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Reproduccion Asistida Tecnicas PDF
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TÉCNICAS
Cada una de las causas que alteran el proceso reproductivo tiene un tratamiento concreto. El
aplicado en cada ocasión depende de los resultados de una serie de estudios previos de cada
paciente. En función de estos resultados, se dispone en la actualidad de diversos tratamientos de
mayor o menor complejidad.
Estas técnicas existen gracias a los avances técnicos que se han producido en este campo en los
últimos 40 años. Han nacido, crecido y evolucionado de la mano de las nuevas tecnologías, con
la visión y misión de intentar solventar el amplio abanico de causas que llevan a la infertilidad a
una pareja. Gracias a ellas, las posibilidades de éxito en su tratamiento, han crecido muy
considerablemente.
Los procedimientos seguidos con este tipo de técnicas se llevan a cabo en laboratorios
especializados, donde los óvulos y/o espermatozoides son tratados para mejorar su capacidad
fecundante y los embriones obtenidos, se cultivan para mejorar su capacidad de implantación.
Todas las técnicas de reproducción asistida comparten alguno de sus pasos. Sólo difieren en el
método de laboratorio a utilizar y en el momento y lugar de la transferencia de gametos y o
embriones.
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INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
Para poder desarrollarla con éxito es indispensable que las trompas de Falopio estén en buen
estado, y que después de preparar el semen para inseminar, haya un mínimo de 3 a 5 millones de
espermatozoides móviles.
Procedimiento
ESTIMULACIÓN OVÁRICA
La FSH es la principal hormona responsable del desarrollo de los folículos, mientras que
la LH es responsable de la maduración final y posterior ovulación del óvulo y la
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El tratamiento se inicia en los cinco primeros días del ciclo. En primer lugar se confirma
mediante ecografía que los ovarios se encuentran en situación basal, que no haya
folículos mayores de 10 mm.
El tamaño del folículo es un indicativo del estado de maduración del óvulo. Cuando 2 ó
3 folículos han llegado al tamaño deseado (entre 18 y 22 mm de diámetro), se induce la
ovulación. La hormona LH normalmente es muy difícil de purificar. A falta de su
versión recombinante se utiliza la HCG (hormona gonadotrópica coriónica), que es
responsable de los últimos estadios de maduración del óvulo y hace la función del pico
espontáneo de LH, para desencadenar la ovulación. Ésta se produce entre 36 y 40 horas
después de la administración de la HCG.
CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA
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Así pues, para los procesos de IA o FIV es necesario “reproducir” previamente esta
capacitación “in vitro” para que se produzca la fertilización del óvulo. Los primeros en
reportar que el espermatozoide maduro puede ser capacitado “in vitro” fueron
Yanagimachi y Chang en 1963.
Consiste en una serie de lavados que eliminan los restos celulares, bacterias, leucocitos,
espermatozoides muertos y lentos, secreciones seminales del eyaculado, y a su vez
permiten concentrar y mejorar el semen seleccionando la población de espermatozoides
de mejor calidad, más fértiles.
Swim-up: en este método se efectúa inicialmente uno o dos lavados del eyaculado (con
Ham F-10), se decanta o centrífuga (300-600g), y se descarta el sobrenadante. Al pellet
del fondo del tubo, donde está todo el concentrado de espermatozoides, se le añade de
0.3 a 0.5 ml del medio de cultivo procurando que resbale por la pared del tubo, para
evitar que se formen burbujas. El tubo, inclinado unos 45º, se deja incubar durante unos
45 minutos-1hora a 37°C / 5% CO2. Los espermatozoides capacitados “nadan” hacia
arriba (swim-up) hacia el sobrenadante, que es la fracción que se recupera para la IA o la
FIV. La desventaja de este método es la baja recuperación espermática.
Self-Migration: es una variante del anterior, fue descrito por Wikland. La separación de
los espermatozoides es por una migración espermática. Se coloca el semen en el extremo
ciego de una pipeta Pasteur o en tubos de centrífuga y se añade una capa del medio
cultivo sin que se mezclen. Éste, tras incubación a 37º / 5% CO2, 45min-1hora, va a
contener los espermatozoides de mejor calidad que han migrado desde el semen. La
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Se utilizan unos tubos especiales con dos cámaras concéntricas, la central cónica de
mayor profundidad, y una externa, concéntrica a la anterior, a modo de galería.
