos
separar (polar, apolar, aromático ...)
FASES ESTACIONARIAS
Características de una FE ideal

AMPLIO RANGO DE TEMPERATURAS

DE USO Mayor flexibilidad en la otimización de
la separación

BUENA ESTABILIDAD QUÍMICA Y

TÉRMICA Mayor durabilidad de la columna,
no reacciona con los componentes de la
muestra

POCO VISCOSA Columnas más

eficientes (menor resistencia a la
transferencia del analito entre fases)

DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO

DE PUREZA Columnas reproducibles;
ausencia de picos “fantasma” en los
cromatogramas.
 FASES ESTACIONARIAS
Familias de FE Líquidas
POLIGLICOLES Muy polares; sensibles al
agua y a la oxidación. Principal: Polietilenglicol
(nombres comerciales: Carbowax, DB-Wax,
Supelcowax, HP-Wax, etc.)

Estrutura Química: H O CH2 CH2 OH

n

AMINAS ALIFÁTICAS
Columna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH
TCOL: 200oC (isotérmico) Gas de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1
Detector: FID Muestra: 0,01 L de mezcla de aminas
 FASES ESTACIONARIAS
Familias de FE Líquidas
SILICONAS (polisiloxanos) Las FE más em-
pleadas en CG. Cubren una amplio rango de
polaridades y propriedades químicas diversas.

CH3 R1 CH3
H3C Si O Si O Si CH3 R1, R2 = cualquier
radical orgánico
CH3 R2 CH3
n

- Ligando Si-O extremamente estable = elevada

estabilidad térmica y química de las FE.

- Siliconas son fabricadas a gran escala para diversas

aplicaciones = minimización del costo del produto +
tecnologia de producción y purificación largamente
estudiada y conocida.

- Praticamente cualquier radical orgánico o inorgánico

puede ser ligado a la cadena polimérica = FE
“ajustables” a separaciones específicas + facilidad de
inmovilización por entrecruzamiento y unión química a
soportes
 Fase Nombre Tª máxima
estacionaria comercial (oC)

Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30 350

Fenil-polidimetilsiloxano 5% OV-3, SE-52 350

Fenil-polidimetilsiloxano 50% OV-17 250

Trifluoropropil-polidimetil- OV-210 200

Siloxano 50%

Polietilenglicol Carbowax 20M 250

Cianopropil-polidimetil- OV-275 240

Siloxano 50%

(El % señalado en
- Polar (OV-1) cada uno de los casos
representa el grado
de sustitución de los
grupos metilo del
esqueleto de
Polisiloxano por un
+ Polar (OV-275) determinado grupo
funcional)
 INSTRUMENTACIÓN
Detectores
Dispositivos que examinan continuamente el
material eluido, generando una señal eléctrica
proporcional a la banda de elución

Gráfico Señal vsTiempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substancia separada aparece
como un PICO en el cromatograma.
 INSTRUMENTACIÓN
Detectores
● Características de un detector ideal:

- Sensibilidad adecuada: en general, las

sensibilidades de los detectores actuales
se encuentran en el intervalo de 10-8 a
10-15 g de soluto / s.

- Buena reproducibilidad

- Respuesta lineal para los solutos que se

extienda a varios órdenes de magnitud.

- Gran intervalo de temperaturas

- Manejo sencillo

- Respuesta semejante para todos los solutos,

o, por el contrario, respuesta selectiva para
determinado tipo de solutos.

- No debería destruir la muestra

 INSTRUMENTACIÓN
Detectores
Más Importantes:
DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA (FID)
Iones generados durante la quema de los
eluyentes en una llama de H2 + Aire
DETECTOR DE CAPTURA ELECTRÓNICA
(DCE) Supresión de la corriente causada
por la absorción de electrones por
eluyentes altamente eletrofílicos.
DETECTOR DE NITRÓGENO-FÓSFORO (NPD).
Producción de iones a partir de las
moléculas de N y P.
DETECTOR FOTOMÉTRICO DE LLAMA
(FPD).Sensible a los compuestos
azufrados y fosforados.
ANALÓGICO
REGISTRO Registradores XY
DE DIGITAL
SEÑAL Integradores
Ordenadores
DETECTORES
Clasificación

UNIVERSALES:
Generan una señal para
cualquier
substancia eluida.

SELECTIVOS:
Detectan substancias
con determinadas propiedades
físico-químicas.

ESPECÍFICOS:
Detectan substancias que
poseen determinado elemento
o grupo funcional en sus
estruturas
 DETECTORES
Detector de ionización de llama
PRINCIPIO Formación de iones cuando un
compuesto es quemado en una llama de hidrógeno y
oxigeno

El efluente de la columna es
mezclado con H2 y O2 y
quemado. Como en una llama
de H2 + O2 no existen iones,
no se produce conducción de
la corriente elétrica

Cuando un compuesto
orgánico eluye, él también es
quemado. En su quema se
producen iones (e-) que
conducen la corriente
eléctrica
 DETECTORES
Detector de ionización de llama
COLECTOR

AIRE
LLAMA

H2

COLUMNA

Se aplica una diferencia de

potencial elétrico entre la llama
y el colector - cuando se forman
íones en la llama se produce un
flujo de la corriente eléctrica:
 DETECTORES
Detector de ionización de llama
SELECTIVIDAD Seletivo para substancias que
contienen enlaces C-H en su estructura química.
(como virtualmente todas las substancias analizables por CG son
orgánicas, en la prática se le llama Detector UNIVERSAL)

Compuestos que NO producen respuesta en FID:

Gases nobles NH3, NxOy

H2, O2, N2 SiX4 (X = halogeno)
CO, CO2, CS2 H2O
CCl4, peralogenados

VARIACIONES EN LOS VALORES DE AIRE E H2

AFECTAN MARGINALMENTE A LA SEÑAL =
MAYORES REPRODUCIBILIDADES Y
REPETIBILIDADES
 FAST – GC
(Cromatografía de gases de
alta velocidad)

Objetivo: aumentar la velocidad de análisis

¿Cómo disminuir el tiempo de análisis en GC?

