Ponce Contreras Daniela

Universidad del Bío-Bío.
Red de Bibliotecas - Chile
UNIVERSIDAD DEL BIO-BIO

FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO INGENIERIA CIVIL Y AMBIENTAL
Profesor Patrocinante : Carmen González L.
Profesor comisión : Ricardo Riveros V.
Cristian Chavarría M.
BIORREMEDIACION DE SUELOS
CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS
PROYECTO DE TITULO PRESENTADO EN CONFORMIDAD A LOS REQUISITOS

PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO CIVIL
DANIELA SOLEDAD PONCE CONTRERAS
CONCEPCIÓN, ENERO 2014

Universidad del Bío-Bío. Red de Bibliotecas - Chile
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero agradecer a Dios, por su infinito amor hacia mí, por bendecirme día
a día poniendo su mano para realizar todos mis sueños de la mejor forma posible. Espero
ser la profesional que él espera.
En segundo lugar, quiero agradecerles principal y fundamentalmente a mis padres, Daniel

Ponce y Gladys Contreras, me faltara vida para agradecer el hecho de siempre haber creído
en mí, en jugárselas por mi felicidad y bienestar. A mis hermanos, Christian, Rodrigo y
Rocío, por siempre animarme y darme una palabra de aliento cuando las cosas salían mal y
por alegrarse de mis triunfos. A Tomás, mi hijo querido, el motor que mueve mi vida y guía
mis pasos, por él hago esto, es la razón principal de todo mi esfuerzo. A Mauricio Rivera,
mi pololo y compañero de vida, ha sido fundamental en mi vida universitaria, gracias por
ayudarme siempre, por tu positivismo, por creer en mí, por tu paciencia y por ayudarme en
avanzar en mi proyecto de título a pesar de tu cansancio. Espero que me sigas
acompañando en mi vida.
En tercer lugar quiero agradecer a dos grandes amigos que hice en la universidad: a mi
mejor amigo, Cristian Romero, fuiste fundamental en mi vida universitaria, en los
momentos difíciles en que todo se ponía cuesta arriba lloramos juntos y reíste conmigo en
los momentos de victoria. Gracias por tu amistad incondicional y siempre estar dispuesto a
ayudar. A Omar Zurita, por su eterna amistad, por su alegría, por hacerme reír, por ser mi
eterno compañero de trabajos.
Y por último, a todos los buenos compañeros que hice durante mi vida estudiantil, cada uno
ayudó para que hoy sea una profesional, siempre los llevaré en mi corazón. Al personal del
Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, profesores y secretarias, se convirtieron en
una segunda familia.
“Estudiar, no para saber más, sino para servir mejor…” (Santo Domingo de Guzmán)
INDICE GENERAL
1. INTRODUCCION ........................................................................................................... 3
1.1 Contexto ........................................................................................................................ 3
1.2 Identificación y justificación del problema................................................................... 4
1.3 Alcances de la investigación ......................................................................................... 4
1.4 Objetivos de la investigación ........................................................................................ 5
1.4.1. Objetivo general. ................................................................................................... 5
1.4.2. Objetivos específicos. ............................................................................................ 5
2. REVISION BIBLIOGRAFICA. .................................................................................... 6
2.1 CONTAMINACIÓN DEL SUELO CON HIDROCARBUROS. ............................... 6
2.2 EL PETROLEO Y SUS HIDROCARBUROS .......................................................... 11
2.3 COMPOSICION POR FAMILIAS DE HIDROCARBUROS. (3) ............................. 12
3. METODOLOGIA.......................................................................................................... 16
3.1 BIORREMEDIACION .............................................................................................. 16
3.2 FUNDAMENTACION BIOQUIMICA DE LA BIODEGRADACION .................. 18
3.3 FACTORES QUE CONDICIONAN LA BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO. 19
3.3.1. Temperatura ........................................................................................................ 20
3.3.2. pH ........................................................................................................................ 20
3.3.3. Humedad ............................................................................................................. 21
3.3.4. Necesidad de nutrientes inorgánicos ................................................................... 21
3.3.5. Aceptores de electrones. ...................................................................................... 22
3.3.6. microorganismos. ................................................................................................ 22
3.3.7. Estructura del suelo. ............................................................................................ 23
3.3.8. Estructura del contaminante ................................................................................ 23
3.4 MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIÓN ......................................... 24
3.4.1. Bacterias .............................................................................................................. 24
3.4.2. Hongos ................................................................................................................ 26
3.5 TIPOS DE BIORREMEDIACIÓN ........................................................................... 27
3.5.1. Bioaireación o Bioventeo .................................................................................... 29
3.5.2. Bioestimulación ................................................................................................... 30

3.5.3. Bioaumentación. .................................................................................................. 31
3.5.4. Atenuación natural .............................................................................................. 32
3.5.5. Tratamiento del terreno o Landfarming .............................................................. 34
3.5.6. Biopilas................................................................................................................ 35
3.5.7. Tratamiento de biosuspensión. ............................................................................ 37
3.7 ETAPAS DEL TRABAJO PARA UNA BIORREMEDIACIÓN MÁS EFICAZ .... 38
3.7.1. Investigación y caracterización de la contaminación y del emplazamiento ........ 38
3.7.2. Análisis y elección de las medidas biocorrectivas. ............................................. 38
3.7.3. Diseño y evaluación del sistema ......................................................................... 39
3.7.4. Análisis e interpretación de resultados. ............................................................... 40
4. RESULTADOS .............................................................................................................. 41
4.1 ENSAYOS DE TRATABILIDAD EN SUELOS CONTAMINADOS .................... 41
4.2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DE TRATABILIDAD ............................................ 42
4.3 MATERIALES Y METODOS .................................................................................. 44
4.3.1. Materiales. ........................................................................................................... 44
4.3.2. Ensayos con mesocosmos. .................................................................................. 44
4.3.3. Análisis fisicoquímico del suelo. ........................................................................ 47
4.3.4. Características microbiológicas........................................................................... 50
4.3.5. Características de la actividad metabólica........................................................... 50
5. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 54
6. COMENTARIOS .......................................................................................................... 55
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 57
8. REFERENCIAS ............................................................................................................ 58
9. ANEXOS ........................................................................................................................ 60
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Estructuras químicas de componentes de un crudo de petróleo. ......................... 14
Figura 2: Apariencias físicas generales de las bacterias ..................................................... 25
Figura 3: Tipos de biorremediación. ................................................................................... 28
Figura 4: Fases en el estudio de tratabilidad de un suelo contaminado .............................. 42
INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Industrias que generan contaminación de suelos con hidrocarburos. ..................... 7
Tabla 2: Ventajas y desventajas de la biorremediación....................................................... 18
Tabla 3: Tipos de reacciones en los procesos aeróbicos y anaeróbicos. ............................. 19
Tabla 4: Bacterias y hongos más usados en biorremediación. ............................................ 27
Tabla 6: Rangos óptimos para procesos de biorremediación. ............................................. 46
Tabla 7: Análisis de características físicas. ......................................................................... 46
Tabla 8: Cantidad de agua aplicada y volteos manuales por semana .................................. 47

BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS
Autor: Daniela Ponce Contreras

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad del Bío-Bío
Correo Electrónico: dponce@alumnos.ubiobio.cl
Profesor Patrocinante: Carmen González Labbé
Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad del Bío-Bío

Correo Electrónico: cgonzal@ubiobio.cl
RESUMEN
La contaminación por hidrocarburos está ampliamente distribuida en el mundo y nuestro

país no es la excepción. La industria petrolera y petroquímica son el eje principal en la
producción de hidrocarburos y derivados destinados a satisfacer nuestros requerimientos
energéticos de combustibles y productos lubricantes para la industria y el transporte. Se
describe un problema medioambiental de amplio alcance, como es la degradación de los
suelos por la contaminación debida a los hidrocarburos, y los nuevos instrumentos de
biorremediación existentes. La degradación de suelos es un proceso que disminuye la
capacidad real y/o potencial del suelo para producir bienes o prestar servicios. Las causas
del deterioro pueden ser tanto naturales como antrópicas.
Por este motivo, en la presente investigación, se pretende realizar una revisión bibliográfica
de la biorremediación y los métodos más conocidos de dicha técnica, ya que a través de la
biorremediación se puede dar solución a la problemática de suelos contaminados con
hidrocarburos de manera más limpia. Se tienen en cuenta los factores que condicionan la
biorremediación, ventajas, desventajas y características de cada uno de sus métodos.
Además se diseñó un protocolo de ensayo a escala en laboratorio para biorremediar suelos
contaminados con hidrocarburos.
Palabras claves: Contaminación con hidrocarburos, biorremediación, protocolo de ensayo

ABSTRACT
Oil pollution is widespread in the world and our country is no exception. The oil and
petrochemical industry are the main focus in the production of hydrocarbons and
derivatives designed to meet our energy requirements of fuels and lubricants for industry
and transportation. We describe a comprehensive environmental problem, as is the
degradation by pollution due to hydrocarbons, and new instruments existing
bioremediation. Soil degradation is a process that decreases the actual capacity and / or
potential soil to produce goods or provide services. The causes of deterioration may be both
natural and anthropogenic.
For this reason, in this research aims to review the literature of bioremediation and methods
of the technique known as bioremediation through it can solve the problem of soil
contaminated with hydrocarbons more cleanly. It takes into account the factors affecting
bioremediation, advantages, disadvantages and characteristics of each of its methods.
Also designed a protocol for laboratory scale test for soils contaminated with hydrocarbons
bioremediate.
Keywords: hydrocarbon contamination, bioremediation test protocol

1. INTRODUCCION
1.1 Contexto
En la naturaleza existe una amplia variedad de microorganismos que se encuentran en el

medio de forma natural y que descomponen sustancias, incluidos los hidrocarburos, en
formas menos complejas. Este proceso de biodegradación es característico de todos los
sistemas ambientales. La introducción de hidrocarburos, por ejemplo durante un vertido,
concede a estos organismos la oportunidad de proliferar si las condiciones son adecuadas.
La biodegradación de los hidrocarburos puede producirse en presencia de oxígeno
(condiciones aeróbicas) o en ausencia del mismo (condiciones anaeróbicas). Sin embargo,
en condiciones anaeróbicas el proceso se produce de forma mucho más lenta y, desde el
punto de vista operacional, tiene poco interés para la biorremediación. Las bacterias,
hongos, levaduras y algas que son responsables del proceso de biodegradación, requieren
además fuentes de alimento en forma de nitrógeno (N) y fósforo (P), elementos que se
encuentran de forma habitual en el medio ambiente.
En consecuencia, los productos del proceso de biodegradación son: dióxido de carbono,

agua y biomasa de microorganismos. Esta reacción metabólica de origen natural puede
emplearse como mecanismo de remediación de una contaminación por derrame de
hidrocarburos, y es en este punto cuando se habla de Biorremediación.
Es necesario, inicialmente, distinguir entre los siguientes conceptos:

Biodegradación, se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros
microorganismos alteran y convierten moléculas orgánicas en otras sustancias, como ácidos
grasos y CO2.
Biorremediación, adición de materiales a ambientes contaminados para producir una
aceleración del proceso natural de biodegradación.
Fertilización, método de biorremediación de adición de nutrientes, como Nitrógeno ó
Fósforo a un medio contaminado para estimular el crecimiento de microorganismos
nativos.
Inoculación, adición de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales pueden

adicionarse junto con nutrientes.
1.2 Identificación y justificación del problema
La obtención de energía que posibilita el desarrollo de las actividades humanas, proviene en

su mayoría de la explotación del petróleo - extracción, refinación, distribución y
almacenamiento - lo que le confiere a los hidrocarburos, un papel protagónico en la
problemática ambiental a escala global.
En este sentido, los daños ocasionados por los derrames de hidrocarburos en las fuentes
hídricas, el suelo, el aire, la fauna y la vegetación son difícilmente reversibles, pues los
procesos de descontaminación no alcanzan a cubrir todas las áreas afectadas y en ocasiones
se realizan mucho tiempo después de que el crudo ha hecho tránsito y alterado el
ecosistema.
Los hidrocarburos afectan las propiedades físicas y químicas del suelo, como el pH, textura,
permeabilidad, pérdida de capacidad de soporte al crecimiento vegetal y causan un impacto
paisajístico. Para limpiar zonas afectadas con hidrocarburos existen tratamientos físicos,
químicos y biológicos, siendo éstos últimos ambientalmente seguros y económicamente
accesibles a la hora de realizar tratamientos de biorremediación de hidrocarburos. Los
tratamientos biológicos emplean microorganismos (bacterias y hongos), los cuales transforman
los contaminantes presentes en una matriz sólida o liquida y recuperan la matriz original.
1.3 Alcances de la investigación
Este proyecto tiene como objetivo principal diseñar un protocolo o metodología de ensayo
en laboratorio para biorremediar suelos contaminados con hidrocarburos, de modo que
éstas cumplan con los requerimientos y exigencias de las normativas ambientales, para así
generar interés por estas áreas, recuperando el uso de estos suelos, ya sea para cultivo,
urbanizar o para recreación. Además, debido a que existen una gran variedad de parámetros
fisicoquímicos y biológicos que condicionan el proceso de biorremediación, es necesario
evaluar la influencia de los factores que afectan al proceso de la biodegradación. Para ello
se diseña la metodología o protocolo, que se definen como conjunto de experimentos

realizados a escala de laboratorio, previos a la implementación de cualquier tecnología de
biorremediación a un suelo contaminado. (1)
1.4 Objetivos de la investigación
1.4.1. Objetivo general.
 Proponer un protocolo de ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio previos a la

elección de una técnica de biorremediación de suelos contaminados con
Hidrocarburos.
1.4.2. Objetivos específicos.
 Comparar técnicas de biorremediación para mejorar suelos contaminados.

 Definir factores que condicionan la biorremediación en un suelo.
 Identificar y seleccionar los parámetros de estudio en laboratorio necesarios a
considerar para biodegradar suelos contaminados con hidrocarburos.
 Diseñar protocolo de ensayo de tratabilidad que permitirá caracterizar tanto las
poblaciones microbianas como la biodegradabilidad de los contaminantes del suelo.
2. REVISION BIBLIOGRAFICA.
2.1 CONTAMINACIÓN DEL SUELO CON HIDROCARBUROS.
Generalidades
La contaminación por hidrocarburos es una problemática de carácter mundial y amplia

distribución geográfica, teniendo en cuenta que independiente de la zona afectada (lagos,
suelos, zonas freáticas, ríos y playas) por procesos biológicos y físicos, los hidrocarburos
tienen como destino final el océano.
En la actualidad existe un creciente interés por la contaminación del suelo con

hidrocarburos, por parte de los países dedicados a la explotación de petróleo,
organizaciones e instituciones afines al medio ambiente, debido a los riesgos directos que
ocasionan a la salud humana y el entorno, además los altos costos que implican los
procesos de limpieza y mitigación de los lugares afectados. Los antecedentes descritos
están direccionando sus políticas hacia la disminución y la remediación de la
contaminación por hidrocarburos.
Así un suelo contaminado se define como todo aquel cuyas características físicas, químicas
y biológicas naturales, han sido alteradas debido a actividades antropogénicas y representa
un riesgo para la salud humana o el medio ambiente. (2)
La contaminación de suelo por hidrocarburos es dinámica, los componentes individuales

pueden separarse de la mezcla original como se detalla a continuación: (2)
 Los Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs) se evaporan.
 Algunos se solubilizan gracias a la polaridad de sus moléculas.
 Otros se absorben en la superficie de la fase sólida del suelo por reacciones

químicas o debido a fuerzas físicas, (siendo la primera la que fija los contaminantes,
limita el transporte y disminuye la biodisponibilidad para los microorganismos).
 Mientras otros son degradados por microorganismos en el suelo.