El eyaculado se deja licuar 30-60 min a temperatura ambiente. El tubo cónico interior del
la cámara de migración y la cámara que lo rodea se llena con medio de cultivo. Se añade
con cuidado el semen al fondo del tubo exterior, y se deja incubar el conjunto a 37ºC /
5% CO2. Los espermatozoides nadan desde la parte superior, de la galería al medio de
cultivo sobrenadante, y sedimentan en la parte cónica inferior tras un tiempo de
incubación de aproximadamente 1 hora. A continuación se recoge el esperma del fondo
del tubo cónico interior que es el que se utilizará para las técnicas de reproducción
asistida.
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Filtrado en fibra de vidrio: Se basa en la capacidad del material para retener los
espermatozoides muertos o con defectos, solo los móviles pueden pasar a través de la
fibra y no quedarse atrapados durante el proceso de filtración.
Se prepara un stock de Percoll isotónico y se hacen diluciones para obtener los diferentes
gradientes, normalmente 45/90%. En un tubo cónico se depositan consecutivamente e
intentando mantener la interfase, la solución al 90%, al 45% y finalmente la muestra de
semen. Tras centrifugar la muestra (300g, 15 o 20 minutos) se recupera el pellet del
fondo del tubo que contiene los espermatozoides, que finalmente se lava por dos veces y
se resuspende en medio de cultivo para su utilización.
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3. La inseminación
Una vez capacitada la muestra se procede a introducir mediante una cánula los espermatozoides
dentro del cuello uterino. Se realiza en modo ambulatorio, en las consultas, no es preciso
administrar anestesia.
La IA se debe programar de manera que el esperma esté presente en el momento en que produce
la ovulación y se pueda producir la fecundación en las trompas de Falopio. La inseminación se
suele realizar durante dos días seguidos tras haber inducido la ovulación.
4. Tratamientos de soporte
Indicaciones
Puede realizarse con el semen de la pareja (I.A.C.: inseminación artificial conyugal) o bien con
semen de donante anónimo (I.A.D.: inseminación artificial con semen de un donante)
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La mayor parte de los casos de esterilidad masculina tienen una posible resolución. Aún así hay
ocasiones en que es necesario recurrir a un banco de semen.
BANCO DE SEMEN
Estas muestras proceden tanto de pacientes de las clínicas de reproducción asistida como
de donantes anónimos.
Habitualmente, los donantes son sometidos a una serie de pruebas para garantizar la
calidad del semen, además de un estudio de los antecedentes familiares de enfermedades
hereditarias o congénitas. Se hacen en muchos centros estudios citogenéticos, que
incluyen un estudio de cariotipo y análisis cromosómicos.
La IAD está indicada en casos de fallo testicular severo, con ausencia de espermatozoides tanto
en eyaculado como directamente en testículo o epidídimo, o de un semen con una tasa muy
elevada de DNA fragmentado. También en aquellas ocasiones en que haya la posibilidad de
transmisión de algún trastorno hereditario genético o alguna enfermedad contagiosa del
cónyuge, y las inseminaciones en el caso de mujeres sin pareja.
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Hasta hace poco tiempo, había que recurrir a la IAC en casos en que la pareja fuera portadora de
la Hepatitis C o del VIH. Actualmente ya existen técnicas que permiten limpiar este semen de
partículas virales y que pueda ser utilizado sin peligro de infección para la mujer o a la
descendencia futura.
En estos casos el objetivo de la técnica consiste en eliminar las partículas virales (VIH o
Hepatitis C) que existen en el semen. Esto se consigue con una combinación de Swim-
Up y Gradientes de densidad.
Una vez comprobada la ausencia de virus por PCR, la alícuota congelada, se utiliza
normalmente en la técnica de reproducción asistida que corresponda, FIV o IA
Según la legislación vigente, las parejas en que el varón es seropositivo, necesitan formar
parte de un ensayo clínico con un protocolo previamente aprobado por las autoridades
sanitarias, para poder someterse a tratamientos de reproducción asistida.
FECUNDACION IN VITRO
La fecundación o fertilización in vitro (FIV) es uno de los métodos más utilizados entre las
técnicas de reproducción asistida y una de las mejores opciones para el tratamiento de la
infertilidad.
