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Protocolo SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins and

Western Blot

Aspectos Previos:

i. Lavar los vidrios con agua corriente y detergente, cepillando siempre en el mismo
sentido. Enjuagar con abundante agua corriente y repetir al menos dos veces,
asegurándose de que los vidrios se encuentren perfectamente limpios. Enjuagar con
agua destilada y secar.

ii. Limpiar la peineta y los espaciadores con alcohol

iii. Limpiar los vidrios con alcohol 96%, agregando el alcohol y dejándolo evaporar (no
secar con papel).

Electroforesis

1. Armar vidrios en cámara Bio-Rad, según las indicaciones del fabricante, cuando los
vidrios estén armados llenar con agua para ver posibles filtraciones (se puede poner
una punta azul en el sujetador de la cámara para presionar con mas fuerza).

2. Preparar el gel resolutivo de acuerdo a las indicaciones del Molecular Probe 18.5v3.

3. Luego añadir 500 l (aprox) de isopropanol para evitar que se seque el gel ademas
de poder observar las 2 fases y evidenciar la gelificación del gel.

4. Una vez gelidificado, se descarta el isopropanol y se procede a lavar con agua


destilada al menos 2 veces para limpiar todo el alcohol. Luego se añade el gel
concentrador con la peineta correspondiente.

5. Una vez gelificado se instala en cámara de corrida Bio-Rad con Buffer de corrida. La
peineta debe ser retirada del gel despacio y en húmedo.

*Los geles pueden guardarse uno o dos días con la peineta puesta, envueltos en
papel NOVA humedecido y a 4°C

6. Se cargan las Muestras volumen final ideal 20 l por cada carril


(Muestra+agua+buffer de carga 5X). Importante cargar también 4 uL del marcador de
peso molecular. (los pocillos de 15 wells alcanzan 30uL totales, si se requiere cargar
mas volumen se recomienda dejar correr el gel hasta que sea posible agregar mas
volumen)

7. Se corre a 80 v (Voltaje constante) durante el gel concentrador y luego a 100 v en el


gel resolutivo (2.5 h aproximadamente).

8. Cuando el frente de corrida llega al limite del gel se detiene la corrida, se retira el gel
y se prepara para la transferencia (el gel se saca de los vidrios y se deja sumergido
en buffer de transferencia).
Transferencia

9. Luego de separar las muestras mediante electroforesis, se retiran los vidrios, se


remueve el stacking con mucho cuidado quedando el gel de poliacrilamida donde
migraron las muestras.

10. Previo a la transferencia la membrana de PVDF debe ser activada en metanol por 7
min, luego se limpia en metanol con agua y finalmente se deja en buffer de
transferencia:

11. Luego se realiza la transferencia que se puede llevar a cabo en el sistema clásico (2h
a 350 mAmp, 4ºC) o en la cámara semi seca (70 min a 1,25 mAmp, para 4
membranas; en esta cámara hay que mantener A constante en 1,25, luego fijar el
voltaje en 25 y transferir (NO puede pasar 25 V porque se quema la cámara de
transferencia).

Revelado

12. Luego la membrana se seca a temperatura ambiente y se re-activa con metanol


100% 5 min, se lava con agua bd, luego se añade rojo Ponceau para ver la carga de
los geles, en este punto se corta la Membrana según los anticuerpos que se
analicen.

13. Lavar rápidamente con PBS 1X y luego por 5 minutos con Buffer PBS-Tween 0.05%
(PBS-Tw) o para eliminar el rojo de la membrana y luego se procede a bloquear la
membrana incubándola con PBS-leche/BSA 5% durante 1 h a temperatura ambiente.

14. Incubación anticuerpo primario diluido en PBS-Leche/BSA 5% toda la noche a 4ºC*

15. Se retira el Anticuerpo (se recicla a -20ºC) y se realizan lavados con PBS-Tween (3
lavados de 5 minutos)

16. Bloquear nuevamente incubando la membrana con PBS-leche/BSA 5% durante 10


minutos y luego lavar brevemente con PBS 1X.

17. Incubar con el anticuerpo secundario durante 1h a temperatura ambiente, luego se


lavan las membranas 3 veces con PBS-Tween (3 lavados de 15 minutos). Nota: se
puede usar Tween 20 al 0,1% para señales débiles con poco background.

18. Para el Revelado de las membranas se utiliza el Kit revelador. Se mezclan medidas
iguales de Solución A y Solución B para proceder a bañar la membrana
manualmente durante 3 minutos para luego ubicarla en el cassette de revelado.

19. Para reutilizar la membrana se puede realizar Stripping Suave (Para incubar con un
anticuerpo primario hecho en una especie distinta a la anterior) o Stripping Fuerte
(Para incubar con un anticuerpo primario hecho en una especie igual a la anterior)
Recetas

a) Buffer de Carga (500 mL): 25 mL Tris HCl (pH 6.8), 300 uL b-mercaptoetanol, 10g
SDS, 500 uL de azul de bromofenol, 50 mL de glicerol). Aforar con H2O destilada

b) B. Corrida 5X (1L): 15.1g Tris, 94 g Glicina, 50mL SDS 10%. Aforar con H2O
destilada

c) PBS 10X (1L): 80g NaCl, 27.2g Na2HPO4, 2.4g KH2PO4, 2g KCl. Ajustar pH 7.3-
7.4. Aforar con H2O destilada

d) PBS-tween 0,05% (1L): 100 mL PBS 10X, 500 uL de Tween. Aforar con H2O
destilada

e) B. Transferencia 10X (1L): 144 g Glicina, 30g Tris. Aforar con H2O destilada
*B.Transferencia Semi Seca (1L): 100 mL B.Transf 10X, 100mL Metanol. Aforar con
H2O destilada

f) Rojo Ponceau (1L): 1 g Ponceau-S, 50mL Acido acético. Aforar con H2O
destilada

g) Poli-acrilamida 30% (100mL): 29g Acrilamida, 1g bis-acrilamida. Aforar con H2O


destilada

h) Solución I. Strip. Suave (500mL): 3.75g Glicina, Ajustar a pH 12.5. Aforar con
H2O destilada

i) Solución II. Strip. Suave (500mL): 29.22g NaCl. Aforar con PBS-tween 0,1%

j) Inhibidores de fosfatasas:

- Na2P2O7 (5mL)(300X): 22.3 mg. Aforar con H2O destilada


- NaF (5mL)(20X): 209.9 mg. Aforar con H2O destilada
- Na3VO4 (5mL)(100X): 92 mg. Aforar con H2O destilada

*Los anticuerpos anti proteínas fosforiladas idealmente deben diluirse en BSA 5%


PBS1X y no en leche. Es recomendable primero incubar el fosforilado y luego el total
si se realiza en la misma membrana cuando existe poca muestra. Si hay muestra
suficiente, hacer el fosforilado en una membrana y el total en otra.