Como resultado de estas transformaciones los hidrocarburos se enriquecen en compuestos

pesados, más difíciles de degradar.
En la Tabla 1 se presentan las industrias que generan contaminación del suelo por
hidrocarburos.
Tabla 1: Industrias que generan contaminación de suelos con hidrocarburos.
TIPO DE INDUSTRIA PRINCIPALES CONTAMINATES DEL SUELO

Industria petrolera Hidrocarburos aromáticos y alifáticos.
Fábrica de gas Alquitran, benceno fenoles, hidrocarburos aromáticos policíclicos, cianuros.
Industria textil Hidrocarburos y metales pesados.
Estaciones de servicio Hidrocarburos y derivados del petróleo.
Centrales termoeléctricas Hidrocarburos, derivados del petróleo y metales pesados.
Minería Hidrocarburos aromáticos, metales pesados, cianuro.
Industria agropecuaria Hidrocarburos, pesticidas, plagicidas.
Floricultura Pesticidas, plaguicidas e hidrocarburos.
Lavadoras de vehículos Hidrocarburos.
Mecánicas automotrices Hidrocarburos, aceites.
Fuente: Elaboración propia.
Efectos de los hidrocarburos en el suelo. (2)
Los efectos de los hidrocarburos tienen una variedad de escenarios potenciales, debido a la
difusión lenta de los contaminantes, los cuales se redistribuyen por toda la superficie del
suelo y hacia el interior de este. Cuando los hidrocarburos se filtran, se produce una
separación natural de los distintos constituyentes, por la exposición de la fase no acuosa a
las fases, sólida, gaseosa y acuosa del suelo, permaneciendo los compuestos de alto peso
molecular cerca de la fuente, debido a que tienen menor movilidad, mientras que los
compuestos más livianos migran hacia porciones profundas del perfil por su mayor
solubilidad en agua.
Cuando la cantidad de hidrocarburos disminuye ya sea por disolución u otro mecanismo de

remoción, se reduce la fracción del espacio poroso ocupado por los hidrocarburos, los
conductos de comunicación entre los poros se tornan más pequeños y tortuosos, reduciendo
la capacidad de la fase orgánica de desplazarse y cuando ya no existe suficiente volumen
para que continué la migración, la fase no acuosa en el suelo se denomina saturación
residual. Los espacios degradados pierden algunas de sus funciones, características físico
químicas y por lo tanto un manejo inadecuado de los hidrocarburos puede causar problemas
de gran envergadura socio-ambiental. Los principales efectos que los hidrocarburos causan
en el suelo, dependen del tipo, volumen de hidrocarburo, características físicas, químicas y
microbiológicas del suelo, y los factores ambientales (humedad, temperatura, factores
climatológicos), todas las variables en su conjunto definen el tamaño en la distribución de
la contaminación en una zona específica, entre los efectos más perjudiciales que sufre el
suelo tenemos:
 Disminución del rendimiento de los cultivos y pérdida de calidad de los productos

obtenidos.
 Impide o retarda el crecimiento de la vegetación en el área contaminada.
 Alteraciones en la población microbiana del suelo.
 Contaminación de aguas superficiales a través de la escorrentía.
 Contaminación de aguas subterráneas a través de lixiviados.
 Contaminación del aire por combustión, evaporación, sublimación o arrastre por el

viento.
 Envenenamiento a través de la cadena alimenticia.
 Cuando la concentración de los contaminantes sobrepasa la capacidad de aceptación

del suelo, se produce una disminución o anulación de su poder autodepurante.
 Impacto paisajístico en el sector en que se encuentra la matriz contaminada.
 Se impide el intercambio gaseoso con la atmósfera iniciando una serie de procesos

físicos químicos simultáneos.
 Los elevados desniveles de salinidad pueden destruir la estructura terciaria de las

proteínas, desnaturalizar enzimas y deshidratar células.
Los hidrocarburos ligeros penetran más en el suelo llegando a las capas freáticas y resultan
tóxicos para la microflora del suelo, en cambio los más pesados son menos tóxicos a corto
plazo, pero permanecen en el ambiente por mucho más tiempo. Los compuestos solventes se
filtran y los sólidos, permanecen en la superficie o son llevados hacia tierras más bajas. En la
siguiente tabla se presentan los parámetros que influyen en el transporte de los contaminantes.
Efectos de los hidrocarburos en los seres vivos. (2)
Debido a la variedad de la composición de los hidrocarburos, los efectos en los seres vivos
son muy diversos, y dependen de factores como, el tipo de compuesto químico, la cantidad
vertida y el tiempo de exposición. Según el tipo de hidrocarburo se puede estimar la
intensidad de los daños y efectos, así combustibles ligeros como la gasolina y el queroseno
resultan más tóxicos que los medianos y pesados como el Diesel o Fuel Oíl, debido a que
contiene grandes cantidades de hidrocarburos saturados y bajo contenido de compuestos
polares, ya que su mayor volatilidad aumenta el contacto físico entre el contaminante y las
células microbianas.
Efectos de la contaminación por hidrocarburos en el ser Humano. (2)
Las vías de ingreso de los hidrocarburos al cuerpo de las personas pueden ser, por vía
respiratoria cuando se los inhala y cuando se los ingiere con los alimentos (cadena trófica),
a través del agua y por contacto directo. Cuando ingresan por vía dérmica los
contaminantes son absorbidos más lentamente que cuando son inhalados o ingeridos.
Luego de ingresar estos son ampliamente distribuidos por la sangre y se transforman
rápidamente en compuestos químicos, pudiendo resultar más dañinos así como menos
peligrosos, esto en función de factores como el tipo, composición y la cantidad expuesta de
hidrocarburos; la mayoría de los hidrocarburos abandonan el cuerpo a través de la orina o
con el aire exhalado. Los constituyentes de los hidrocarburos, de bajo peso molecular
(benceno, tolueno, xileno) afectan el sistema nervioso central, causan irritación de la piel,
dolores de cabeza, náuseas, hormigueos en manos y pies, cuando la exposición es alta
pueden provocar la muerte.
10
Los principales peligros provenientes de elevadas concentraciones de hidrocarburos en

general, están relacionados a los hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs)
principalmente por sus efectos cancerígenos. Se ha demostrado que el benceno es
responsable de causar cáncer (leucemia) en los seres humanos, además la gasolina y
benzopirenos son considerados como cancerígenos para humanos. El n-hexano afecta el
sistema nervioso central de una forma diferente, causando un desorden nervioso llamado
“neuropatía periférica” caracterizada por el entumecimiento de las extremidades y en casos
graves, parálisis. Cuando se ingiere gasolina y kerosene, se produce irritación en la garganta y
estómago, depresión del sistema nervioso central, dificultad para respirar y neumonía.
Compuestos como el Antraceno, Pireno, Fenanteno, benzopirenos, causan la irritación de la
piel, cáncer de piel, testículos y pulmones, siendo los alcanos presentes en las gasolinas
depresores del sistema nervioso central. Los metales pesados (cadmio, cromo, plomo,
magnesio, cobalto, cobre) pueden originar enfermedades diferentes cada uno, se bioacumulan
en los seres vivos y entran a formar parte de las cadenas alimenticias, producen la irritación de
piel, problemas reproductivos y cáncer. Es fundamental tener en cuenta los procesos de
intemperización, ya que estos cambian la composición de los productos y pueden afectar los
resultados, la capacidad para biorremediar y la toxicidad del producto liberado al ambiente.
Según algunos estudios realizados en las poblaciones aledañas a instalaciones petroleras y
zonas donde existe contaminación por hidrocarburos en el Ecuador, se afirma que existe una
relación directa entre la exposición a los hidrocarburos con una mayor prevalencia de
enfermedades, las mismas que se pueden manifestar a corto y largo plazo en la población. A
continuación se presentan los estudios epidemiológicos realizados.
Daños a la fauna y flora. (2)
La contaminación por hidrocarburos afecta a los animales desde los mamíferos, aves,
peces, las almejas, los moluscos e insectos, cuando los derrames de petróleo son sobre
cursos de agua afectan de manera especial a la aves y fauna acuática, impidiéndoles nadar,
alimentarse y con frecuencia volar. Numerosos estudios realizados tanto en animales (de
laboratorio y animales libres) demuestran que la exposición al petróleo causa lesiones en
distintos órganos, cáncer, defectos en la reproducción e incluso su muerte, en los estudios
realizados a los animales se presentan los siguientes efectos.
11
 En las aves se ha presentado efectos negativos sobre la capacidad reproductiva.
 En estudios realizados en patos que han ingerido crudo se ha observado anemia

hemolítica.
 Algunos estudios en ratas han confirmado la presencia de tumores en la piel, por la

exposición al crudo, además se han presentado cambios funcionales en las células
hepáticas de las ratas.
También se produce destrucción de los hábitats, de especies endémicas, pérdida de la

diversidad de las comunidades faunísticas que habitan cerca de lugares contaminados con
hidrocarburos. En cuanto a la afección a la flora se producen los siguientes daños:
 Efectos negativos en la reproducción y propagación de la flora.
 Destrucción de las fuentes alimenticias de las especies superiores.
 Incorporación de carcinógenos en la cadena alimentaria.
 La fauna puede verse afectada por varios factores: la persistencia de una mancha de
crudo limita el paso de la luz y por tanto reduce la actividad fotosintética de muchas
plantas, si la mancha las cubre dificulta también su función reproductora y la
fijación.
 Pérdida de parajes con valor natural, recreativo o vacacional.
2.2 EL PETROLEO Y SUS HIDROCARBUROS
El petróleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos, es decir,

de moléculas que contienen básicamente, carbono e hidrógeno. Estas moléculas pueden
estar formadas de cadenas de átomos de carbono largas o cortas y que pueden adoptar
diferentes estructuras. Los hidrocarburos del petróleo pueden dividirse en cuatro categorías
de compuestos:
12
I. Los saturados: los alcanos como el hexano, el octano, el decano, el hexadecano, los
isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano.
II. Los aromáticos: benceno, tolueno, xileno y naftaleno agrupados también bajo la
apelación BTEX y los poliaromáticos o PAHs (Rittman, 1994).
III. Las resinas: sólidos polares amorfos disueltos que contienen nitrógeno, azufre y
oxígeno.
IV. Los asfaltenos: grandes moléculas polares coloidales sin disolver que son más
resistentes a la biodegradación (Balba ; Al-Awadhi ; Al-Daher, 1998).
En términos generales, de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petróleo es degradable

(la fracción de hidrocarburos saturados y aromáticos) y el resto representa los asfaltenos y
las resinas esencialmente inertes (Prince et al., 1999).
Cada una de las categorías agrupa compuestos con características de solubilidad, volatilidad
y toxicidad propias. Desde un punto de vista de biodegradabilidad, los hidrocarburos
pueden ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en: alcanos lineales > alcanos
ramificados > aromáticos ligeros > alcanos cíclicos > aromáticos pesados > compuestos
polares (Olson, et al., 1999 ; Harris, 1997).
2.3 COMPOSICION POR FAMILIAS DE HIDROCARBUROS. (3)
El estudio más detallado de los hidrocarburos de un crudo de petróleo agrupa estos

compuestos en las siguientes familias:
Parafinas volátiles: Representan hasta un 30% del crudo de petróleo. Son n –alcanos e
isoprenoides (alcanos ramificados) de un tamaño C1 a C106. Es la fracción más volátil del
crudo y por lo tanto la más susceptible de pérdidas abióticas por volatilización. La fracción
gas natural contiene, principalmente C1 a C5. Los isoprenoides volátiles, están
representados principalmente por el isobutanoe isopentano. Los isoprenoides volátiles
también pueden llegar hasta C10 (2,6 dimetil octano) (Howe-Grant, 1996).
13
Parafinas no volátiles: Se definen como aquellos n –alcanos e isoprenoides entre C11y

C40. Los n-alcanos oscilan entre C11y C40, aunque se han descrito cadenas más largas y
pueden constituir entre el 15 y 20% de crudos no degradados; mientras que los isoprenoides
varían de C12 a C22 y constituyen entre 1-2% del crudo, llegando a 15% en crudos
degradados. Los componentes entre C11 y C15 son de volatilidad intermedia.
Naftenos: Esta familia está compuesta por las cicloparafinas o cicloalcanos. Los
compuestos más abundantes de esta familia son los ciclopentanos alquilados
(fundamentalmente metilados), que pueden llegar a representar un 31% del crudo. Los
compuestos mono y dicíclicos corresponden entre el 50 y 55% de esta fracción, los
tricíclicos al 20% y los tetracíclicos al 25%. Esta familia engloba a los hopanos.
Oleofinas: Son alquenos, los cuales están poco presentes en el crudo de petróleo,
encontrándose en concentraciones traza. Adquieren importancia en los productos
resultantes del refinado, ya que se generan durante el proceso decracking , existiendo hasta
un 30% en gasolinas y un 1% en fueles.
Aromáticos: El crudo de petróleo contiene una mezcla muy compleja de hidrocarburos

aromáticos. Esta fracción la componen moléculas que contienen uno o varios anillos
bencénicos en su estructura. Así se encuentran hidrocarburos monoaromáticos (un anillo
bencénico), diaromáticos (2 anillos bencénicos) y poliaromáticos (HAPs, con más de dos
anillos bencénicos).
 Hidrocarburos monoaromáticos: Se encuentran el benceno y sus alquilados

(monoalquilados como el tolueno y dialquilados como los xilenos), formando la
familia de los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) de gran importancia
ambiental debido a su volatilidad y toxicidad.
 Hidrocarburos poliaromáticos: Entre los hidrocarburos diaromáticos,

encontramos el naftaleno y sus alquilados (mono, di, tri y tetrametilnaftalenos).
Constituyen la familia mayoritaria de hidrocarburos aromáticos presentes en un
crudo.
14
Entre los hidrocarburos poliaromáticos de tres anillos, encontramos el fenantreno,

antraceno, fluoreno, y sus derivados alquilados. El fenantreno y los metilfenantrenos,
representan los componentes mayoritarios de los triaromáticos.
Entre los hidrocarburos poliaromáticos de más de tres anillos, encontramos el fluoranteno

(3 anillos bencénicos y uno no bencenico), pireno y criseno (4 anillos aromáticos), pireno y
benzo(a) pireno (5 anillos aromáticos) y coroneno (un HAP pericondensado con 6 anillos).
Resinas y asfaltenos: Se trata de mezclas complejas, integradas por núcleos policíclicos o

naftenoaromáticos. Contienen cadenas hidrocarbonadas con heteroátomos de oxígeno,
nitrógeno y azufre (componentes NOS del petróleo) y a veces están asociadas con pequeñas
concentraciones de metales como el vanadio y el níquel. Constituyen entre un 10% en
crudos poco degradados o ligeros, hasta un 60% en crudos muy degradados. Es la fracción
que presenta una mayor recalcitrancia de un crudo de petróleo. Se trata de agregados de
piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos, amidas, HAP, sulfuros, ácidos
nafténicos, ácidos grasos, metaloporfirinas y fenoles polihidratados. (Howe-Grant,1996).
Figura 1 : Estructuras químicas de diferentes componentes mayoritarios de un crudo de

petróleo. (Fuente: Marc Viñas Canals)
15
Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH).
El término TPH se usa para describir a un grupo de sustancias químicas, derivadas del
petróleo crudo, debido al gran número de hidrocarburos involucrados generalmente no es
práctico medir cada uno de ellos, sin embargo es útil medir la cantidad total del conjunto de
hidrocarburos que se encuentran en una muestra de suelo contaminada que sirve como
indicador general del tipo de contaminación.
Uno de los factores que limita la eliminación de los hidrocarburos contaminantes es la

tranferencia de masa. Los tratamientos de limpieza del suelo utilizan usualmente métodos
que permitan el arrastre de los hidrocarburos, pero deben vencer para ello, las fuerzas de
adsorción sobre las partículas del suelo por modificación de temperatura, de las
interacciones químicas (extracción, emulsificación) o de la tensión de vapor. En el caso de
la contaminación con hidrocarburos, se proponen tratamientos físicos, químicos y
biológicos que pueden ser utilizados en complementariedad (Thomassin-Lacroixet al.,
2002).
16
3. METODOLOGIA
En este capítulo se describe de manera detallada la técnica de biorremediación, obtenida de

fuentes bibliográficas actuales y de experiencias comprobadas y realizadas en otros países,
como España, México, Argentina, entre otros.
3.1 BIORREMEDIACION
Definición
La biorremediación consiste en usar microorganismos (hongos, bacterias) para acelerar la

tasa de degradación natural de los contaminantes para descomponerlas o degradarlas en
sustancia menos toxicas o no toxicas obteniendo un suelo útil para la agricultura por el uso
de nutrientes.
Algunos microorganismos se comen las sustancias orgánicas obteniendo de éstas los

nutrientes y la energía que requieren para sobrevivir, los microorganismos descomponen
los contaminantes dando como resultado principalmente dióxido de carbono y agua. Al
degradarse todos los contaminantes, es decir, al acabarse la fuente de alimentación de los
microorganismos la población de los mismos disminuye hasta desaparecer.
Su ámbito de aplicabilidad es muy amplio, pudiendo considerarse como objeto cada uno de
los estados de la materia (Atlas y Unterman, 1999):
 Sólido. Con aplicaciones sobre medios contaminados como suelos o sedimentos, o

bien directamente en lodos, residuos, etc.
 Líquido. Aguas superficiales y subterráneas, aguas residuales.
 Gases. Emisiones industriales, así como productos derivados del tratamiento de

aguas o suelos.
17
También se puede realizar una clasificación en función de los contaminantes con los que se
puede trabajar (Alexander, 1999; Eweiset al., 1999):
 Hidrocarburos de todo tipo.
 Hidrocarburos clorados.
 Compuestos nitroaromáticos.
 Metales pesados. Estos no se metabolizan por los microorganismos de manera

apreciable, pero pueden ser inmovilizados o precipitados.
 Otros contaminantes. Compuestos organofosforados, cianuros, fenoles, etc.
Los microorganismos transforman y metabolizan aeróbicamente los hidrocarburos y otros

compuestos orgánicos hasta dióxido de carbono, agua y fuentes de alimento para sustentar
su crecimiento y reproducción, es decir, la biodegradación ocurre naturalmente. Es
conocido que los microorganismos indígenas tienen la capacidad de adaptarse y
eventualmente degradar cualquier compuesto orgánico natural sin asistencia del hombre;
sin embargo, esta adaptación requiere la presencia de condiciones óptimas apropiadas tales
como el pH, temperatura, el aceptor final de electrones (que en procesos aeróbicos es el
oxígeno), concentraciones de contaminante no toxicas para los microorganismos y
adecuadas condiciones de humedad y conductividad del medio, entre las más importantes.
La ausencia de alguna o varias de las anteriores condiciones puede limitar parcial o
totalmente la actividad biológica y es cuando la mano del hombre juega un papel
fundamental en la optimización del proceso, ya sea mejorando estas condiciones para
aumentar la población de microorganismos (bioaumentación) y/o manipulando
genéticamente los microorganismos para la degradación especifica de algunos compuestos
químicos (bioestimulación).
18
Tabla 2: Ventajas y desventajas de la biorremediación.
Ventajas Desventajas
- Son efectivos en cuanto a
- Requieren mayores tiempos de
costos.
tratamiento.
- Son tecnologías más benéficas
Biorremediación - Es necesario verificar la toxicidad
para el ambiente.
de intermediarios y/o productos.
- Los contaminantes
- No pueden emplearse si el tipo de
generalmente son destruidos.
suelo no favorece el crecimiento
- Se requiere un mínimo o ningún
microbiano.
tratamiento posterior.
3.2 FUNDAMENTACION BIOQUIMICA DE LA BIODEGRADACION
El fundamento bioquímico de la biorremediación se basa, principalmente, en la serie de

reacciones de óxido-reducción (cuyo fin es la obtención de energía) que se producen en la
cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células. La cadena la inicia un
sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa
como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba
degradando y consumiendo dicha sustancia. Los aceptores más comúnmente utilizados por
los microorganismos son el oxígeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de
carbono. Cuando el oxígeno es utilizado como aceptor de electrones la respiración
microbiana se produce en condiciones aerobias y los procesos de biodegradación serán de
tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dióxido de carbono se produce en
condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo
anaerobio.
19
Tabla 3 : Tipos de reacciones en los procesos de degradación aeróbicos y anaeróbicos.
Degradación aerobia: Sustrato + O2 à Biomasa + CO2 + H2O