De esta manera se pretende favorecer la fecundación cuando existe algún problema que la
dificulta y conseguir lo que en condiciones espontáneas no se hubiera producido o al menos
hubiera sido muy difícil. Normalmente esta técnica es un punto convergente donde se llega
después de no haber obtenido éxito reproductivo con técnicas más sencillas
La unión de los gametos se realiza en el laboratorio, fuera del cuerpo de la mujer, así que en
primer lugar son necesarias técnicas para obtener, preparar adecuadamente y mantener ovocitos
y espermatozoides viables para la fecundación. Posteriormente técnicas para que se lleve a cabo
la fertilización de los óvulos in vitro y así obtener uno o varios embriones. Finalmente aquellos
procedimientos que permitan y faciliten la transferencia de estos embriones a la cavidad uterina
y su posterior implantación, o bien su congelación / descongelación para su uso posterior.
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Procedimiento
1. Estimulación ovárica
SUPRESIÓN HIPOFISIARIA.
La recuperación de los óvulos se efectúa mediante una punción tras la identificación de los
folículos maduros. Se realiza bajo sedación por vía transvaginal y guiada con ecografía,
utilizando una guía con una aguja especial, que punciona y aspira el fluido que se encuentra en
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el interior del folículo. Esta operación se repite con todos los folículos aunque no
necesariamente se recuperan óvulos de todos.
Después de la punción los fluidos foliculares se observan al microscopio para identificar los
óvulos y clasificarlos según su aspecto, morfología y grado de madurez.
En la FIV convencional, tras este paso los ovocitos se lavan, se transfieren a medio de cultivo y
se mantienen en el incubador de CO2 al 5% y a 37ºC hasta el momento de la inseminación.
En el caso de la ICSI, tras la aspiración folicular los ovocitos son denudados: se les quitan las
células de la granulosa que rodean su envoltorio (la zona pelúcida). Se tiene que limpiar de
células para poder realizar la microinyección. Es un proceso químico / mecánico en que puede
perderse algún ovocito.
Ambas técnicas, (FIV clásica e ICSI) sólo se pueden realizar en los ovocitos que presenten una
maduración correcta, que se encuentren en estadío de Metafase II, momento en que están en un
estado óptimo para ser fecundados. Estos ovocitos maduros o preovulatorios son los únicos que
tienen capacidad de fecundar y dar lugar a embriones. Cuando existen dificultades para la
obtención de suficientes ovocitos maduros para la FIV o ICSI, se puede recurrir a un programa
de donación de ovocitos, o bien en algunos casos puede aplicarse una técnica novedosa, la
maduración in vitro de ovocitos (MIV). En Junio de 2006 ha nacido en España el primer bebe a
partir de un ovocito madurado in Vitro.
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en numero suficiente para una FIV-TE efectiva. Es el caso del síndrome de ovario
poliquístico (PCOS).
Lo atractivo de esta técnica es que no hay tratamientos hormonales, con lo que el menor
coste, agresividad y duración del simplifican la FIV convencional. En contrapunto las
tasas de embarazo disminuyen, y de momento no se ha conseguido una eficacia
comparable a la FIV con estimulación, aunque existen estudios que demuestran el éxito
de la técnica: Obstetric outcome of patients with polycystic ovary syndrome treated by in
vitro maturation and in vitro fertilization-embryo transfer.
DONACIÓN DE OVOCITOS
Para que esto sea posible los ciclos ováricos de la donante y la receptora deben estar
sincronizados.
La donante recibe inducción del desarrollo folicular y recogida de óvulos según los
protocolos habituales.
Obtenidos los ovocitos de las donantes e realiza una u otra técnica de Reproducción
Asistida dependiendo de la características seminales.
Está indicado en mujeres de mayor redad, que presenten fallo ovárico primario o precoz
u ovarios inaccesibles, con menopausia prematura o quirúrgica, que sean portadoras de
una alteración genética, que les hayan fallado repetidamente ciclos de FIV o hayan
presentado pérdidas de embarazos inexplicadas y repetidas
3. Fertilización
Una vez obtenidos los ovocitos, se requiere una muestra de semen, previamente lavado y en
condiciones de capacitación.