- Acortando la columna
- Aumentando la velocidad de la fase móvil
- Reduciendo el espesor de fase estacionaria
- Reduciendo la viscosidad de la fase móvil
- Aumentando el diámetro de columna
- Calentando la columna más rápidamente

¡Compromiso!: ¿qué es capaz de sacrificar el analista a costa de recortar

el tiempo de análisis?

Tiempos en análisis rutinarios: 20 – 50 mins.

 FAST – GC
(Cromatografía de gases de
alta velocidad)

Idea: para muchas de las separaciones de

interés la alta velocidad se puede lograr
aunque sea a expensas de la selectividad
y la resolución.

Kn: factor de retención

para el último
componente de interés
en el cromatograma

La ecuación dice que es posible lograr separa-

ciones más rápidas con columnas cortas, velo-
cidades de fase móvil superiores a las comunes
y factores de retención pequeños.
 Columnas de Fast-GC tienen:

- Menores diámetros internos que una columna

capilar convencional.
- Longitudes de columna más cortas.
- Menores espesores de fase estacionaria.

Convencional:
(30 m x 0,25 mm id x 0,25 μm ft)
Poder de
separación
Fast GC:
(10 m x 0,1 mm id x 0,1 μm ft)
Descenso en el diámetro interno y menores
espesores de fase estacionaria

Menor resistencia a la transferencia de masa

en la fase estacionaria

Cs en la Ec. de Golay es despreciable

 Fast-GC: empleo de tiempos de análisis más
cortos para separar los mismos compuestos
que los empleados en un análisis de GC previo
(Wiegan et al. (1996). “Fast Gas Chromatography
Method. Apparatus and Applications”.
U.S. Patent 5.589.630.3)

En el análisis de alimentos, el empleo de

columnas standard (25-30 m x 0.25 mm id x 0.25 um ft)

desventaja

Tiempos de análisis de 0.5 – 1.5 h

 uopt en Fast GC

Fast GC mayores velocidades

de fase móvil

Columna uopt (cm/s)

25 m x 0.25 mm x 0.25 um 35 – 40

10 m x 0.1 mm x 0.1 um 55-60 / 65-70

Desventaja de la Fast-GC

Baja capacidad de muestra

• Acoplamiento GC-MS:
Separación + identificación mezclas complejas

Ambos trabajan en fase gaseosa y requieren poca cantidad de

muestra
El efluente emerge de la columna a Patm y se conduce al EM
que trabaja a alto vacío. Acoplamiento directo (columnas
capilares; flujos 1-2 mL/min).
El masas actúa como detector al registrar la corriente iónica total
generada en la fuente iónica, representación gráfica es el
cromatograma o TIC (Total Ion Current). Cuando una sustancia
llega a la fuente de ionización se producen abundantes iones que
son expulsados y dirigidos al analizador. La corriente iónica así
generada producirá un pico gaussiano de altura proporcional a la
concentración máxima y cuya área será una medida de la
cantidad total del compuesto detectado.
Sensibilidad óptima: toda la muestra entra en el masas, la
columna se introduce hasta la fuente iónica a través de una línea
de transferencia calentada para evitar condensaciones
•GC-MS sobremesa:
-rango masas (hasta 600-1000uma)
-fuente EI
-analizador cuadrupolar o ITD
-sistema de bombeo: turbomolecular + bomba mecánica o
rotatoria
Gas portador: He (químicamente inerte, no interfiere con el
espectro de la muestra, fácilmente eliminable)

Velocidad de adquisición en GC-MS:

w pico: 2 s; para espectro representativo: 10 espectros/2 s
(barrido cada 0.2 s); cada 0.2 s hacemos un barrido de 500
uma
Velocidades de adquisición de 25-400kHz (1Hz= 1 s-1)
Si trabajamos con velocidades de barrido inferiores no se
puede reconstruir el pico real

• SIM: Monitorización selectiva de iones

Permite identificar el pico cromatográfico cuyo espectro de
masas contiene los fragmentos seleccionados
Mayor rapidez y sensibilidad
Barrido convencional (SCAN): el tiempo dedicado a la
detección de cada pico es una pequeña fracción del
tiempo total de barrido
1000 unidades masa; barrido 1 s; Rs=1: fragmentos Mx se
detectan durante 1 ms, el resto del tiempo el equipo está
enfocando otras masas, aunque siguen produciéndose
iones Mx en la fuente, no llegan al detector porque son
desviados de su trayectoria
SIM: se reparte todo el tiempo disponible para el barrido
entre varios iones seleccionados, sólo se enfocan las
masas elegidas (mayor sensibilidad)
Aplicaciones GC/MS:

-análisis aromas: más de 5000 compuestos identificados

en alimentos
- frutas
- café
- inyección directa HS
- problemas método extracción compuestos
volátiles del aroma (extracción con
disolventes, destilación, etc.), posibilidad de
acoplamiento SFE/GC aroma especias, frutas,
etc.

0 3 6 9 12 15 18

-análisis lípidos: ácidos grasos, etc. que pueden analizarse

por GC/MS después de derivatizar (sililación, metilación)
-análisis carbohidratos (después metilación)