Sustrato + NO3- à Biomasa + CO2 + N2
Sustrato + SO42- à Biomasa + CO2 + S2+
Degradación
Sustrato + Fe3+ à Biomasa + CO2 + Fe2+
anaerobia:
Sustrato + Mn4+ à Biomasa + CO2 + Mn2+
Sustrato + CO2 à Biomasa + CO2 + CH4
3.3 FACTORES QUE CONDICIONAN LA BIORREMEDIACIÓN DE UN SUELO
La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo contaminado

depende de diversos factores:
1. TEMPERATURA
2. pH
3. HUMEDAD
4. NUTRIENTES
5. ACEPTOR DE ELECTRONES
6. MICROORGANISMOS
7. ESTRUCTURA DEL SUELO
8. ESTRUCTURA DEL CONTAMINANTE

20
3.3.1. Temperatura
Es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la actividad metabólica de
los microorganismos y la tasa de biodegradación. Generalmente, las especies bacterianas
crecen a intervalos de temperatura bastante reducidos, entre 20 y 30ºC (condiciones
mesófilas), decreciendo la biodegradación por desnaturalización de las enzimas a
temperaturas superiores a 40ºC e inhibiéndose a inferiores a 0ºC. Sin embargo, también se
ha dado la biodegradación de hidrocarburos a temperaturas extremas:
 10ºC en suelos subárticos y subalpinos (Sparrow y Sparrow, 1988; Margesin y

Schinner, 1997a,b).
 5ºC en suelos árticos (Whyteet al ., 1999)
 60ºC por una cepa termófila de Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo

contaminado con crudo de petróleo del desierto kuwaití (Sorkohet al ., 1993).
3.3.2. pH
Afecta significativamente la actividad microbiana. En consecuencia, cuanto mayor sea la

diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de
tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los
casos, pero en términos generales el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos
es máximo dentro de un intervalo de pH situado entre 6 y 8. En general, el pH óptimo para
las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6 - 8), mientras que es más ácido para los hongos
(pH 4 - 5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4 -
7,8) (Dibble y Bartha, 1979). Así mismo el pH también afecta directamente en la
solubilidad del fósforo y en el transporte de metales pesados en el suelo. La acidificación o
la reducción del pH en el suelo se puede realizar adicionando azufre o compuestos del
azufre.
21
3.3.3. Humedad
Los microorganismos requieren unas condiciones mínimas de humedad para su

crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de
transporte a través del cual los compuestos orgánicos y nutrientes son movilizados hasta el
interior de las células. Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir
la concentración de oxígeno en el suelo (el rango varía en función de la técnica). Por lo
anterior, la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación,
fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el
contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades de
cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica.
3.3.4. Necesidad de nutrientes inorgánicos
El metabolismo microbiano está orientado a la reproducción de los organismos y éstos

requieren que los constituyentes químicos se encuentren disponibles para su asimilación y
sintetización. Los nutrientes principalmente requeridos son el fósforo y el nitrógeno, por
tanto, las concentraciones asimilables de dichos elementos presentes en el suelo, suelen ser
limitantes para un incremento y activación de la población microbiana, mientras que otros
nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya están presentes en cantidades
suficientes (Menn et al ., 2000). La adición de fuentes de N y P inorgánicas, generalmente
tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de
biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados (Dott et al., 1995;Breedveld y
Sparrevik, 2001; Chaineau et al., 2003). Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la
bibliografía, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas; el rango
normal de C:N:P depende del sistema de tratamiento a emplear, siendo de modo habitual
100:10:1. Aunque en general la adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es
beneficiosa para los procesos de biodegradación, de igual manera, el uso excesivo de
nutrientes inorgánicos también puede inhibir los procesos de biodegradación (Zhou y
Crawford, 1995; Margesin y Schinner, 1997; Genouw et al ., 1994). Para evitar el exceso de
nutrientes, así como la pérdida de los mismos por lixiviación, también se han utilizado
fertilizantes inorgánicos oleofílicos de liberación lenta (Inipol EPA® 22) para la
22
biorremediación de suelos contaminados (Lindstrom et al ., 1991; Pritchard y Costa, 1991)

Además es importante destacar que la acción de los nutrientes inorgánicos puede estar
limitada debido a la interacción química con los minerales del suelo. (el amonio se puede
unir a las arcillas por intercambio catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones
calcio, hierro y aluminio) (Morgan y Watkinson ,1992)
3.3.5. Aceptores de electrones.
La cantidad de oxigeno disponible determinará si un sistema es aerobio o anaerobio. La

degradación de HCs se da mejor en los sistemas aerobios y para ello los microorganismos
deben utilizar O2 como aceptor de electrones como el oxígeno (O2) ya que los procesos de
oxidación de los HCs requieren de enzimas oxigenasas. Sin embargo la presencia de otros
aceptores de electrones como nitrato (NO3 -), sulfato (SO4 -2) o hierro (Fe+3) permiten la
biodegradación de HCs en ambientes anaerobios (Atlas, 1981; Heitzer y Sayler, 1993;
Alexander, 1999; Roberts, 2000).
En los procesos de biorremediación el oxígeno es proporcionado por el uso de aire, oxígeno

puro, peróxido de hidrogeno u ozono a través de bombas, propulsores, agitadores,
vaporizadores y chorros aunque también se puede suministrar el oxígeno de forma manual
mediante el arado directo del sistema (Levin y Gealt, 1997; EPA, 2000).
3.3.6. microorganismos.
La capacidad metabólica de utilizar HCs está ampliamente distribuida entre diversas

poblaciones bacterianas (Atlas, 1981). Las transformaciones biológicas de los
hidrocarburos se llevan a cabo por la acción de enzimas adecuadas para esa transformación.
Las enzimas son específicas con relación al compuesto que atacan y a las reacciones que
catalizan, generalmente más de una enzima es requerida para degradar una sustancia
orgánica y los microorganismos que poseen las enzimas están presentes ya en el suelo
(Atlas, 1981; Rittman y McCarty, 2001).
La densidad de microorganismos en el suelo es un factor primordial en el proceso de

biorremediación. Se requiere una concentración mayor de 1x103 UFC/gps para que se
alcance una aceptable actividad biodegradativa por los microorganismos (EPA, 1994;
23
Leahy y Colwell, 1990; EPA, 2000). En ecosistemas no contaminados las comunidades

degradadoras de hidrocarburos constituyen menos del 0.1% y en ecosistemas contaminados
forman el 85% de microorganismos viables, estas diferencias se dan por el grado de
exposición y por la adaptabilidad de los microorganismos a los hidrocarburos del ambiente
(Levin y Gealt, 1997; Sylvia et al., 1999; Roberts, 2000).
Antes de iniciar cualquier proceso de biorremediación es importante realizar recuentos de

microorganismos heterótrofos y degradadores para conocer la densidad e identificar las
especies de microorganismos existentes para escoger una estrategia apropiada de
descontaminación para un sitio en particular (Ordóñez, 1995; EPA. 2000).
3.3.7. Estructura del suelo.
La estructura del suelo (granulometría y textura) puede afectar directamente la entrada

efectiva de aire, agua, nutriente y la movilidad del contaminante durante la biodegradación
(Atlas, 1981; Vidali, 2001).
Un suelo con baja permeabilidad impedirá los movimientos de agua, nutrientes y oxígeno al
formarse complejos húmicos de arcilla disminuyendo la disponibilidad para los
microorganismos, de la misma forma esto contribuye a la formación de residuos
persistentes en el ambiente (Eweis et al., 1999)
El contaminante puede ser absorbido en las partículas del suelo formando agregados los
cuales son difícilmente transportados hasta las células que los degradan con lo cual
aumenta la concentración de la contaminación (Bouwer y Zehnder, 1993)
3.3.8. Estructura del contaminante.
La estructura molecular del contaminante, afecta a sus propiedades químicas y físicas y su

capacidad para ser biodegradado. La capacidad para ser biodegradado está relacionada
con factores tales como la solubilidad, el grado de ramificación, el grado de saturación y la
naturaleza y el efecto de los sustituyentes.
La concentración de los hidrocarburos en el ambiente también afecta considerablemente las

tasas de biodegradación:
24
 Si las concentraciones presentes en el suelo son muy bajas los compuestos presentes
no suministran la energía suficiente para el mantenimiento de los microorganismos.
 Si las concentraciones de HCs son altas pueden ser tóxicos para las células al
generar cambios en la estructura y función de la membrana celular.
3.4 MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIÓN
El suelo es un ambiente muy apropiado para el desarrollo de los microorganismos tanto

eucariotas (algas, hongos, protozoos) como procariotas (bacterias y arqueas), además de
encontrar virus y bacteriófagos. Todos estos organismos establecen relaciones entre ellos en
formas muy variadas y complejas y también contribuyen a las características propias del
suelo por su papel en la modificación de las fases sólida, líquida y gaseosa antes
mencionadas. Los microorganismos desempeñan funciones de gran importancia en relación
con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos como el carbono, el
nitrógeno, oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de las plantas
y protección frente a patógenos; degradación de compuestos xenobióticos, etc. En un suelo
agrícola están presentes alrededor de 1010 organismos por gramo de suelo y constituyen
una biomasa de aproximadamente 1500 kg por Ha. Un gramo de suelo fértil puede contener
5 metros de micelio fúngico, 108 células bacterianas, 106 esporos de actinomicetos.
Los microorganismos hacen parte fundamental de los procesos de biorremediación. En

gran parte, las bacterias casi siempre son los degradadores primarios, aunque en algunas
ocasiones los hongos juegan un papel importante. Las bacterias desempeñan el papel de
mayor importancia en la biodegradación de contaminantes orgánicos en suelos; los hongos
también metabolizan compuestos orgánicos pero no son tan eficientes como las bacterias.
3.4.1. Bacterias
Las bacterias son el grupo de organismos más abundante en los suelos y la cantidad de
especies presentes en el mismo parece relativamente constante alrededor del mundo.
Dichos organismos son un grupo diverso con variaciones extensivas en las propiedades
25
morfológicas, ecológicas y fisiológicas y son los principales degradadores de compuestos

orgánicos naturales y xenobióticos encontrados en el suelo. Las más comunes son:
Pseudomonas, Arthrobacter, Achromobacte, Micrococcus, Vibrio, Acinetobacter,
Brevibacterium, Corynebacterium y Flavabacterium.
Por su diversidad, las bacterias se encuentran regularmente en comunidades heterogéneas;

algunas especies son degradadores primarios, es decir, ellas inician la degradación de la
materia orgánica en el suelo; otras crecen en compuestos resultantes de la degradación
parcial de complejos orgánicos o productos residuales de degradadores primarios.
Las bacterias tienen tres apariencias físicas generales:
 Esféricas (cocos)
 Forma de bastones (bacilos)
 Forma de espiras (espirilos)
Y se clasifican usando sus características físicas, químicas, genéticas y metabólicas.
Figura 2 : Apariencias físicas generales de las bacterias (Fuente: Schlegel, 1993)
El uso y tolerancia al oxígeno que es uno de los métodos más generales de

clasificación. Los aerobios estrictos son bacterias que requieren oxígeno como aceptor
final de electrones y crecen solamente en presencia del mismo. Las
aerobias facultativas son bacterias que pueden utilizar aceptores de electrones terminales
alternativos y crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Algunas anaerobias son tolerantes
al oxígeno, pero éste es tóxico a muchas anaerobias estrictas. Las bacterias también se
26
pueden clasificar como eutrofas, las cuales crecen en presencia de altas concentraciones de
sustratos, y oligotrofas, las cuales crecen con concentraciones trazas. Los actinomicetos son
un grupo intermedio entre las bacterias procariotas más primitivas y los hongos eucariotas;
éstos están presentes en un gran número de suelos. Toleran un intervalo amplio de pH y
temperatura, crecen bajo condiciones limitadas de nutrientes y son resistentes a desecación.
Aunque su tasa de crecimiento es más baja que la de las bacterias, la habilidad de los
actinomicetos para crecer en condiciones adversas permiten a estos predominar
cuando las condiciones del medio son difíciles
Algunas bacterias son capaces de formar esporas cuando las condiciones de crecimiento
son muy adversas, como cuando el suelo está seco o cuando los nutrientes están limitados.
Las esporas son muy resistentes al calor y no son fáciles de destruir por radiación u otros
factores químicos tales como ácidos y desinfectantes. Las bacterias formadas de esporas
son muy comunes en suelos donde las condiciones pueden ser muy variables.
3.4.2. Hongos
Los hongos son altamente protistas, no tienen movimiento y emplean materia orgánica
como fuente de carbono y energía. Algunos de los hongos mejor conocidos son mohos,
levaduras y setas (ver Figura 4 y Figura 5).
En comparación con las bacterias, los hongos son menos numerosos y crecen a velocidades
considerablemente bajas; además, los procesos metabólicos de éstos son menos diversos.
Como grupo, los hongos tienden a ser más tolerantes a los ácidos que las bacterias (muchas
especies crecen a un pH óptimo de 5 o menos) y son más sensibles a la variación en la
humedad. Un hongo que tiene un considerable potencial en el tratamiento de compuestos
orgánicos peligrosos es Phanerochaete chrysoporium, hongo de la podredumbre blanca.
Este
organismo produce una encima extracelular peroxidasa que degrada la lignina en presencia
del peróxido; se ha encontrado que degrada una alta variedad de compuestos altamente
clorados y recalcitrantes. El uso de dicho hongo está limitado para condiciones en las
cuales el nitrógeno esté limitado porque la peroxidasa no se produce de otra manera.
27
Microorganismos concretos
Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas,

que permiten la oxidación de algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación cambia las
propiedades de los compuestos haciéndolos susceptibles a ataques secundarios y facilitando
su conversión a bióxido de carbono y agua.
Tabla 4: Bacterias y hongos más usados en biorremediación.
BACTERIAS HONGOS
Achromobacter Aspergillus
Actinomyces Bitrytis
Alcaligenes Candida
Bacillus Cladosporium
Coryneforms Fusarium
Erwinia Hansenula
Flavobacterium Oidiodendrum
Lactobacillus Penicilium
Nocardia Paecylomyces
Pectococcus Saccharomyces
Pseudomonas Rhodotorula
Sarcina Torulopsis
Spirillum Trichoderma
Streptomyces Saccharomycopsis
Vibrio
Rhodosporidium
Xanthomyces
3.5 TIPOS DE BIORREMEDIACIÓN
La Biorremediación dependiendo las necesidades y características del problema se

subdivide en varias metodologías (Velasco y Volke, 2002):
28
Figura 3: Tipos de biorremediación. (Fuente: Elaboración propia)
Lugar de realización del proceso de biorremediación
Se distinguen dos tipos de tecnología:
oSoInnlasistua:plicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los

contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin necesidad de excavar el
sitio. Es decir, se realizan en el mismo sito en donde se encuentra la contaminación.
oLaErxeasliitzua:ción de este tipo de tecnologías, requiere de excavación, dragado

o cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento
que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de él (off site).
29
Tabla 1. Ventajas y desventajas de los tratamientos in situ y ex situ
In situ Ex situ
- Permiten tratar el suelo sin -Menor tiempo de tratamiento.
Ventajas necesidad de excavar ni - Más seguros en cuanto a uniformidad:
transportar. es posible homogeneizar y muestrear
- Potencial disminución en costos. periódicamente.
-Mayores tiempos de tratamiento. - Necesidad de excavar el suelo.
-Pueden ser inseguros en cuanto a - Aumento en costos e ingeniería para
uniformidad: heterogeneidad en equipos.
Desventajas
las características del suelo. - Debe considerarse la manipulación del
-Dificultad para verificar la material y la posible exposición al
eficacia del proceso. contaminante.
Biorremediación In Situ
3.5.1. Bioaireación o Bioventeo
Consiste en estimular la biodegradación natural de los contaminantes de forma pasiva

estimulando la actividad microbiana a través de gases, como el metano y oxígeno. Se utiliza
principalmente para tratar suelos orgánicos semi volátiles o no volátiles.
Ventajas.
o Es una técnica altamente efectiva para tratar contaminaciones con compuestos con
baja presión de vapor (menos de 1 mmHg), ya que su tasa de degradación es mucho
mayor que la de volatilización (Matthews, 1993).
o Como todos los tratamientos “In Situ”, cuando los costos de excavación son altos el
bioventeo puede ser una alternativa económicamente interesante. No requiere área
adicional para llevar a cabo el tratamiento, ni el uso de maquinaria pesada.
30
Desventajas.
o Tipo y concentración del contaminante.
o Pérdida de nutrientes en el subsuelo.
oonB
teanjiodoc de humedad del suelo y la dificultad de lograr el caudal de aire a
través de la zona contaminada; por ello requiere características especiales del suelo
en cuanto a humedad, porosidad, conductividad hidráulica, etc.
o Requiere largos períodos de tiempo para obtener la concentración final de

hidrocarburos deseada. Los tiempos de limpieza pueden durar de meses a años.
o La descontaminación puede llevarse a cabo por efecto de la volatilización de

compuestos más que por su biodegradación.
3.5.2. Bioestimulación
Esta estrategia radica en adicionar soluciones acuosas que contengan nutrientes como el
nitrógeno y fósforo para mejorar la biodegradación de contaminantes orgánicos o para la
inmovilización de los inorgánicos. Se aplica en suelos contaminados con pesticidas y se ha
comprobado buenos resultados con desechos de municiones. Los nutrientes son necesarios
para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos, los macronutrientes (C, N, P, K) y
en menor cantidad los micronutrientes26. Esta se puede dar en condiciones aerobias o
anaerobias:
 Biodegradación aerobia: en presencia de oxígeno suficiente y otros nutrientes

elementales, los microorganismos degradan los contaminantes orgánicos hasta
convertirlos finalmente en dióxido de carbono, agua y nueva biomasa celular. Según
las condiciones del lugar afectado como la topografía, altitud, clima se puede
utilizar materiales de la zona para mejorar las condiciones de degradación.
 Biodegradación anaerobia: en ausencia de oxígeno, los contaminantes orgánicos

son metabolizados hasta metano, además se obtiene cantidades limitadas de dióxido
de carbono, hidrógeno molecular, ácido sulfhídrico, amoníaco entre los más
importantes.
31
Las características determinantes en la selección, el éxito o el fracaso de esta técnica de

remediación son:
 Tipo de suelo. Los suelos deben ser lo más homogéneos posible, con un valor de
porosidad y permeabilidad al aire adecuado (> 10-10 cm2).
 Deben existir unas condiciones óptimas de pH (6 y 8), de humedad (12-30% en

peso), temperatura entre 0 y 40 ºC y los nutrientes del suelo en relación N:P de 10:1
Ventajas.
o Esta técnica es muy útil en el tratamiento de extensas zonas contaminadas de

centros industriales donde no es posible o conveniente parar el proceso operativo
para realizar el tratamiento requerido
Desventajas
o Esta tecnología no es recomendable para suelos arcillosos, altamente estratificados

o demasiado heterogéneos, ya que pueden provocar limitaciones en la transferencia
de O2.
3.5.3. Bioaumentación.
Esta técnica se aplica cuando los microorganismos de la microflora son insuficientes para
degradar los contaminantes y cuando se requiere el tratamiento inmediato del sitio
contaminado, consiste en la adición de una alta concentración de microorganismos vivos
capaces de degradar los contaminantes. Se ha usado para tratar suelos contaminados con
insecticidas, herbicidas y con desechos con altas concentraciones de metales.
Esta técnica funciona en condiciones de laboratorio o bioreactor, pero en ambientes

externos (suelo o agua) su implantación depende de una serie de factores (Alexander,1999):
 Presencia de toxinas, nutrientes y condiciones ambientales, movilidad y/o

distribución de los microorganismos y la presencia de abundante materia orgánica.
 Los microorganismos añadidos deben sobrevivir a los depredadores y competir con