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En una placa de cultivo se preparan varias microgotas, en las cuales se colocan los
espermatozoides a una concentración adecuada y un óvulo. Esta placa se deja en el incubador,
en condiciones similares a las fisiológicas, es decir, 37º C, con una concentración del 5% de
CO2 y elevada humedad relativa (95%) y de este modo, en unas horas, uno de los
espermatozoides penetrará en el óvulo, produciendo la fertilización.
Acabada esta inyección espermática los ovocitos inyectados se dejan en el incubador a 37º C y
6% de CO2.
En ambas técnicas, después de unas 16-18 horas, los óvulos son examinados para determinar la
presencia de fecundación. Mediante un microscopio invertido se observa la presencia de
pronúcleos, que en los ovocitos fecundados correctamente deben ser dos, correspondientes al
masculino y el femenino.
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Los ovocitos que son fecundados con éxito inician la división celular, exactamente igual que lo
harían en el interior de la trompa y del útero y se transformarán en embriones.
La transferencia uterina es la más común en FIV, tiene lugar en condiciones de asepsia, por vía
transcervical. Se efectúa de forma ambulatoria sin necesidad de anestesia, portando los
embriones en un catéter blando que se introduce por el cuello del útero con el fin de depositarlos
en la cavidad uterina.
También se puede realizar la transferencia de estos embriones de 2-3 días (TET) o de zigotos
(ZIFT), preembriones de sólo 24 horas post punción, a las trompas de Falopio. Se realiza en
ambos casos mediante una laparoscopia intratubárica. Estas técnicas se reservan para
indicaciones muy precisas, como podría ser la conglutinación cervical que hace imposible la
canalización del útero para llegar a la cavidad uterina, pero sólo se pueden usar si las trompas de
Falopio están sanas.
El momento de la transferencia de los embriones al útero materno se decide para cada caso
concreto en función de las características especiales de cada paciente y las de los embriones
obtenidos. Los embriólogos aconsejan el momento más adecuado de transferencia, que oscila
normalmente entre el segundo y sexto día después de la obtención y fecundación de los
ovocitos. Lo habitual es 2 o 3 días después de la recuperación de los óvulos (embriones de 2-4
células o en 6-8 células respectivamente).
Hay casos en que la implantación de los embriones cultivados únicamente durante 2-3 días, no
es exitosa, aunque los embriones transferidos estén en buen estado. Son ocasiones en que la
transferencia de los embriones se tiene que realizar en un momento más avanzado del cultivo, en
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que el embrión está en estadio de blastocisto. En esos casos es necesaria una nueva técnica, el
co-cultivo embrionario.
COCULTIVO EMBRIONARIO
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Se transfiere un número menor 1-2 ya que tienen mayor capacidad de implantación. Esto
evita las gestaciones múltiples.
Otra posible estrategia a seguir cuando no se consigue la implantación del embrión, aunque los
embriones transferidos estén en buen estado, es la eclosión asistida (Assisted Hatching)
ECLOSIÓN ASISTIDA (ASSISTED HATCHING)
Esto sucede una vez que el embrión está en la cavidad uterina adelgazando su zona
pelúcida gradualmente y ayudado por sustancias producidas por él mismo.
Hay evidencias de que en algunos casos algunos embriones, y debido a diferentes causas
pueden carecer de la habilidad para adelgazar y desprenderse de la zona pelúcida y esta
eclosión no se produce de forma natural.
Para solucionar este problema se diseño esta técnica de eclosión asistida. Se le realiza al
embrión un pequeño orificio en la zona pelúcida previamente a su transferencia, a fin de
facilitar así su desprendimiento y la consecuente implantación.
Esta técnica se recomienda en casos en los que se han producido fallos de implantación,
en el caso de que el embrión tenga la zona pelúcida engrosada o en los que la edad de la
paciente es elevada.
Se denomina fase lútea a la etapa del ciclo menstrual posterior a la ovulación. En esta etapa se
mantiene el cuerpo lúteo produciendo progesterona, que es la hormona encargada de preparar el
endometrio (capa interna del útero) para recibir al embrión.