éxito con la población autóctona antes de ocupar los nichos potenciales.
32
 En general, los ambientes más selectivos y la utilización de consorcios microbianos

favorecen la bioaumentación.
Ventajas.
o No requiere área adicional para llevar a cabo el tratamiento, ni el uso de

maquinaria pesada.
Desventajas.
o El tamaño de la población de microorganismos degradadores crece rápidamente

como respuesta a la contaminación del medio y es muy difícil, si no imposible,
incrementar la población microbiana más allá de esos valores.
3.5.4. Atenuación natural.
Aunque no está considerada como una técnica de remediación está incluida en las técnicas
in situ de bajo costo, consiste en la biotransformación natural es decir utiliza los procesos
físico-químicos que se dan entre el suelo y el contaminante de forma natural. Estos
procesos reducen la concentración de los contaminantes por medio de la dispersión,
volatización, dilución, biodegradación y todas las reacciones que ayuden a la degradación
del contaminante.
Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de la atenuación natural destacan:
 La existencia de unas condiciones geológicas y geoquímicas favorables.
 Las necesidades de reducción de la masa contaminante en un intervalo razonable de

tiempo (meses a años), tanto en la superficie del suelo como en la zona más sub
superficial del mismo.
 Confirmación de la existencia de los tipos y número de poblaciones de

microorganismos que puedan biodegradar los contaminantes.
 La concentración de los compuestos utilizados como aceptores de electrones en

condiciones anaerobias debe ser superior a 0,21 mg/l para nitratos, la de Fe3+ para
33
que pueda ser reducido a Fe2+ debe ser superior a 21,8 mg/l y la de sulfatos mayor
de 0,21 mg/l.
 El potencial redox debe estar situado entre un rango de -400 y 800 mV.
 Deben existir unas condiciones óptimas de pH (6 a 8), de humedad (12 a 30% en

peso), temperatura entre 0 y 40 ºC y los nutrientes del suelo en relación N:P de 10:1.
 Existencia de un coeficiente de retardo favorable para que se produzcan los

fenómenos de sorción con suficiente eficacia.
Si se aportan al medio algunos de los elementos de los que carece o bien se potencian los
existentes, se favorece la eliminación del posible contaminante. En muchos casos este tipo
de intervención será necesario para reforzar el proceso natural o bien para implantar unas
condiciones que reduzcan el riesgo. En esto se basan la
bioestimulación y la bioaumentación, que son aproximaciones biotecnológicas de la
atenuación natural.
Ventajas.
o Es una técnica de biorremediación “In Situ” de muy bajo costo.
o Puede darse en presencia o ausencia de oxígeno, por tanto no se hace necesario

adicionar oxígeno al medio contaminado.
Desventajas.
o La exigencia de protección y el riesgo de los potenciales receptores durante el

tiempo que dura la atenuación.
o Producción y conservación en el medio de subproductos de carácter persistente o

más tóxico que los iniciales, durante y después de la atenuación natural
34
Biorremediación Ex Situ
3.5.5. Tratamiento del terreno o Landfarming.
Utilizada para el tratamiento de residuos oleosos y fangos aceitosos provenientes de

refinerías. La técnica consiste en dispersar el contaminante a biodegradar sobre la capa
arable (15-20 cm superficiales) de un terreno destinado a tal fin. Las recomendaciones y
limitaciones son las mismas que las explicadas anteriormente en el método de
biorremediación in situ. Se trabaja con ésta técnica para todos los hidrocarburos del
petróleo, siendo menos efectiva para petróleos pesados (grandes tanques): <50.000 ppm de
hidrocarburos y <2.500 ppm de metales pesados.
Los factores a tener en cuenta en la aplicación del “Landfarming” son:
 La existencia de unas condiciones geológicas y geoquímicas favorables.
 El manejo de un consorcio microbiano sobre la utilización de un solo morfotipo,

debido a que los morfotipos al estar en grupo pueden tolerar mejor los cambios
físico-químicos en el campo y sus actividades metabólicas pueden interactuar entre
sí para la parcial o final biorremediación.
 Conocer las condiciones ambientales en las cuales se desea que los morfotipos
trabajen, para así poder optimizar la biorremediación, cambiando los posibles
parámetros físicos o químicos que puedan ir en contra de la actividad microbiana en
el material a biorremediar o en el ambiente.
 Resaltar la importancia que tiene la selección de microorganismos autóctonos

(aislados del lugar para la biorremediación), debido a que estos morfotipos se
encuentran mejor adaptados al contaminante; a diferencia de morfotipos foráneos,
que aunque con una gran actividad biorremediadora, pueden no funcionar bajo las
condiciones ambientales del lugar.
Ventajas.
o Es económico con respecto a otras técnicas de biorremediación.

35
o Es un proceso considerado de bajo nivel tecnológico que no requiere exigentes

consideraciones de ingeniería, y a la vez permite una fácil manipulación y control
de las variables de diseño y operación.
Desventajas.
o Requiere grandes extensiones de terreno para disposición de suelos y no es viable si

no se cuenta con suficiente área.
o Cuando los contaminantes son hidrocarburos livianos la remediación puede ser

acelerada por su volatilización, lo cual generaría problemas con las autoridades
ambientales donde las regulaciones de emisiones atmosféricas son exigentes.
o Cuando la contaminación es profunda los costos de excavación y movimiento de

tierras pueden ser altos.
3.5.6. Biopilas.
La técnica conocida como biopilas es un tratamiento de biorrecuperación en condiciones no

saturadas, que consiste en la reducción de la concentración de contaminantes derivados del
petróleo en suelos excavados mediante el uso de la biodegradación a partir de la
construcción de un sistema cerrado que permita controlar lixiviados, hidrocarburos volátiles
y algunas variables de diseño mediante el suministro de nutrientes y oxígeno a través de la
pila del suelo. La técnica consiste en la formación de pilas de material biodegradable de
dimensiones variables, formadas por suelo contaminado y materia orgánica (compost) en
condiciones favorables para el desarrollo de los procesos de biodegradación de los
contaminantes. En el fondo de la pila el sistema cuenta con un aislante que generalmente
son geomembranas o canales plásticos para el control de lixiviados. Estas pilas de compost
pueden ser aireadas de forma activa, volteando la pila, o bien de forma pasiva, mediante
tubos perforados de aireación, con distribución permanente de nutrientes, microorganismos
y aire. En principio, las biopilas se pueden aplicar a la mayoría de los compuestos
orgánicos, siendo más eficaz en los compuestos de carácter más ligero. Entre los factores
que influyen en la aplicación de las biopilas se destacan:
36
 Los hidrocarburos deben ser no halogenados y deben encontrarse en el suelo en

concentraciones menores a 50.000 ppm.
 Dada la necesidad de excavación y posterior depósito del suelo contaminado, se

requiere una superficie de trabajo relativamente grande cuyas dimensiones
dependen del volumen de suelo a tratar.
 Necesidad de una densidad de poblaciones microbianas (>1.000 CFU/gramo de

suelo), condiciones de humedad (40 a 85% de capacidad de campo), temperatura
(10 a 45ºC), textura (baja proporción de arcillas), pH del suelo adecuadas (6 a 8) y
baja presencia de metales pesados (< 2.500ppm).
 La concentración de nutrientes en el suelo cuyo rango normal de C:N:P sea de

100:10:1.
Ventajas.
o Esta técnica es muy eficiente en el tratamiento de residuos con bajas

concentraciones de hidrocarburos.
or Por se un sistema cerrado permite un mayor control de las variables del proceso,
como el control de condiciones climatológicas adversas (baja temperatura o
alto régimen pluviométrico).
o Cuando no se dispone de espacio suficiente para extender el suelo, este sistema

permite construir pilas de suelo cuatro o cinco veces más altas que en una
disposición sobre el suelo (ocupa diez veces menos área) (Zitrides, 1995).
Desventajas.
o Si en el proceso se generan gases o vapores de hidrocarburos volátiles regulados por

la autoridad ambiental, o las condiciones climatológicas de la zona pueden afectar
negativamente la eficiencia del proceso, la pila del suelo se debe cubrir con
membranas o poner techo de forma similar a los invernaderos. Los vapores
generados en el proceso se deben colectar y tratar antes de ser emitidos a la
atmósfera. Lo que incurre a costos adicionales.
37
o Como todos los tratamientos “Ex Situ”, cuando la contaminación es muy profunda,
el movimiento de tierra puede requerir costos más altos.
3.5.7. Tratamiento de biosuspensión.
También conocido como sistema biorreactor. El procedimiento consiste en excavar el suelo

contaminado y luego introducirlo en un reactor añadiendo nutrientes, agua, y los cultivos
microbianos adecuados para que se lleve a cabo la degradación. Se mezcla bien y se airea la
suspensión hasta que las transformaciones de los compuestos seleccionados para su
eliminación alcanzan el nivel deseado. A continuación se detienen el mezclado y la
aireación, y se deja a los sólidos separarse de los fluidos por sedimentación. El sedimento
es retirado y, si la transformación ha tenido éxito, el suelo se devuelve a su lugar de origen,
mientras que los líquidos se tratan como aguas residuales. El suministro de oxígeno puede
realizarse mediante aireación difusa, turbina difusora y aireación superficial (Metcalf y
Eddy, 1991). La tasa de transferencia de oxígeno necesaria es función de la tasa de
degradación de los compuestos orgánicos y de la tasa de crecimiento microbiano. Su
determinación no es fácil de hacer, sin embargo, las tasas de transferencia disminuyen al
aumentar la concentración de sólidos suspendidos. El mezclado y el suministro de
nutrientes también son fundamentales, ya que por el primero se incrementa el contacto
entre los microorganismos y los componentes contaminantes, dando como resultado un
incremento de las velocidades de transferencia de masa y de reacción. Los nutrientes
normalmente optimizan la biorrecuperación por favorecer el crecimiento de los
microorganismos. Por otro lado, el mezclado y la aireación ayudan a romper los flóculos de
tierra y a disolver los contaminantes.
Ventajas.
o En comparación con otros procesos de tratamiento, los reactores vía suspensión

proporcionan mayor contacto entre los contaminantes, los microorganismos, el
oxígeno, el agua y los nutrientes.
o La capacidad de controlar los sistemas del tratamiento vía suspensión es mucho

mayor y por tanto puede ser la tecnología más efectiva.
38
o El tratamiento vía suspensión puede aplicarse en particular a los suelos

contaminados con residuos oleosos y de consistencia alquitranada (siendo estos
compuestos difíciles de biodegradar).
o Es más rápido y requiere menos superficie que otros sistemas.
Desventajas.
o Debido al energético mezclado y a la aireación forzada se favorece el escape de

emisiones de aire, por ello la suspensión no es una buena elección para suelos donde
los compuestos volátiles sean mayoría.
o Esta técnica demanda mayores costos monetarios en comparación con otras

técnicas de biodegradación.
3.7 ETAPAS DEL TRABAJO PARA UNA BIORREMEDIACIÓN MÁS EFICAZ
3.7.1. Investigación y caracterización de la contaminación y del emplazamiento
 La caracterización del emplazamiento se lleva a cabo mediante el estudio del mismo

detallando la volumetría del suelo a tratar, las condiciones geológicas e
hidrogeológicas, analizando las características del suelo y sus propiedades (pH,
granulometría, humedad, porosidad, etc.)
 La caracterización del contaminante se centra en la investigación del tipo y

concentración del mismo, así como la biodisponibilidad de los compuestos en el
suelo (aceptores de electrones, metales pesados, nutrientes, etc.).
3.7.2. Análisis y elección de las medidas biocorrectivas.
Para ello se hace necesario:
a) Identificar y cuantificar los contaminantes. Definiendo sus propiedades

fisicoquímicas más importantes:
39
 Identificación y clasificación de compuestos.
 Concentración en suelos y aguas subterráneas.
 Caracterización de la presión de vapor, constante de Henry, densidad y grado de

solubilidad.
b) Conocer los factores que influyen en la transformación biológica de los

contaminantes:
 Factores ambientales tales como humedad, oxígeno disuelto, temperatura, pH,

disponibilidad de nutrientes.
 Factores microbiológicos tales como presencia de microorganismos y aclimatación

de las poblaciones microbianas.
c) Designar las medidas biocorrectivas. En función de los factores anteriormente

expuestos, se debe elegir el sistema de biotratamiento más adecuado
3.7.3. Diseño y evaluación del sistema.
Para el diseño de un sistema de biorrecuperación es necesario establecer unas etapas de

trabajo, en las cuales se determinan y evalúan los parámetros fundamentales necesarios
para su eficacia. Las etapas a seguir en el diseño de un sistema de biotratamiento son:
a) Evaluación de la viabilidad de la técnica. Se deben estudiar los parámetros de

evaluación que definen el sistema elegido, así como se deben evaluar las
condiciones de biotratabilidad, los objetivos de limpieza exigidos y los costes de
tratamiento necesarios.
b) Evaluación del diseño. Se deben estudiar los factores que afectan la eficacia de la
técnica y las posibles mejoras o acondicionamientos a aplicar.
c) Evaluación del control y seguimiento. Para asegurar la correcta ejecución y un

progreso adecuado del tratamiento se debe llevar a cabo un plan de control y
40
seguimiento del sistema. Para una correcta optimización se deberán controlar los
siguientes puntos:
 Control de las condiciones de degradación y biodegradación. Se debe

registrar la variación de concentración de TPH, BTEX, CO2 desprendido y
Oxígeno disuelto, variación de nutrientes (N, P, etc.)
 Control de los parámetros que afectan directamente en el funcionamiento del

sistema.
3.7.4. Análisis e interpretación de resultados.
En esta última etapa se deben analizar los resultados obtenidos, haciendo un balance de los
objetivos alcanzados y los marcados inicialmente. En este punto, si fuese necesario, se
deben proponer y estudiar aquellas mejoras o modificaciones necesarias para la
optimización del sistema
41
4. RESULTADOS
4.1 ENSAYOS DE TRATABILIDAD EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS

CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS.
Para evaluar si un tratamiento biológico es apropiado para la descontaminación de un suelo,

es necesario caracterizar tanto las poblaciones microbianas como la biodegradabilidad de
los contaminantes del suelo. Además, debido a que existen una gran variedad de parámetros
fisicoquímicos y biológicos que condicionan el proceso de biorremediación, también es
necesario evaluar la influencia de los factores que afectan al proceso de la biodegradación.
Para ello se diseñan los ensayos de tratabilidad, que se definen como conjunto de
experimentos realizados a escala de laboratorio, previos a la implementación de cualquier
tecnología de biorremediación a un suelo contaminado (Cattaneo et al., 1997; Dibble y
Bartha, 1979; Zhouet al., 1995). Los ensayos de tratabilidad representan una parte muy
pequeña de los costes totales de recuperación de cualquier emplazamiento y, sin embargo,
la información que pueden proporcionar es fundamental ya que pueden disminuir el coste
final, y lo que es más importante, aumentar las posibilidades de éxito en la
descontaminación del suelo.
Primero se debe llevar a cabo una caracterización microbiológica, y determinar la cantidad

de población microbiana degradadora de los contaminantes y su proporción respecto a la
población total heterótrofa de la microbiota indígena del suelo contaminado. Además es
necesario evaluar si la población microbiana autóctona está metabólicamente activa o es
activable en condiciones de bioestimulación. Una vez caracterizado el suelo, los
contaminantes y la población microbiana, es necesario determinar la biodegradabilidad de
los contaminantes mediante ensayos rápidos de biodegradabilidad (fase I) y en caso
afirmativo evaluar los factores fisicoquímicos y biológicos que afectan a la biodegradación
(fase II), en ensayos de microcosmos.
42
4.2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DE TRATABILIDAD
Los ensayos de biotratabilidad incluyen 2 fases de estudio
SUELO CONTAMINADO
Fase I: 15 dias duración

Caracterización físico-quimica
Textura
Capacidad de campo
Conductividad y PH
NT y COT
Nitrato, nitrito,amonio, fosfato
EOT, HTP
Caracterización Microbiológica
Heterotrofos totales
Degradadores de hidrocarburos
Caracterización de la actividad metabólica
Respirometría: producción de CO2
Ensayos de biodegradabilidad en slurries
Fase II: 6 meses duración

Mesocosmos (30 Kg suelo cada mesocosmo):
Bioestimulación: aireación, humedad,
fertilizantes inorgánicos N, P, K.
Bioaumento: Utilización de consorcios

microbianos
Figura 4: Fases de estudio presentes en el estudio de tratabilidad de un suelo contaminado

por hidrocarburos.
43
Donde:
NT: Nitrógeno total.
COT: Carbono orgánico total.
EOT: Extracto orgánico total.
HTP: Hidrocarburos totales del petróleo.
HAP’s: Hidrocarburos aromáticos policíclicos.
La fase I: Estudio a corto plazo, basado en una caracterización físico-química,

microbiológica y ecotoxicológica del suelo. Se lleva a cabo un estudio respirométrico del
suelo (producción de CO2) en diferentes condiciones de bioestimulación, para determinar si
la microbiota presente en el suelo es activa metabólicamente o potencialmente activa.
También se lleva a cabo un ensayo de Microtox como indicador de la presencia de posibles
inhibidores y ensayos rápidos de biodegradabilidad en slurries (resuspensiones del suelo en
agua y nutrientes inorgánicos). Los resultados obtenidos en la primera fase del protocolo
tienen como objetivo determinar si el suelo contaminado es apto para aplicar la tecnología
de la biorremediación.
La fase II: Estudio a medio-largo plazo en mesocosmos con 30 kg de suelo, donde se

evalúan distintos tratamientos de bioestimulación y bioaumento.
Objetivo general
 Diseñar un protocolo de ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio, para la

biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos.
Objetivos específicos
 Comprobar la biodegradabilidad de los contaminantes.
 Optimizar su actividad metabólica.

44
4.3 MATERIALES Y METODOS
4.3.1. Materiales.
 Materiales de vidrio.
 Medios de cultivo.
 Equipos y aparatos.
 Suelo contaminado.
4.3.2. Ensayos con mesocosmos.
Los materiales son:
 Suelo contaminado de la zona a tratar.
 Suelo con microorganismos adaptados a la presencia de hidrocarburos.
 Nutrientes (Nitrógeno, Fosforo, Potasio).
 5 canastas de polietileno de alta densidad. Este material fue escogido por su baja
permeabilidad y mínima absorción de hidrocarburos.
 Palas de jardinería para mezclar el sedimento.
Para la comparación del efecto de bioaumentación y bioestimulación se trabajan con 5

mesocosmos y se distribuyen de la siguiente manera:
Mesocosmos N°1: (B+F: bioaumentado con fertilizante inorgánico).
 30 Kg de suelo contaminado.
 3 litros de cepas bioaumentadas (TX4, TX5, T2X-1).
 2 litros de agua destilada.

45
 Fertilizantes inorgánicos (NPK: 20:20:1), correspondiendo por cada kilogramo de

tierra: 1,62 g de NO3NH4, 0,067 g de (NH4)2HPO4 y 0,087 g de K2HPO4.
Mesocosmos N°2: (B-F: bioaumentado sin fertilizante inorgánico).
 3 litros de cepas bioaumentadas (TX4, TX5, T2X-1).
 2 litros de agua destilada.
Mesocosmos N°3: (N+F: nativo con fertilizante inorgánico).
 5 litros de agua destilada
 Fertilizantes inorgánicos (NPK: 20:20:1), correspondiendo por cada kilogramo de

tierra: 1,62 g de NO3NH4, 0,067 g de (NH4)2HPO4 y 0,087 g de K2HPO4.
Mesocosmos N°4: (N-F: Nativo sin fertilizante inorgánico).
 5 litros de agua destilada
Mesocosmos N°5: (C: Control).
 30 Kg de suelo no contaminado.
Para el proceso de biodegradación bacteriana, se seleccionan consorcios bacterianos de

acuerdo a su capacidad degradativa y emulsificante (Pseudomonas aeruginosa TX-5,
Acinetobacter calcoaceticus T2X-1, Bacillus sp. TX-4) y por otro lado, para el proceso de
bioestimulación se selecciona una mezcla de componentes inorgánicos y se formuló la
concentración de estos fertilizantes inorgánicos, de la siguiente manera (C/N: 100:1 y NPK:
20:20:1).
46
Se utiliza:
NO3NH4, como fuente de nitrógeno.
(NH4)2HPO4, como fuente de fósforo.
K2HPO4, como fuente de potasio.
Se consideraron los rangos óptimos de los factores que influyen en la degradación de

hidrocarburos totales (Tabla 2).
Tabla 5: Rangos óptimos para procesos de biorremediación.
PROPIEDAD RANGO REFERENCIA

Temperatura (°C) 18° - 30° Gómez, S., et al, 2008
pH (unidades) 6–8 Ríos, R., 2005
Humedad (% capacidad de campo) 20% - 75% Gómez, S., et al, 2008
Nutrientes N:P:K 20:20:1 Gómez, S., et al, 2008
Microorganismos degradadores
10^6 – 10^8 Ríos, R., 2005
(UFC)
Fuente: Ñustez Cuartas, Diana. (11)
Tabla 6: Análisis de características físicas.
ANALISIS MÉTODO FRECUENCIA

Temperatura Termómetro
Estas características
pHmetro (1 suelo:2,5
pH se miden una vez a la
agua)
semana
Humedad Método gravimetrico
A estos mesocosmos también se les realizó un volteo manual tres veces por semana para
incrementar el contenido de oxígeno.
47
Tabla 7: Cantidad de agua aplicada y volteos manuales por semana.
DIAS DE LA SEMANA ACTIVIDAD CANTIDAD DE AGUA

Lunes A todos los mesocosmos 600 ml
Miércoles se les adiciona agua y 600 ml
Viernes volteo manual 1000 ml
En cada evento de muestreo, se utilizan guantes de látex desechables, palas de jardinería,

las cuales de un mesocosmos a otro se enjuagan previamente con agua y una esponja, para
evitar contaminación cruzada, se realiza el volteo manual y se toma sedimento de puntos
aleatorios dentro de cada mesocosmo con la pala aproximadamente 20g hasta alcanzar unos
100 a 160g, muestra compuesta, para los diferentes análisis de laboratorio.
Para este fin se realizan los siguientes análisis desde el inicio de los montajes
experimentales, a través del tiempo de la investigación (6 meses):
4.3.3. Análisis fisicoquímico del suelo.
 Determinación de la textura del suelo: Es la cantidad relativa de arenas, limos y

arcillas expresadas en porcentaje (%) de la fracción mineral del suelo una vez
tamizado por un tamiz de 2 mm de diámetro de malla. Para determinar la textura de
un suelo se utiliza la técnica de la sedimentación según Gee y Bauder (1986).
(ANEXO A.1)
 Determinación de la humedad y la capacidad de campo: La humedad de un suelo

se define como la cantidad de agua que existe en un suelo, referida en porcentaje (%
p/p). Se calcula por la diferencia de peso entre una misma muestra húmeda, y
después de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante. (Ver
ANEXO A.2).
48
La capacidad de campo, es a la cantidad máxima de agua (expresada en valores de

humedad) que es capaz de retener el suelo justo en el momento que llega al estado
de saturación. Para su determinación es necesario saturar el suelo con agua, y
eliminar el exceso de agua por gravedad. Finalmente, se determina el contenido de
agua (humedad) del suelo cuando ya no se libera agua por escorrentía. Para ello se
emplean viales de plástico de 100 ml de capacidad nominal, que se perforan en su
base (1 cm de separación entre poros) y se añade fibra de vidrio para evitar que se
escape el particulado del suelo cuando se encuentre colmatado de agua. Luego se
añaden 30 gramos de suelo secado 16h a 105ºC, y se tara el conjunto.
Posteriormente se colmata el suelo con agua y se deja que el exceso de agua se
elimine por gravedad.
Finalmente se determina la humedad del suelo saturado (cuando ya no pierde agua

por gravedad), obteniéndose así lcaapacidad de campo del suelo.
 Determinación del carbono orgánico total (COT) y del nitrógeno total (NT):
 Carbono orgánico total (COT): Se determina en un analizador de carbono

con una cámara de combustión y un detector de infrarrojo. (Ver ANEXO
A.3)
 Nitrógeno total (NT): Se determina con el método Micro- Kjeldahl

(Modificado por Bremner, 1965). (Ver ANEXO A.4)
 Determinación de la concentración de nutrientes inorgánicos
 Fosfatos: Para determinar los fosfatos se utiliza el método de Bray

(desarrollado por Bray y Kurtz, 1945), el cual fue modificado en la parte de
extracción del P. La cuantificación se lleva a cabo por colorimetría. Este
método se emplea como índice del P aprovechable en suelos con pH neutro
y ácido (NOM-021-RECNAT-2000). (Ver ANEXO A.5)
49
 Nitratos, nitritos: Determinación de nitritos y nitratos intercambiables en

suelo por extracción con cloruro de potasio (KCl 1M) y determinación por
electroforesis ión capilar (EIC). (Ver ANEXO A.6)
 Amonio: Determinación de amonio intercambiable en suelo por extracción

con cloruro de potasio (KCl 1M) y determinación por electrodo de ión
selectivo. (Ver ANEXO A.7)
 Determinación del pH: El pH determina el grado de adsorción de iones por las

partículas del suelo, afectando así su solubilidad, movilidad, disponibilidad y
formas iónicas de un contaminante y otros constituyentes del suelo (Alexander
1994). La solubilidad de muchos contaminantes inorgánicos cambia en función del
pH y normalmente su movilidad disminuye con altos valores de pH. La
determinación del pH en suelo se realiza según el método de la pasta saturada en
una suspensión de suelo:agua en proporción 1:2,5 (p/v). Para ello se resuspenden 10
g de suelo en 25 ml de agua, se agita la mezcla durante 40 minutos y se mide el pH
en un Crison micro pH 2000. La medición se realizó semanalmente en cada uno de
los mesocosmos. (Ver tabla de pH ANEXO A.8)
 Determinación de la conductividad eléctrica: El método de la conductividad

eléctrica se realiza por medio de un conductímetro sobre una muestra de agua o
extracto de suelo. (Ver ANEXO A.9)
 Extracto orgánico total (EOT): Para obtener el EOT de las muestras de suelo de los
mesocosmos se lleva a cabo una extracción por Soxhlet de 10 gramos de suelo
tamizado por 2 mm, mientras que en la fase de los slurries, se filtran en papel de
filtro (previamente limpiado con diclorometano) y se deja secar el contenido entre 1
y 3 días para poder llevar a cabo la extracción del EOT por Soxhlet. Para ello (en
ambos casos), antes de la extracción se añade ortoterfenil y antraceno-d10 como
50
estándares internos de tipo surrogate a una concentración final en el suelo de 80 μg

g-1 y 40 μg g-1 respectivamente, a partir de stocks de 1mg ml-1 en acetona. Se deja
evaporar la acetona y, a continuación, se añaden 10 g de Na2SO4 anhidro y se
mezcla el conjunto. A partir de esta mezcla, se lleva a cabo la extracción en Soxhlet
durante 24 horas, utilizándose como solvente la mezcla diclorometano:acetona, en
proporción volumétrica 1:1. El extracto orgánico resultante (100 ml) se deshidrata
en una columna de Na2SO4 anhidro (10cm longitud x 2,5 cm ancho) y
posteriormente se evapora en un rotavapor (Büchi) hasta 1 ml final.
 Hidrocarburos totales del petróleo (HTP): Se realiza mediante extracción por

reflujo soxhlet, empleando hexano como disolvente, este método de extracción
asegura el contacto de la matriz de la muestra con el disolvente, para la óptima
extracción de los compuestos el suelo se seca, se pulveriza en partículas pequeñas,
para asegurar un mejor contacto, se evapora el solvente al final de la prueba y el
extracto se cuantifico gravimétricamente (EPA 3540C., 1996). (ANEXO A.9).
 Temperatura: Se lleva a cabo semanalmente en cada uno de los mesocosmos. Se

utiliza un termómetro de mercurio.
4.3.4. Características microbiológicas.
 Determinación de la población microbiana heterótrofa y degradadora de

hidrocarburos: Para el conteo de heterótrofos totales y degradadores de
hidrocarburos del suelo se utiliza la técnica de cuenta por dilución en placa
(ANEXO B).
4.3.5. Características de la actividad metabólica
 Ensayos de respirometría:
La respirometría es una técnica basada en la medición del consumo de oxígeno por parte de
los microorganismos que degradan y oxidan un sustrato orgánico convirtiéndolo en CO2 y
agua. El análisis respirométrico arroja datos sobre el consumo de O2 por el metabolismo
microbiano en presencia de un sustrato orgánico.
51
La respiración inducida con sustrato (SIR), se da al adicionarse un sustrato al suelo, en este

caso el contaminante a degradar. La respiración está influenciada por la humedad del suelo,
la temperatura, la disponibilidad de nutrientes y la estructura del suelo (Alef y Nannipieri,
1995), la temperatura de incubación puede oscilar entre 20ºC y 30ºC y la capacidad de
retención de agua en el suelo puede variar entre 50-70 %.
La respiración del suelo se determina mediante la técnica de incubación del suelo en jarras
cerradas, en ésta el CO2 es absorbido en una solución de NaOH y cuantificado por
titulación con HCl.
 Procedimiento: Se pesan 50 gr de suelo de cada uno de los tratamientos y

del control en un beaker y se colocan en el fondo de una jarra de 1L. Se
pipetean 25 ml de solución de NaOH (0.05M) e inmediatamente se sella la
jarra para atrapar el aire presente en la parte superior de la misma. El control
del procedimiento se realiza llenando de 3-5 jarras con NaOH (0.05 M) pero
sin muestra de suelo. Se incuban todas las jarras durante 3 días a 25°C – el
investigador de acuerdo a la producción de CO2 determinara el tiempo
mínimo de incubación, el tiempo máximo no deberá superar los 3 días,
periodos superiores de incubación podrían generar condiciones anaeróbicas,
además sería imposible cuantificar la producción de CO2-. El procedimiento
se lleva a cabo por 61 días.
 Estimación de la cantidad de CO2 producido por los microorganismos:

se abren las jarras y se sacan los beakers. Se lava la superficie externa con
agua libre de CO2, para garantizar que toda la solución de NaOH quede al
interior de la jarra. Se adicionan 5 ml de solución de BaCL2 (0.5 M) y
algunas gotas de indicador-felnolftaleina-, para la titulación, se adiciona gota
a gota una solución de HCl bajo continua agitación hasta que se presente el
cambio de color.
Para obtener la solución de cloruro de bario se disolven 122.14 gr de BaCL2. En agua

descarbonatada hasta completar 1 L. El agua descarbonatada se obtiene hirviendo el agua
52
destilada por espacio de 2 minutos, se deja enfriar y se mantiene en un frasco con trampa de
CO2.
La velocidad de respiración se calculó con la siguiente relación:
Donde:
Vo: volumen en mililitros de HCL gastado para titulación de los blancos.
V: volumen en mililitros de HCL gastado para titulación de las muestras (promedio).
dwt: es el peso seco de un (1) gramo de suelo húmedo y 1.1 es un factor de conversión (1
ml de NAOH 0.05M es igual a 1.1 mg de CO2). Para el caso del HCL y el NAOH 1 M es
equivalente a 1N.
 Ensayos de toxicidad.
La determinación de la toxicidad se lleva a cabo mediante el test de Microtox. Este ensayo

se basa en el principio de que cuanto mayor es la toxicidad de una muestra (para Vibrio
fisheri), menor es la emisión de luz. En el ensayo de Microtox se determina la EC50, la cual
se define como la concentración de la muestra en la que se observa una disminución del
50% de la emisión de luz original de Vibrio fisheri. Para ello se estudia el efecto de
diferentes concentraciones problema en la emisión de luz mediante un fotomultiplicador.
Posteriormente se obtiene, matemáticamente, la EC50 a partir de la función dosis respuesta.
Para ello, se reconstituyen liofilizados comerciales de Vibrio fisheri según las instrucciones
del fabricante y se incuban a 15ºC durante 30 minutos, frente a un banco de diluciones de
lixiviados de suelo o de EOT de suelo. Los lixiviados de suelo se obtienen de acuerdo al
protocolo de Microtox en fase sólida, según instrucciones del fabricante. Para obtener los
lixiviados de suelo se resuspenden 7 g de suelo en 35 ml de NaCl 3,5% (p/v) y se agita
53
durante 10 minutos con muesca magnética. Luego se filtran 5 ml (2 cm por debajo de la

superficie) en filtros de 0,45 μm de diámetro de poro y se hace un banco de diluciones del
lixiviado filtrado con NaCl 3,5% como solvente. El EOT del suelo se diluye en un banco de
diluciones con DMSO como solvente.
54
5. CONCLUSIONES
 Se presentaron los diferentes tratamientos existentes de biorremediación para suelos

contaminados con hidrocarburos, de lo que se puede desprender que, tanto los
tratamientos ex-situ como in-situ son una buena alternativa para conseguir degradar
el contaminante, siendo los tratamiento ex-situ los que mejores resultados presentan,
ya que las variables pueden ser mejor controladas, es un tratamiento costoso a causa
del transporte del terreno contaminado a la zona de tratamiento. El tratamiento in
situ es el más recomendado para suelos permeables cuando la contaminación afecta
a los horizontes subsuperficiales.
 Se identificaron factores principales, como componentes del conjunto de acción

directa en los tratamientos de biorremediación resaltando que para cualquier
tratamiento de biorremediación la velocidad de descomposición por los organismos
va a depender de su concentración, de determinadas características del suelo
(disponibilidades de oxígeno y de nutrientes, pH, humedad y temperatura) y de la
estabilidad del contaminante.
 Se diseñó un protocolo de ensayos de tratabilidad, a escala de laboratorio, previo a

la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos que consta de 2 fases
de estudio.
A. En la fase I se evalúa la presencia de poblaciones microbianas, la actividad

metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes
presentes en el suelo.
B. En la fase II se estudia la optimización de las condiciones fisicoquímicas

(humedad, aireación, nutrientes inorgánicos) y biológicas (posibilidad de
inocular poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el
proceso de biodegradación durante la biorremediación de suelos
contaminados por hidrocarburos.
 La información obtenida en la fase I de los ensayos de tratabilidad, permite decidir,

en un corto intervalo de tiempo, si es factible la aplicación de la biorremediación en
55
un suelo contaminado, mientras que la fase II permite establecer las condiciones