En las pacientes que recibieron el análogo de GnRH como tratamiento de supresión hipofisiaria
en la fase de estimulación folicular, los niveles de progesterona suelen ser bajos, y necesario
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incrementarlos. Para ello se puede administrar la HCG (hormona gonadotrópica coriónica, que
mantiene el cuerpo lúteo produciendo progesterona) o directamente la progesterona por vía oral
o vaginal.
Sólo queda esperar entre 14 a 17 días postransferencia para realizar la prueba de embarazo en
sangre o en orina.
6. Criopreservación de embriones
A medida que aumenta la eficacia de las técnicas de FIV, es más frecuente que haya embriones
excedentes. Si son de muy buena calidad y pueden cumplir con los protocolos de
criopreservación, se congelan para ser utilizados más adelante en el caso de que no se produzca
la gestación. La Ley de Reproducción Asistida, determina el tiempo máximo que unos
embriones pueden ser guardados en estas condiciones es de cinco años.
La criopreservación que consiste en mantener los embriones a muy bajas temperaturas, con
nitrógeno líquido a -196º C, por lo que todas las funciones celulares se detienen pudiendo
conservarse en este estado durante muchos años.
En cualquier caso, las ventajas de la criopreservación son varias: permite contar con una
alternativa para los embriones que no se desean transferir a fin de evitar el riesgo del embarazo
múltiple, y además permite incrementar las tasas de embarazo del procedimiento ya que se
pueden transferir a la pareja si es necesario en un futuro sin necesitad de repetir todos los ciclos
previos, bastan unas dosis de progesterona y una serie de controles ecográficos. Además se
disminuyen costos y riesgos.
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Pero en realidad, donde está técnica está suponiendo una verdadera revolución es en los
procesos de congelación – descongelación de ovocitos. Las tasas de recuperación de este
método hacen que actualmente sea una alternativa real a la congelación de embriones.
El inconveniente es que aparecen los excedentes de embriones congelados, con los problemas
éticos que el tema ha conllevado, y tampoco era una solución para aquellas pacientes que
querían preservar su fertilidad, y tenían riesgo de perderla (por la edad o a tratamientos
agresivos de quimio y radioterapia) la única opción efectiva era recurrir a la donación de
ovocitos.
CONGELACIÓN DE OVOCITOS
En algunos países está prohibido congelar los óvulos, y es bastante raro que se empleen
óvulos descongelados en las técnicas de reproducción asistida. Desde El primer
nacimiento a nivel mundial de un bebé a partir de óvulo congelado lo logró el Dr. Cheng
en Corea en 1986 hay menos de 150 de niños nacidos por este método.
Con el desarrollo del a técnica de vitrificación para ovocitos (Dr. Masashige Kuwayama
Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The
Cryotop method.) este panorama ha cambiado totalmente.
Este nuevo método, conocido como Cryo-top, lleva a cabo una congelación ultrarrápida
(desciende 23.000ºC/min) en una cantidad minúscula (<0.1ul) de una solución de
vitrificación especial, antes del almacenamiento en N2. Previene la formación de
cristales con lo cual se preserva la estructura del óvulo.
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Con estos resultados exitosos pueden llegar a crearse bancos de ovocitos, de igual
manera que ya existen los bancos de semen.
Esta técnica se aconseja como tratamiento para parejas con distintos tipos de esterilidad, ya sea
de origen femenino o masculino aunque fue desarrollada inicialmente para el tratamiento de la
infertilidad causada por obstrucción de las trompas. Sin embargo, a lo largo del tiempo, las
indicaciones fueron ampliándose e incorporando todos aquellos casos en los que existe
dificultad en el encuentro entre los espermatozoides y el óvulo. Actualmente está indicada en los
siguientes casos:
La ICSI, a diferencia de la FIV, requiere sólo un espermatozoide para cada óvulo. Con esta
técnica se pueden beneficiar casi todos los hombres con infertilidad grave, ya que Sólo es
necesario un espermatozoide vivo para cada ovocito. Está indicado en los siguientes casos:
Factor masculino severo.
Azoospermias
Alteración de membrana ovocitaria.
Fallo en ciclos de fecundación en FIV convencional.
Presencia de elevados títulos de anticuerpos antiespermáticos
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Suelen ser procedimientos de bajo riesgo. Las complicaciones más comúnmente observadas son:
- la hiperestimulación ovárica, que pueden ser controlable según la estimulación efectuada
- los embarazos múltiples, se controlan por el número de embriones a transferir. Hay
aproximadamente un 30% de embarazos gemelares.