óptimas de biorremediación en procesos aeróbicos.
croLoorgsanmisimos son los principales responsables de la degradación de

hidrocarburos en los ecosistemas acuáticos y terrestres.
 En el caso de los hidrocarburos, la degradación aeróbica es la ruta más favorable de

degradación. Aunque se han descrito degradaciones anaerobias, el principal proceso
para eliminarlos es la respiración aeróbica de los microorganismos implicados. La
tasa de degradación es directamente proporcional a la disponibilidad de oxígeno, ya
que es utilizado como aceptor final de electrones y también como sustrato en las
reacciones catalizadas por las oxigenasas, enzimas implicadas en la ruta aeróbica
bacteriana de degradación de los hidrocarburos.
6. COMENTARIOS
 La mayoría de las técnicas innovadoras que existen en la actualidad para el

tratamiento de los suelos contaminados requieren equipos especiales y consumos
elevados de recursos energéticos y de otro tipo para su aplicación.
 La biorremediación es el tratamiento más apropiado a seguir en suelos

contaminados con hidrocarburos por sus ventajas conocidas.
 Al dejar el suelo sin tratar, es decir, permitir la atenuación natural, requeriría

demasiado tiempo y dependiendo de las concentraciones y tipo de contaminante no
se puede asegurar la recuperación del suelo puesto que algunos componentes no son
degradables total o parcialmente.
 El proceso ex situ permite un mayor control de los procesos de remediación,

mediante el movimiento de tierra los agregados se disgregan, teniendo los
microorganismos más probabilidad de entrar en contacto con el contaminante para
la degradación del mismo.
56
 La Presencia del agua es necesaria para la transformación de los hidrocarburos,

debido a que los microorganismos requieren condiciones mínimas de humedad para
su crecimiento. Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir
la concentración del oxígeno en el suelo.
 Debido a que los sitios contaminados por lo general no presentan la actividad

biológica necesaria para que se produzca la degradación de los contaminantes, es
conveniente introducir al medio, microorganismos, cuya efectividad haya sido
probada previamente.
 En términos generales, las tecnologías de remediación fisicoquímicas pueden usarse

para tratar sitios con características geológicas difíciles, sus costos no son
demasiado elevados y los tiempos de limpieza son de corto a mediano plazo. Con
las tecnologías térmicas es posible disminuir significativamente los tiempos de
limpieza, aunque generalmente es necesario excavar el sitio contaminado y es el
grupo de tratamientos más costoso.
 Como regla general, cuando un sitio se encuentra contaminado con más de un tipo
de contaminantes, puede ser necesario emplear una combinación de varias
tecnologías de remediación, en lo que se conoce como «tren de tratamiento».
 En general, la contaminación de suelos por productos, compuestos o desechos

orgánicos de la industria petrolera pueden ser tratados y recuperados
ecológicamente con la biorremediación, basada en la estimulación de los
microorganismos para adecuación de los factores abióticos.
 Así mismo podría indicarse que en suelos de textura contrastantes como los
arcillosos y arenosos, deben emplearse acondicionadores orgánicos que permitan
mejorar la estructura de la mezcla para favorecer así la biorremediación.
 Para definir el tratamiento más apropiado es necesario un estudio previo de las

características edáficas del suelo y el nivel de contaminación que presenta, con el
fin recuperar sus características biológicas y morfológicas.
57
7. RECOMENDACIONES
 Es deseable mejorar la actividad microbiana de organismos indígenas, más que usar

microorganismos exógenos porque los microorganismos indígenas están
aclimatados al material de desecho.
 Con respecto al pH:
A. La acidez del suelo se puede reducir a través de aplicaciones de piedra

caliza.
B. La alcalinidad del suelo se puede reducir a través de la aplicación de

fertilizantes ácidos u otros materiales tales como amonio, sulfato, flor de
azufre o sulfato férrico.
58
8. REFERENCIAS
1. Orosco Verdezoto, Verónica Paulina y Soria Guano, Mercedes Margarita. TESIS DE

GRADO, BIORREMEDIACIÓN DE VEGETACIÓN CONTAMINADA CON PETRÓLEO POR
DERRAMES EN EL CAMPAMENTO GUARUMO - PETROPRODUCCIÓN. Riobamba : Escuela
Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias, Escuela de Ciencias Químicas,
2008.
2. Cando Rodríguez, Miguel Ángel. DETERMINACIÓN Y ANÁLISIS DE UN PROCESO DE
BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS. Cuenca :
Universidad Politécnica Salesiana, 2011.
3. Torres Delgado, Katerine y Zuluaga, Montoya Tatianan. BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS
CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS. Medellín : Universidad Nacional de Colombia,
Facultad de Minas, Ingeniería Química, 2009.
4. Samanez Gibaja, Elizabet. Biodegradación bacteriana por bioestimulación en suelos
contaminados con petróleo crudo. [En línea] FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
UNIDAD DE POST GRADO; UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS , 2008.
http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2008/samanez_ge/pdf/samanez_ge.pdf.
5. Riojas González, Héctor, y otros, y otros. Efectos de los surfactantes en la
biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos. [En línea] Departamento de
Recursos Naturales. Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de Febrero 818 Sur,Colonia Centro,
Cd. Obregón, Sonora, México. C.P. 85000; UPIBI-Instituto Politécnico Nacional, Av
Acueducto s/n Colonia Barrio La Laguna Ticoman. México, D.F. C.P. 0, 12 de Diciembre de
2010. [Citado el: ] http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v9n3/riojas.pdf.
6. Ortiz Bernad, Irene, y otros, y otros. Informe de Vigilancia Tecnologica. [En línea]
http://www.madrimasd.org/informacionidi/biblioteca/publicacion/doc/vt/vt6_tecnicas_r
ecuperacion_suelos_contaminados.pdf.
7. Montenegro Gallardo, Fabian. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS BACTERIANAS
NATIVAS DE SUELOS DE LA XII REGIÓN DE CHILE, PARA LA DEGRADACIÓN DE CRUDOS DE
PETRÓLEO. [En línea] 2007.
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2007/fam777a/doc/fam777a.pdf.
8. Mallea Alvarez, María Isabel. REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS Y ANÁLISIS
DE UN PROYECTO PILOTO EN CHILE, EN EL MARCO DEL SISTEMA DE EVALUACIÓN DE
IMPACTO AMBIENTAL . [En línea]
http://www.achidam.cl/documentos/Remediaciondesueloscontaminados.pdf.
9. Schmidt, Wini. SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS. [En línea]
http://www.ingenieroambiental.com/3021/Bioremed_Mex2.pdf.
10. Remediation trials for hydrocarbon-contaminated sludge from a soil washing. García
Frutosa, F. J., y otros, y otros. 2011, Journal of Hazardous Materials, pág. 10.
11. Bioventing remediation and ecotoxicity evaluation of phenanthere - contaminated soil.
García Frutos, Francisco Javier, y otros, y otros. 2010, Journal of Hazardous Materials,
pág. 8.
59
12. Viñas Canals, Marc. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos:

caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Universitat de Barcelona :
Facultat de Biologia - Departament de Microbiologia, Abril de 2005.
13. Instituto Mexicano del Petróleo, Secretaría de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, Instituto Nacional de Ecología. Manual de técnicas de análisis de suelos
aplicadas a la remediación de sitios contaminados. 2006. ISBN 968-489-039-7.
14. Ñustez Cuartas, Diana Cristina. Biorremediación para la Degradación de Hidrocarburos
Totales Presentes en los Sedimentos de una Estación de Servicio de Combustible. [ed.]
Universidad Tecnológica de Pereira. s.l. : Facultad de Ciencias Ambientales, 2012. Proyecto
de Grado presentado como requisito para optar al título de Magister en Ecotecnología.
60
9. ANEXOS
ANEXO A : ............................................ANALISIS FISICOQUIMICO DE UN SUELO.

.............................................................................................................................................. 62
A.1 Tabla de textura de suelo. .................................................................................. 62

A.2 Humedad ............................................................................................................62
A.3 Carbono orgánico total (COT) ...........................................................................63
A.4 Nitrógeno total (NT) .......................................................................................... 66
A.5 Fosfatos ..............................................................................................................70
A.6 Nitratos y nitritos ............................................................................................... 75
A.7 Amonio intercambiable. ..................................................................................... 78
A.8 pH ....................................................................................................................... 81
A.9 Conductividad eléctrica ..................................................................................... 81
A.10 Extracción y cuantificación de Hidrocarburos totales de petróleo.......................... 84
ANEXO B :............................................. CARACTERISTICAS MICROBIOLÓGICAS.

.............................................................................................................................................. 88
ANEXO C : .......... CUANTIFICACION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN SUELO.

.............................................................................................................................................. 91
ANEXO D : .................. TIPOS DE BACTERIAS MÁS COMUNES USADAS EN LOS

PROCESOS DE REMEDIACIÓN ................................................................................... 93
ANEXO E :................. Límites máximos permisibles para fracciones de hidrocarburos.

.............................................................................................................................................. 94
ANEXO F : .................. CLASIFICACIÓN DE TECNOLOGÍAS DE REMEDIACIÓN.

.............................................................................................................................................. 95
ANEXO G : ....................................... TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN MÁS USADAS.

.............................................................................................................................................. 97
61
ANEXO H : .........................................................................DE MEDIOS Y REACTIVOS.

............................................................................................................................................ 102
62
ANEXO A : ANALISIS FISICOQUIMICO DE UN SUELO.
A.1 Tabla de textura de suelo.
TIPO DE SUELO TAMAÑO DE PARTICULAS

Grava > 2 mm
Arena 0.2 a 2 mm
Arena fina 0.02 a 0.2 mm
Limo 0.002 a 0.02 mm
Arcilla < 0.002 mm
Primero se elimina la materia orgánica, mezclando 20 gramos de suelo tamizado por 2 mm,
con 50 ml de H2O2 en una botella de vidrio de 1000 ml, y se deja reposar hasta que la
efervescencia desaparezca. Luego se añaden 40 ml de dispersante (NaPO3)6 1N, y se lleva
el conjunto a un baño de ultrasonidos durante 10 minutos para desagregar el cemento
interparticular. Posteriormente, se lleva todo el contenido a una probeta de vidrio de 1000
ml de capacidad y se enrasa a un volumen final de 1000 ml con agua desionizada y se
mezcla por inversión durante 2 minutos tapando la probeta con Parafilm y se deja
sedimentar el particulado, recogiendo volúmenes de 5 ml de la suspensión a 5 cm de la
superficie en diferentes momentos según la ley de Stockes. Se obtiene una alícuota inicial
justo después de la agitación inicial, para determinar el peso seco del conjunto de arenas,
limos y arcillas. Los limos y arcillas se recogen a los 40 segundos y los limos a las 2 horas.
A.2 Humedad
La humedad del suelo se calcula por la diferencia de peso entre una misma muestra
húmeda, y después de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante.
Material y equipo
 Muestras de suelo.
 Balanza analítica.
 Espátula.
63
 Charolas o papel aluminio a peso constante.
 Estufa.
Procedimiento
1) Pesar 1 g de muestra sobre un papel o charola de aluminio a peso constante.
2) Colocar la muestra dentro de la estufa a 80ºC de 12 a 24 horas.
3) Sacar la muestra de la estufa y colocarla dentro de un desecador para que se enfríe.
4) Pesar la muestra con todo y papel.
5) Calcular los porcentajes de humedad en el suelo por la diferencia de pesos.
% Humedad del suelo = (Peso inicial – Peso final)/ Peso inicial * 100
A.3 Carbono orgánico total (COT)
Material y equipo
 Muestra de suelo seco y molido en mortero.
 Cápsulas de porcelana especiales para el equipo de carbono total.
 Espátulas.
 Analizador de carbono con detector de infrarrojo y accesorio para muestras sólidas.
 Pinzas.
Reactivos
 Biftalato de potasio (C6H4(COOK)).

64
Procedimiento
Esta técnica puede realizarse con muestras de suelo húmedo, pero se recomienda utilizar
suelo seco y molido para homogeneizar la muestra, ya que se utilizan cantidades muy
pequeñas (menores que 0.3 g).
1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) dentro de una cápsula de porcelana.
2) Encender el analizador de carbono y esperar a que la temperatura del horno llegue a

900oC. Una vez que el equipo esté estabilizado a esta temperatura, se procede a
analizar las muestras.
3) El método utilizado para hacer los análisis en este equipo debe indicar que se está
utilizando el accesorio para muestras sólidas; y en caso de contar con un software
para la integración de los datos se debe incluir la curva patrón, para que el resultado
de la medición se proporcione con base en ésta.
4) Colocar la muestra dentro de la cámara de sólidos y proceder a la medición.
5) El tiempo de corrida de cada muestra es aproximadamente de cinco minutos. Al

final el software presenta la cantidad de carbono (mg kg-1 suelo o en porcentaje)
contenido en el suelo.
6) El resultado debe ser ajustado por la humedad de la muestra, para indicarlo en mg

de C/kg suelo completamente seco.
Curva patrón. Se realiza con biftalato de potasio (C6H4(COOK)) en un rango de

concentraciones de 0 a 25 mg (0 a 0.025 g) de carbono contenido en este compuesto. El
biftalato debe secarse en la estufa durante 12 horas a 60ºC antes de ser analizado. Pesar la
cantidad necesaria del reactivo para obtener la concentración deseada (de 0 a 25 mg de
carbono en la muestra), como se indica en la tabla C1 del anexo C y hacer la medición de
carbono orgánico total en el analizador, como se indicó para las muestras.
65
Tabla A3.1 : Concentración de biftalato para la curva patrón de carbón orgánico.
mg C contenidos en
Biftalato de potasio (mg)
biftalato
0 0
12.15 5
24.31 10
36.46 15
48.62 20
60.77 25
Cálculos
Calcular la cantidad de carbono orgánico total (COT) contenido en el suelo con la ecuación
lineal de la curva estándar.
CO (mg) = (A – b) / m).
Donde:
CO = carbono orgánico (mg) contenido en el suelo.
A = área del pico obtenido.
b = ordenada al origen.
m = pendiente.
Calcular la concentración final de COT de la muestra de suelo mediante la siguiente

ecuación:
COT (mg / kg de suelo seco) = CO (mg) * 1 000 / P * FH
COT = carbono orgánico total (mg / kg de suelo seco).
CO = carbono orgánico (mg).
P = cantidad de suelo (0.1 g a 0.5 g).

66
1 000 = factor de corrección de concentración (1 000 g = 1 kg).
FH = factor de corrección de humedad = (1-(%humedad/100)).
A partir del contenido total de carbono orgánico se puede estimar el contenido de materia
orgánica (tabla C2); suponiendo de forma convencional que la materia orgánica contiene
58% de carbono. Así, el contenido de carbono orgánico se multiplica por el factor 1.724
para obtener el contenido de materia orgánica (León y Aguilar, 1987).
Tabla A3.2 : Interpretación del contenido de materia orgánica en suelo.
MATERIA ORGANICA (%)

CLASE SUELOS VOLCANICOS SUELOS NO VOLCANICOS
Muy bajo < 4.0 < 0.5
Bajo 4.1 - 6.0 0.6 - 1.5
Medio 6.1 - 10.9 1.6 - 3.5
Alto 11.0 - 16.0 3.6 - 6.0
Muy alto > 16.1 > 6.0
A.4 Nitrógeno total (NT)
Material y equipo
 Muestra de suelo seco y molido con un mortero.
 Matraces Kjeldahl.
 Vasos de precipitados.
 Probetas.
 Digestor.
 Matraz aforado de 1 L.
 Matraces Erlenmeyer de 1 L.
67
 Perlas de ebullición.
 Pipeta.
 Destilador.
 Bureta.
 Soporte universal con pinza.
Soluciones y reactivos
1) Solución de ácido bórico con indicador. Pesar 20 g de ácido bórico (H3BO3) y

disolver en 750 ml de agua destilada. Calentar para la completa disolución del
ácido. Dejar enfriar y agregar 20 ml de la siguiente mezcla de indicadores: 0.099 g
de verde de bromocresol y 0.066 g de rojo de metilo disueltos en 100 ml de alcohol
etílico al 96%. El pH de la mezcla debe de ser de 5.0, si es más ácido agregar
algunas gotas de solución de hidróxido de sodio 0.1 N, hasta que la solución
adquiera una coloración púrpura o alcance el pH indicado. Completar el volumen a
1 L con agua destilada y mezclar.
2) Solución de hidróxido de sodio 0.1 N: Pesar 4 g de hidróxido de sodio (NaOH),

disolver en agua destilada y aforar a 1 L.
3) Mezcla de catalizadores: pesar 62.5 g de sulfato de potasio (KSO4) y 6.25 g de

sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O). Homogeneizar la mezcla.
4) Solución de hidróxido de sodio 10 N: Pesar 200 g de hidróxido de sodio (NaOH),

disolver en agua destilada y aforar a 500 ml. El agua para preparar la solución debe
ser hervida previamente para eliminar el CO2, dejándola enfriar antes de agregarla.
5) Solución de ácido sulfúrico 0.01 N: Diluir 0.28 ml de ácido sulfúrico concentrado

(H2SO4) hasta completar un volumen de 1 L con agua destilada. La concentración
del ácido debe ser estandarizada con la solución valorada de carbonato de sodio.
68
6) Solución valorada de carbonato de sodio: Pesar 0.25 g de carbonato de sodio

(NaCO3), previamente secado en la estufa durante 2 horas a 105oC, disolver en
agua destilada y aforar a 50 ml.
7) Solución de anaranjado de metilo: Pesar 0.1 g de anaranjado de metilo, disolver en

Valoración de la normalidad del ácido sulfúrico 0.01 N:
 Tomar 3 alícuotas de 10 ml de la solución de NaCO3.
 Agregar 5 o 6 gotas de anaranjado de metilo como indicador.
 Titular con la solución de ácido sulfúrico 0.01 N.
 Calcular la normalidad real sustituyendo en la siguiente fórmula:
Normalidad del H2SO4 = (0.050 g/ 53) X (1/ Promedio de ml gastados en las tres
alícuotas).
8) Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).
9) Granallas de zinc.
Procedimiento
A. Digestión.
1) Pesar una muestra de suelo de 0.25 a 1 g, que dependerá de la materia orgánica

contenida en el suelo, entre más materia orgánica tenga un suelo menos serán los
gramos de muestra.
2) Colocar la muestra de suelo en un matraz Kjeldahl seco.
3) Adicionar 2 g de mezcla de catalizadores.
4) Agregar 5 ml de ácido sulfúrico concentrado.

69
5) Poner a calentar en el digestor a una temperatura media, hasta que la muestra se

torne clara. La temperatura debe ser regulada de modo que los vapores de ácido
sulfúrico se condensen en el tercio inferior del cuello del matraz Kjeldahl.
6) Hervir la muestra por una hora a partir de ese momento.
7) Una vez terminada la digestión, apagar el digestor y tapar con un frasco los
matraces para dejar enfriar.
B. Destilación.
1) Añadir al matraz Kjeldahl frío 25 ml de agua destilada y mezclar vigorosamente

hasta una disolución completa.
2) Transferir el líquido a un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Colocar de 5 a 6 perlas de

ebullición.
3) Adicionar 3 granallas de zinc. Añadir 15 ml de la solución de hidróxido de sodio 10

N, sosteniendo el matraz inclinado de modo que se deposite en el fondo.
4) Colocar en la salida del aparato de destilación un vaso de precipitados de 50 ml, que

contenga 10 ml de la solución de ácido bórico más indicador.
5) Conectar el flujo de agua e iniciar la destilación. Destilar hasta que el volumen

alcance la marca de 20 ml en el vaso de precipitados de 50 ml. Una vez alcanzado
dicho volumen, retirar el matraz y apagar el aparato.
6) Titular el nitrógeno amoniacal con la solución de ácido sulfúrico 0.01 N hasta que
vire de verde a rosado fuerte.
7) Realizar un blanco siguiendo los pasos del 3 al 15.

70
Cálculos
Calcular la concentración de nitrógeno, sustituyendo en la siguiente fórmula:
Donde:
T = ml de ácido sulfúrico valorado gastados en la muestra.
B = ml de ácido sulfúrico valorado gastados en el blanco.
N = normalidad exacta del ácido sulfúrico.
S = peso de la muestra de suelo.
Tabla A4.1 : Criterios para evaluar un suelo con base en su contenido de nitrógeno total
(Moreno, 1978).
Valor (%) de nitrógeno en

Categoría suelo
Extremadamente pobre < 0.032
Pobre 0.032 - 0.063
Medianamente pobre 0.064 - 0.095
Medio 0.096 - 0.126
Medianamente rico 0.127 - 0.158
Rico 0.159 - 0.221
Extremadamente rico > 0.221
A.5 Fosfatos
Material y equipo
 Muestra de suelo (1 g) seco y molido en un mortero.
 Vasos de precipitado.
 Pipetas de 1, 5 y 10 ml.
71
 Matraces aforados de 0.5 y 1 L.
 Espectrofotómetro visible.
 Probeta de 250 ml.
 Botellas de polipropileno 1 L.
 Tubos de ensayo de 10 ml.
 Tubos de plástico para centrífuga de 15 ml.
 Gradillas.
 Vórtex.
 Centrifuga.
 Matraz Erlenmeyer de 1 y 2 L.
 Frascos de vidrio ámbar con tapa esmerilada.
Nota: Para llevar a cabo esta determinación deberá utilizarse material de vidrio Pirex, y
guardar el agua y los reactivos en frascos neutros o de Nalgene. El agua empleada deberá
ser libre de fósforo, ya sea bidestilada o desmineralizada. Es recomendable vaciar el agua
del garrafón a envases de Nalgene neutros. Previamente a la realización de esta técnica,
todo el material que se utilice para preparar los reactivos y realizar los análisis deberá
dejarse por lo menos cinco minutos en mezcla crómica y después enjuagar con agua
bidestilada. No usar ningún tipo de detergente para el lavado del material de cristalería o
bien utilizar jabón libre de fosfatos. En caso de usar este último ya no es necesario lavar el
material con mezcla crómica.
1) Mezcla crómica: Pesar 100 g de dicromato de potasio (2Cr2O7) y disolver en 1 L de

agua destilada. Calentar hasta la completa disolución del reactivo. Dejar enfriar la
solución y agregar gota a gota 100 ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).
72
2) Solución madre de fluoruro de amonio (NH4F) 1 N: Pesar 37 g de fluoruro de

amonio, disolver en agua destilada y aforar a 1 L. Guardar en un recipiente de
polipropileno.
3) Ácido clorhídrico (HCl) 0.5 N: Diluir 20.2 ml HCl concentrado hasta completar un
volumen de 500 ml con agua destilada.
4) Solución extractora: Agregar 460 ml de agua destilada a 15 ml de solución madre de

fluoruro de amonio y 25 ml de solución de ácido clorhídrico 0.5 N. Esto nos da una
solución 0.03 N de fluoruro de amonio y 0.025 N de ácido clorhídrico. La solución
final debe ser almacenada en un recipiente de polipropileno perfectamente tapado,
de esta forma se conserva hasta un año.
5) Solución de ácido clorhídrico (HCl) 10 N: En un matraz aforado de 500 ml colocar

80 ml de agua destilada y adicionar lentamente y por las paredes del matraz 404 ml
de ácido clorhídrico concentrado (HCl), al final completar un volumen de 500 ml
con agua destilada.
Nota: tener mucho cuidado al preparar esta solución, se debe hacer en una campana de
extracción y sobre un baño de hielo.
6) Solución de molibdato de amonio-ácido clorhídrico: Pesar 15 g de molibdato de

amonio tetrahidratado ((NH4)6Mo7O24.4H2O) y disolver en 350 ml de agua
destilada. Añadir lentamente y con agitación constante 300 ml de ácido clorhídrico
10 N. Enfriar a temperatura de laboratorio y aforar a 1 L con agua destilada.
Mezclar bien y guardar en frasco ámbar con tapón esmerilado. Esta solución debe
ser preparada cada dos meses.
7) Solución madre de cloruro estañoso: Pesar 5 g de cloruro estañosodihidratado

(SnCl2. 2H2O) y disolver en 12.5 ml de ácido clorhídrico concentrado (HCl).
Calentar a baño María hasta que se disuelva bien. Guardar en el refrigerador en
frasco ámbar con tapón esmerilado, pues de esta forma se conserva seis semanas
máximo.
73
8) Solución de cloruro estañoso diluida: Agregar 33 ml de agua destilada a 0.1 ml de

solución madre de cloruro estañoso o 0.3 por 99 ml de agua. Esta solución debe ser
preparada cuatro horas antes de su uso.
9) Solución tipo de fosfato (100 mg/ml): Pesar 0.4389 g de fosfato de potasio

monobásico (KH2PO4), disolver en agua destilada y aforar a 1 L. Un mililitro de
esta solución contiene 100 ppm de fósforo.
10) Agua bidestilada o desmineralizada.
Procedimiento
1) Pesar 1 g de suelo previamente seco y molido, y colocarlo en un tubo para

centrífuga de 15 ml.
2) Agregar 7 ml de solución extractora, agitar con vórtex de tal manera que se mezcle
bien el suelo y la solución extractora.
3) Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 6 000 rpm.
4) Del sobrenadante tomar 1 ml y colocarlo en un tubo de vidrio, agregar 6 ml de agua

destilada y 2 ml de la solución de molibdato y mezclar bien.
5) Agregar 1 ml de solución de cloruro estañoso diluido (que debe prepararse al

momento) y nuevamente mezclar.
6) Pasados 10 minutos leer la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de

onda de 640 nm. Todas las lecturas deberán terminarse antes de 20 minutos.
Nota: En caso de que las muestras tengan un alto contenido de fósforo deben hacerse las
diluciones apropiadas con el extracto (sobrenadante), de tal manera que los valores de
absorbancia estén dentro de la curva de calibración. O bien se puede iniciar la extracción
con 0.5 g de suelo.
7) Cada vez que se lea un lote de muestras realizar un blanco de la siguiente manera:
Poner 1 ml de H2O destilada y 1 ml de solución extractora, agregar 5 ml de agua
74
destilada y 2 ml de solución de molibdato de amonio, mezclar bien y agregar 1 ml

de la solución de cloruro estañoso, finalmente mezclar otra vez.
8) Para construir la curva patrón hacer las diluciones correspondientes de la solución

tipo de fosfato, llevando el volumen a 100 ml, y considerar las proporciones de la
tabla 4.7.
Curva patrón. Colocar 1 ml de cada una de las diluciones (ppm) de la solución tipo de
fosfato en los tubos. Agregar 1 ml de la solución extractora, 5 ml de agua destilada y 2 ml
de solución de molibdato de amonio. Posteriormente 1 ml de solución de cloruro estañoso
diluido y mezclar bien.
Finalmente hacer las lecturas y terminarlas antes de 20 minutos.
Tabla A5.1 : Concentración de fosfato para realizar la curva patrón de fósforo.
ml de solución tipo de
Concentración (ppm) fosfatos
10 10
9 9
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
Tabla A5.2 : Criterios para determinar la calidad de un suelo en cuanto a su contenido

de fósforo. (NOM-021-RECNAT-2000).
Categoría Valor (mg kg-1)

Bajo < 5.5
Medio 5.5 -11
Alto > 11
75
A.6 Nitratos y nitritos
Material y equipo
 Estufa.
 Mortero.
 Balanza.
 Centrífuga.
 Analizador ión capilar.
 Tubos Falcon para centrífuga o equivalente.
 Vórtex.
 Pipetas.
 Matraces volumétricos.
 Filtro con membrana de 0.45 μm.
Reactivos y soluciones
 Solución extractora. Cloruro de potasio (KCl) 1M. Pesar 74.56 g de KCl disolver en
agua destilada y aforar a volumen de 1 L.
 Medio de dilución de estándares. Cloruro de potasio (KCl) 0.0037M. Medir 0.915

ml de la solución KCl 1M y aforar a 0.25 L.
 Solución para lavado de columna. Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N. Pesar 0.4 g de
NaOH disolver en agua desionizada y diluir a 100 ml.
 Solución patrón de nitrato (NO3) 1 000 mg L-1. Pesar 1.37 g de NaNO3, disolver
en agua desionizada en un volumen de 1 L.
76
 Solución patrón de nitrito (NO2) 1 000 mg L-1. Pesar 1.5 g de NaNO2, disolver en
agua desionizada en un volumen de 1 L.
 Electrolito. Base de cromato de sodio 0.1 M. 4.6 ml de solución OFM anión-BT

(Water CIA-pak), 9.2 ml de cromato de sodio 0.1 M en 200 ml de agua desionizada
grado MiliQ.
Procedimiento
A. Extracción.
1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30oC) y moler en un mortero.
2) Pesar 10 g del suelo molido, colocarlos en un tubo (Falcón para centrífuga o

equivalente), posteriormente agregar gradualmente 30 ml de KCl 1M, mezclando
intensamente en vórtex durante un minuto. Centrifugar a 8 000 rpm por 10 minutos
y recuperar el sobrenadante. Aproximadamente 1 ml será utilizado para el análisis
de nitrato y nitrito.
Nota: Este procedimiento de extracción permite la obtención de sobrenadante para la

determinación de amonio intercambiable, con la diferencia de requerirse 25 ml para la
determinación del amonio con otro protocolo de cuantificación (ver sección 4.7).
B. Cuantificación.
1) Realizar una dilución inicial 0.5/5 (0.5 ml de sobrenadante en 4.5 ml de agua

desionizada); a partir de ésta hacer una segunda dilución 0.2/5 (0.2 ml de la primera
en 4.8 ml de agua desionizada). Esta última se debe filtrar a través de una
membrana de 0.45 μm y, posteriormente, colocar 0.5 ml del filtrado en viales para
el análisis por electroforesis capilar.
2) Condiciones del equipo (CIA):
Temperatura: 25°C.
Voltaje: 15kV con fuente de poder negativa.

77
Detección: UV indirecta a 254 nm.
Columna: Capilar de 75 μm (di) x 375 μm (de) x 60 cm (largo).
Curva patrón. Elaboración de la curva estándar para nitrato (NO3). Deberá preparar
estándares entre 5 a 80 mg NO3/L a partir de la soluciónpatrón 1 000 mg NO3/L y como
medio de disolución KCl 0.0037M.El tiempo de corrida durante el análisis debe ajustarse a
4.5 minutos.
Elaboración de la curva estándar para nitrito (NO2). Deberá preparar estándares entre 5 y
80 mg NO2/L, a partir de la solución patrón 1 000 mg NO2/L y como medio de disolución
KCl 0.0037M. El tiempo de corrida durante el análisis debe ajustarse a 4.5 minutos.
Cálculos
Para calcular la concentración final en mg L-1 deberá tomarse en cuenta la relación de

diluciones. Finalmente, para convertir el resultado mg L-1 a concentración en peso (mg kg-
1), se utiliza la siguiente relación. Además es necesario corregir con la humedad.
mg anión/kg suelo = mg anión /L * 3

78
Tabla A6.1 : Clasificación de fertilidad de suelos por el contenido de nitrógeno inorgánico.
N inorgánico en el
Clase
suelo (mg kg-1)
Muy bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Medio 20 - 40
Alto 40 - 60
Muy alto > 60
Nota: Los valores de la tabla F1 corresponden a fertilidad de suelos del nitrógeno

biodisponible para plantas; por lo que junto al amonio se debe interpretar el contenido de
nitrógeno inorgánico en función a la capacidad extractiva de la solución empleada, y
evaluar si es un parámetro que permita definir los requerimientos nutricionales de los
microorganismos en los procesos de biodegradación de hidrocarburos.
A.7 Amonio intercambiable.
Material y equipo
 Estufa.
 Mortero.
 Balanza.
 Centrífuga.
 Potenciómetro con electrodo ión selectivo.
 Tubos Falcon para centrífuga o equivalente.
 Vórtex.
 Pipetas.
 Matraces volumétricos.
79
Reactivos y soluciones
 Cloruro de potasio (KCl) 1M. Solución extractora. Pesar 74.56 g de KCl disolver en
agua destilada y aforar a volumen de 1 L.
 Hidróxido de sodio (NaOH) 10N. Disolver 400 g de NaOH en agua. Enfriar y diluir
a 1 L.
 Solución patrón. 1 000 mg NH4/L. Secar NH4Cl por una hora a 100oC. Pesar 3.027
g, disolver en agua y diluir a 1 L.
Procedimiento
A. Extracción.
1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30oC) y moler en un mortero.
2) Pesar 10 g del suelo molido, colocarlos en un tubo (Falcón para centrífuga o

equivalente); posteriormente, agregar gradualmente 30 ml de KCl 1M, mezclando
intensamente en vórtex durante un minuto.
Centrifugar a 8 000 rpm por 10 minutos y recuperar el sobrenadante. Aproximadamente 25

ml serán utilizados para el análisis del amonio.
Nota: La determinación de amonio intercambiable en el presente método permite también

extraer con la solución extractora (KCl 1M) a los iones nitrito y nitrato. Con la diferencia
que el amonio se cuantifica por electrodo de ión selectivo y los iones nitrito y nitrato por
electroforesis capilar (EIC).
B. Cuantificación.
1) Tomar 25 ml del sobrenadante de la extracción, adicionar 0.45 ml de NaOH 10N;

bajo agitación llevar a cabo la medición de mV mediante electrodo de ión selectivo
para amonio. Calcular de la curva estándar (de elaboración reciente) la
concentración mg NH4/L.
80
Curva patrón. Preparar por lo menos tres estándares según rango de concentración
esperada en muestras. Es importante preparar siempre estándares nuevos. Deberán
prepararse estándares entre 0.1 a 100 mg NH4/L en un volumen de por lo menos 25 ml,
usando la solución patrón 1 000 mg NH4/L y como medio de disolución KCl 1M. Para
estándares de 1, 10 y 100 mg NH4/L medir 0.05, 0.5 y 5 ml de solución patrón y aforar a
50 ml con KCl 1M. Al igual que las muestras, medir la diferencia de potencial en milivolts
(mV). Construir gráfica semilogarítmica. Poner en el eje (x) logarítmico la concentración
NH4/L y en el eje lineal (y) el potencial del electrodo.
Cálculos
Para convertir el resultado a concentración en peso (mg NH4/kg suelo), en este caso se
utiliza la siguiente relación. Además es necesario corregir con la humedad.
mg NH4/ kg suelo = mg NH4/L * 3
Tabla A7.1 : Clasificación de fertilidad de suelos en función del nitrógeno inorgánico

(NOM-021-RECNAT-2000).
N inorgánico en el
Clase
suelo (mg kg-1)
Muy bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Medio 20 - 40
Alto 40 - 60
Muy alto > 60
81
A.8 pH
Tabla A8.1 : Parámetros de evaluación de un suelo con respecto a su pH (NOM-

021-RECNAT-2000).
CATEGORIA VALOR DE pH
Fuertemente acido < 5.0
Moderadamente acido 5.1 - 6.5
Neutro 6.6 - 7.3
Medianamente
7.4 - 8.5
alcalino
Fuertemente alcalino 8.5
A.9 Conductividad eléctrica
Material y equipo
 Muestra de suelo seco y molida en un mortero.
 Frascos de plástico de boca ancha de 250 ml.
 Vaso de precipitado de 100 ml.
 Bureta.
 Espátula.
 Papel filtro.
 Embudo Buchner.
 Pipeta de 10 ml.
 Matraz Kitazato.
 Piceta con agua destilada.