- el embarazo ectópico, el aborto espontáneo y aquellos originados por la punción, que
dependen de factores no modificables por la técnica.
La GIFT fue desarrollada unos pocos años después de la FIV, el primer embarazo conseguido
con esta técnica fue publicado en 1984.
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Procedimiento
En la GIFT comienza con los dos mismos pasos que la FIV: inducción de la ovulación y
recuperación de óvulos. Una vez obtenidos los óvulos y los espermatozoides del hombre (ya
obtenidos y preparados previamente) se colocan en un pequeño catéter, sin que entren en
contacto, separados por una pequeña burbuja de aire. Se colocan inmediatamente en las trompas
de Falopio de la mujer mediante una laparoscopia que debe ser realizada bajo anestesia general.
La fertilización se produce de forma natura len el cuerpo del a mujer.
No hay manera de verificar que la fertilización ha tenido lugar, ya que ocurre in vivo. Si la
fertilización tiene éxito, el óvulo viaja al útero, exactamente igual que en un ciclo natural.
Indicaciones:
Aquellas mujeres jóvenes que experimentan infertilidad sin causa aparente, problemas
cervicales o endometriosis leve, o que tengan creencias religiosas que prohíben la fertilización
fuera del cuerpo.
Entre las técnicas más utilizadas destacan Hibridación in situ Fluorescente (FISH), PCR y
posterior análisis de los fragmentos amplificados.
La necesidad de trabajar con el escaso material genético que aporta una única (a lo sumo dos)
célula además del hecho de tener que analizar en una misma muestra cuantas más de estas
alteraciones mejor, lo que implica el uso de múltiples sondas con diferentes fluoroforos, hacen
que el trabajo del biólogo molecular deba ser muy eficaz, tanto en la extracción de DNA,
manipulación, diseño de sondas,etc.
Procedimiento
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La biopsia de una o dos células del embrión se hace antes del cuarto día de desarrollo cuando
éstas se encuentran en un estadio totipotencial por lo que no afectará al desarrollo posterior del
embrión.
La biopsia embrionaria puede disminuir ligeramente la implantación del embrión mientras que
la selección de embriones cromosómicamente normales puede incrementarla. La biopsia de uno
o dos blastómeros se puede comparar a la pérdida celular que sufren algunos embriones después
de la congelación y que, tras ser transferidos, dan lugar a embarazos evolutivos.
El balance entre el posible daño en la biopsia y los efectos beneficiosos del DGP parece
decantarse a favor de la realización de este.
FISH
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Para el primer caso los cebadores u oligos de la PCR se marcan con fluoroforos de
distinta longitud de onda. Tantos como distintos genes queramos identificar. En el
secuenciador se puede discriminar el tamaño de los amplicones incluso en diferencias de
un solo nucleótido y determinar su susceptibilidad de ser un gen anormal.
Para el caso de Real Time también existen sondas específicas que también son capaces
de discriminar estas diferencias en este tipo de genes.
Llegados a este punto tenemos que considerar que aunque estamos hablando de
enfermedades monogenéticas, la mayoría no son en realidad tales, sino que son debidas a
muchos de ellos, pero se estudian loci concretos que responden a altos porcentajes de incidencia
en la población. Como ejemplos, en el caso de la Fibrosis Quística se suele estudiar el gen
CFTR*602421 o para la Enfermedad Charcot-Marie-Tooth el gen MPZ *159440.
También se suele hacer un estudio genético familiar que permita localizar la presencia de estos
genes anormales mediante el estudio de marcadores asociados (Microsatélites) a partir del
historial de cada uno de los miembros, padres y hermanos en lugar de analizar directamente el
gen implicado
Por último, cabe la posibilidad de seleccionar embriones que sean compatibles genéticamente
con un hermano ya nacido que tiene una enfermedad o necesidad de transplante de un donante
compatible. Es lo que se conoce como Hermanos Salvadores o “Savior Siblings”. Este supuesto,
de implicaciones éticas, ya se contempla en la legislación española para ciertos supuestos.
Destacar por último que estas técnicas se están aplicando también al Diagnostico PRENATAL,
a partir del material genético obtenido mediante amniocentesis .
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