82
 Bomba de vacío.
 Probeta.
 Conductímetro.
 Frascos.
 Agua destilada.
 Matraz aforado de 100 ml.
Soluciones
 Solución estándar de cloruro de potasio (KCl) 0.1 N. Disolver 0.7455 g de KCl en

 Solución estándar de cloruro de potasio (KCl) 0.01 N. Tomar una alícuota de 10 ml

de la solución estándar de KCl 0.1 N y aforar a 100 ml.
Procedimiento
A. Preparación de la pasta de saturación.
1) Pesar 40 g de suelo seco y colocarlo en un recipiente de plástico, si el suelo es

arenoso o areno-migajoso pesar 600 g.
2) Agregar agua destilada con la bureta y mezclar con la espátula hasta saturación.
3) Golpear el recipiente con cuidado sobre la mesa de trabajo para asentar el suelo.
4) La pasta estará lista cuando se observe un brillo en su superficie (formación de un

espejo), esto no sucede en el caso de suelos con alto contenido de arcilla.
5) Anotar el volumen de agua gastado (ml).
6) Dejar reposar la pasta durante una hora y comprobar a criterio su saturación.
7) Tapar el recipiente y dejarlo reposar por tres horas, excepto suelos arcillosos que
deben dejarse reposar 24 horas.
83
B. Obtención del extracto del suelo.
1) Colocar papel filtro sobre el embudo, humedecerlo con agua destilada, dejando
drenar el exceso. Conectar el sistema de filtración al vacío.
2) Mezclar nuevamente la pasta y colocarla en el embudo y aplicar vacío.
3) Obtener un extracto de aproximadamente 50 ml.
C. Determinación de la conductividad eléctrica.
1) Calibrar el conductímetro. Antes de usar el medidor de conductividad debe

calibrarse con una solución estándar. Para esto se requiere de dos soluciones de
KCl, 0.1 N y 0.01 N, con cada una se ajusta el equipo a la conductividad indicada
en le tabla B1 del anexo B.
2) Leer la conductividad eléctrica y la temperatura del extracto. Si la lectura se toma

en μmhos, transformar los resultados a mmhos o dS dividiendo entre 1 000.
3) Si es necesario, hacer corrección consultando la tabla de factores de corrección para

diferentes temperaturas (tabla B2 del anexo B), se multiplica el resultado de
conductividad eléctrica por el valor correspondiente.
Tabla A9.1 : Ajuste de conductividad en función de la solución de KCI.
Conduct. eléctrica a
Sol. estándar de KCl
25ºC
0.1 N 12.9 dS/m
0.01 N 1.412/m
Cuando no se sabe la conductividad de la muestra se recomienda calibrar primero con una

de las dos soluciones y tomar la lectura de la muestra, después volver a calibrar con la
segunda solución y tomar nuevamente la lectura. Para calibrar finalmente el equipo, se debe
elegir la solución con la que se aproxime más la conductividad de la muestra.
84
Tabla A9.2 : Factores de corrección de la conductividad eléctrica en función de la

temperatura del extracto de saturación.
Temperatura Factor de Temperatura Factor de

(ºC) corrección (ºC) corrección
8 1.499 22 1.067
10 1.421 23 1.044
12 1.350 24 1.021
14 1.284 25 1.000
16 1.224 26 0.979
18 1.168 28 0.941
19 1.142 30 0.906
20 1.128 32 0.873
21 1.092 34 0.843
Cálculos
La unidad estándar de conductividad eléctrica es el siemens/metro (S/m = Ohm/m), pero

para evitar la expresión de resultados en pequeñas fracciones decimales se usa
generalmente una unidad más pequeña: el miliSiemens/metro (mS/m). Aunque la
conductividad generalmente es reportada en μmhos/cm.
mS/m = 10 μmhos/cm.
A.10 Extracción y cuantificación de Hidrocarburos totales de petróleo.
Extracción por reflujo (Soxhlet)
Este método consiste en extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante la

acción de un solvente orgánico volátil apropiado, que es reflujado a través de la muestra
varias veces durante un tiempo determinado. El solvente es evaporado y posteriormente
condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y se le regresa al origen para
ser nuevamente evaporado. La muestra sólida es mezclada con sulfato de sodio anhidro
para eliminar el agua residual, se le coloca en un dedal o cartucho de papel o fibra de vidrio
y se usa un solvente orgánico apropiado para su extracción en un equipo Soxhlet. Mediante
85
los reflujos del solvente y la temperatura se permite el contacto íntimo de la muestra con el
solvente de extracción, de esta manera se logra la liberación de los hidrocarburos presentes
en la muestra. El extracto orgánico se concentra (si es necesario) o bien se evapora para
realizar el intercambio de solvente, acorde con el método de cuantificación.
Material y equipo
 Equipo de reflujo Soxhlet de 250 ml.
 Perlas de ebullición.
 Cartuchos de celulosa o fibra de vidrio.
 Vaso de precipitados 250 ml.
 Viales.
 Espátula.
Reactivos
 Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
 Diclorometano (cloruro de metileno, CH2Cl2) grado HPLC.
Procedimiento
1) Colocar de 5 a 10 g de suelo seco y finamente molido en un cartucho de celulosa o

fibra de vidrio.
2) Adicionar sulfato de sodio anhidro en una relación suelo:sulfato 1:1 y mezclar.
3) Colocar cada cartucho conteniendo las muestras dentro de la camisa o columna

extractora del equipo Soxhlet.
4) Adicionar 125 ± 5 ml de diclorometano en el matraz de bola y colocar suficientes

perlas de ebullición para evitar la proyección del solvente al calentarse.
86
5) Ensamblar el equipo Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar una temperatura

de 45oC.
6) Mantener el reflujo en estas condiciones durante 8 horas, de tal manera que se

efectúen entre 6 y 8 reflujos por hora, lo que permitirá la liberación de los analitos.
7) Después de 8 horas, el extracto orgánico contendrá todos los hidrocarburos solubles

en diclorometano. Pasar el matraz bola a un rotoevaporador y concentrar el extracto
orgánico a sequedad.
8) Recuperar el concentrado en un vial de 40 ml con tapón de teflón para su

cuantificación.
Método gravimétrico para la cuantificación de hidrocarburos totales del petróleo
El método se basa en la cuantificación de los hidrocarburos que son extraídos dentro de un

solvente adecuado. El solvente es evaporado y el extracto orgánico obtenido es pesado.
Esta cuantificación es llamada HTPs y es reportada como porcentaje de la muestra total en
peso seco. Este método es más adecuado para petróleos pesados que no se pierden en la
etapa de evaporación. El método se basa en la cuantificación de los hidrocarburos que son
extraídos dentro de un solvente adecuado. El solvente es evaporado y el extracto orgánico
obtenido es pesado. Esta cuantificación es llamada HTPs y es reportada como porcentaje de
la muestra total en peso seco. Este método es más adecuado para petróleos pesados que no
se pierden en la etapa de evaporación.
Material y equipo
 Matraces de bola de 250 ml.
 Rotoevaporador.
 Viales o tubos de vidrio de 25 ml.
 Pinzas.
87
Procedimiento
1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocará el extracto orgánico obtenido

(matraz de bola para la extracción, vial o tubo de vidrio) (ver sección 5.2 ). Colocar
el recipiente en la estufa a 120ºC durante 4 horas. Sacar este material y colocarlo en
un desecador para que se enfríe. Pesar el recipiente, después colocarlo otra vez
dentro de la estufa y volver a realizar el procedimiento hasta que el peso no cambie.
Anotar el peso del recipiente (RA).
2) Una vez que el extracto orgánico obtenido (ver sección 5.2 ) esté en un matraz de
bola, tubo o vial de vidrio a peso constante, se procede a la evaporación total del
solvente (diclorometano) en un rotoevaporador 740 ± 50 mbar y 45ºC hasta
sequedad.
3) Pesar nuevamente el matraz, vial o tubo con el extracto libre de solvente. Anotar el
peso (RB).
Cálculos
La diferencia en peso corresponde al contenido total de HTPs. Para hacer el cálculo de

concentración de hidrocarburos totales del petróleo provenientes de la muestra, se debe
considerar la cantidad de suelo que se pesó para la extracción, así como la humedad de la
muestra. El resultado debe expresarse en mg de HTP/kg de suelo seco, y se calcula de la
siguiente manera:
HTPs (mg kg-1 de s.s.) = (RB – RA) * (FC) / (P * FH).
Donde:
HTPs (mg kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petróleo en mg/ kg de suelo seco.
RA= peso (mg) del recipiente vacío a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgánico concentrado.
P = cantidad de suelo extraído (g).

88
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).
FC = factor de corrección para transformar a kg de s.s. = 1 000.
ANEXO B : CARACTERISTICAS MICROBIOLÓGICAS.
B.1 Determinación de la población microbiana heterótrofa y degradadora de

hidrocarburos.
Material y equipo
 Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solución salina 0.85% estéril.
 Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solución salina 0.85% estéril.
 Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estériles.
 Vórtex.
 Balanza.
 Espátulas.
 Campana de flujo laminar o área estéril.
 Cajas de Petri con medio de cultivo-agar.
 Varilla de vidrio.
 Muestra de suelo o agua.
 Incubadora.
 Papel aluminio estéril.

89
1. Solución salina 0.85% estéril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de

agua destilada.
2. Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento.
3. Etanol (CH3-CH2-OH).
Procedimiento
1. En condiciones estériles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del

suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solución
salina isotónica estéril (dilución 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con
agitación vigorosa en vórtex.
2. Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución 10-

3). De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta
10-10 o las adecuadas, asegurándose de utilizar una punta o pipeta estéril diferente
en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada paso.
3. Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie

del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y
con tres diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la cuenta.
4. Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio

previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero
permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por toda la
superficie del medio.
5. Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz.
6. Después de un periodo de incubación (de 3 a 7 días, dependiendo del tipo de

microorganismo), contar el número de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.
90
Cálculos
1. Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.
2. Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s.
UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).
Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC= número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la

que se inocula la caja (10-2 a 10-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).

91
ANEXO C : CUANTIFICACION DE LA PRODUCCION DE CO2 EN SUELO.
Método
En esta técnica la medición de CO2 producido por microorganismos durante la incubación

de suelo en un sistema cerrado y a determinadas condiciones, se cuantifica por
cromatografía de gases con un detector de conductividad térmica.
Material y equipo
 Botellas serológicas de 125 ml.
 Tapones de hule para botellas serológicas.
 Sellos de aluminio para los tapones de hule.
 Jeringa para gases de 5 ml.
 Cromatógrafo de gases con detector de conductividad térmica.
Reactivos
1) Helio grado cromatográfico de alta pureza.
Procedimiento
1) Sistema de degradación: colocar una muestra de suelo en un recipiente (botella

serológica) sellado con un tapón de hule y arillo de aluminio (la cantidad dependerá
del tamaño del sistema por establecer); posteriormente, se incubará a condiciones de
temperatura, humedad, pH, establecidas. Las condiciones dependerán del sistema de
monitoreo del suelo que se desee evaluar.
Nota: La medición de CO2 producido también se puede realizar en sistemas abiertos con
flujo de aire constante, monitoreando en línea (conectando directamente al cromatógrafo).
2) A través del tapón de hule introducir la jeringa para obtener la muestra de gas.
3) Tomar con la jeringa de 0.5 a 2.0 ml de muestra de la atmósfera de los sistemas por
monitorear.
92
Nota: El volumen de muestra dependerá del tipo de sistema que se tenga, mientras más
actividad microbiana presente el sistema (suelo) menor será el volumen de muestra
gaseosa que se requiera; por el contrario, mientras menor actividad microbiana se
observe, mayor será el volumen necesario de muestra gaseosa para la cuantificación de
CO2 producido.
4) Antes de inyectar la muestra gaseosa, el cromatógrafo de gases debe estar a las

condiciones señaladas en la tabla 6.5.
5) Inyectar el volumen total de la muestra de gas tomada en la jeringa en el

cromatógrafo de gases.
6) El resultado de la medición en este equipo permite cuantificar dióxido de carbono

(CO2), oxígeno (O2), nitrógeno (N2) y metano (CH4). El primer pico que sale es de
inyección, el segundo corresponde a CO2, el tercero a O2, el cuarto a N2 y el quinto
a CH4 (Fig. 6.3). Cuando se hace la integración de los datos, eliminar el primer pico
de dicha integración, porque el resultado del área de cada pico se toma en
porcentaje. Tomar la lectura del área del pico de CO2 en porcentaje.
7) Una vez tomadas las áreas de los picos en porcentaje, se procede a calcular la
concentración de CO2 presente en los sistemas, utilizando la ecuación de los gases:
93
ANEXO D : Tipos de bacterias más comunes usadas en los procesos de remediación.
Tabla D1 : Tipos de bacterias más utilizadas.
Grupo de bacterias Genero Importancia ambiental
Degrada compuestos orgánicos

Pseudomonas
Flavobacterium Degrada proteína
Organismo formador de floculos

Zooglea en plantas de lodos activados
Producen ácidos grasos a partir
Clostridium
Bacterias de descomposición de orgánica en un digestor
Micrococcus anaerobio materia
Methanobacterium
Producen metano gaseoso a partir
de ácidos grasos en un digestor
Methanococcus
anaerobio
Methanosarcina
Nitrobacter Oxidan compuestos nitrogenados

Bacterias nitrificantes
inorgánicos
Nitrosomonas
Bacillus Reducen nitratos y nitritos a

Bacterias desnitrificantes
nitrógeno gaseoso u oxido nítrico
Pseudomonas
Degradan compuestos tóxicos
Bacterias degradadoras de Pseudumonas que contienen cloro (como el
cloro transgenicas vinilcloruro) en compuestos
menos nocivos
Azobacter Capaces de fijar el nitrógeno

Bacterias fijadoras de nitrógeno
Beijerinckia atmosférico en NH3
Interviene en la corrosión de
Bacterias reductoras de sulfatos Desulfovibrio
tuberías de hierro
94
Chlorobium Reducen sulfuros a azufre

Bacterias fotosintéticas
elemental
Chromatium
Dan volumen a los lodos en las
Sphaerotilus
Bacterias Filamentosas plantas de lodos activados
férricas Oxidantes
Leptothrix Oxidan el hierro ferroso
del hierro
Pseudomonas
Arthrobacter
Actinomyces
Bacterias degradadoras de Aerobacter
Degradan hidrocarburos
hidrocarburos Flaviobacterium
Corynebacterium
Sphingomonas
Micrococcus
ANEXO E : Límites máximos permisibles para fracciones de hidrocarburos.
Tabla E1 : Límites máximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo (NOM-

SEMARNAT/SS-2003).
Uso del suelo predominante 1 (mg kg-1

FRACCION DE base seca)
HIDROCARBUROS
Agrícola 2 Residencial 3 Industrial
Ligera 200 200 500
Media 1200 1200 5000
Pesada 3000 3000 6000
95
ANEXO F : CLASIFICACIÓN DE TECNOLOGÍAS DE REMEDIACIÓN.
Tecnología de tratamiento implica cualquier operación unitaria o serie de operaciones

unitarias que altera la composición de una sustancia peligrosa o contaminante a través de
acciones químicas, físicas o biológicas de manera que reduzcan la toxicidad, movilidad o
volumen del material contaminado (EPA 2001). Las tecnologías de remediación
representan una alternativa a la disposición en tierra de desechos peligrosos que no han sido
tratados, y sus capacidades o posibilidades de éxito, bajo las condiciones específicas de un
sitio, pueden variar ampliamente.
El uso de una tecnología de remediación en particular depende, además de los factores
específicos del sitio y de las propiedades fisicoquímicas del contaminante, de su
disponibilidad, de la fiabilidad demostrada, de su estado de desarrollo (laboratorio, escala
piloto o gran escala) y de su costo (Sellers 1999).
Las tecnologías de remediación pueden clasificarse de diferentes maneras, con base en los
siguientes principios:
a. Estrategia de remediación.
b. Lugar en que se realiza el proceso de remediación.
c. Tipo de tratamiento.
Cada una de estas clasificaciones proporciona diferente información acerca de las

tecnologías de remediación.
Estrategia de remediación
Son tres estrategias básicas que pueden usarse separadas o en conjunto, para remediar la
mayoría de los sitios contaminados:
- Destrucción o modificación de los contaminantes: Este tipo de tecnologías busca alterar

la estructura química del contaminante.
- Extracción o separación: Los contaminantes se extraen y/o separan del medio

contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas (volatilización, solubilidad,
carga eléctrica).
96
- Aislamiento o inmovilización del contaminante: Los contaminantes son estabilizados,

solidificados o contenidos con el uso de métodos físicos o químicos.
Lugar de realización del proceso de remediación
- In situ: Aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los

contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin necesidad de excavar el sitio. Es
decir, se realizan en el mismo sito en donde se encuentra la contaminación.
- Ex situ: La realización de este tipo de tecnologías, requiere de excavación, dragado o

cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento que
puede realizarse en el mismo sitio (onsite) o fuera de él (off site).
Tipo de tratamiento
- Tratamientos biológicos: Utilizan las actividades metabólicas de ciertos organismos

(plantas, hongos, bacterias) para degradar (destrucción), transformar o remover los
contaminantes a productos metabólicos inocuos.
- Tratamientos fisicoquímicos: Utiliza las propiedades físicas y/o químicas de los

contaminantes o del medio contaminado para destruir, separar o contener la contaminación.
- Tratamientos térmicos: Utilizan calor para incrementar la volatilización (separación),

quemar, descomponer o fundir (inmovilización) los contaminantes en un suelo.
97
Tabla F1: Ventajas y desventajas de las distintas aplicaciones de tratamiento.
Ventajas Desventajas
- Requieren mayores tiempos de
costos.
tratamiento.
- Son tecnologías más benéficas
Tratamientos - Es necesario verificar la toxicidad
para el ambiente.
Biológicos de intermediarios y/o productos.
- Los contaminantes
- No pueden emplearse si el tipo de
generalmente son destruidos.
suelo no favorece el crecimiento
- Se requiere un mínimo o
microbiano.
ningún tratamiento posterior.
- Los residuos generados por

técnicas de separación, deben
costo.
tratarse o disponerse: aumento en
- Pueden realizarse en periodos
Tratamientos costos y necesidad de permisos.
cortos.
Fisicoquímicos - Los fluidos de extracción pueden
- El equipo es accesible y no se
aumentar la movilidad de los
necesita de mucha energía ni
contaminantes: necesidad de
ingeniería.
sistemas de recuperación.
Tratamientos - Es el grupo de tratamientos más
Térmicos costoso.
ANEXO G : TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN MÁS USADAS.
Extracción por fluidos
La extracción por fluidos consiste en separar los contaminantes mediante un fluido

arrastrando el contaminante cuando se usa aire o lavándolo en el caso de utilizar agua, una
vez arrastrado el contaminante a un lugar más accesible donde podrá ser depurado con las
técnicas apropiadas.
98
Tratamiento electroquímico
Este tratamiento se basa en el desplazamiento del contaminante mediante la creación de

campos eléctricos introduciendo unos electrodos en el suelo haciendo que los
contaminantes se muevan de un electrodo a otro siguiendo las líneas del campo eléctrico.
Este procedimiento tiene como ventaja que la textura y la permeabilidad del suelo tienen
una influencia ínfima en la aplicación de este tratamiento debido a que se trata del
transporte masivo del contaminante a través de los poros grandes y pequeños. Esta técnica
de remediación proporciona buenos resultados en el caso de metales pesados y compuestos
orgánicos.
Inyección de aire
La inyección de aire consiste en inyectarle aire u/y oxígeno a presión al suelo a través de
pozos de inyección lo cual provoca la degradación de los hidrocarburos por volatilización y
por biodegradación, debido a que se estimula la actividad bacteriana al aumentar la
oxigenación del suelo.
Hay que tener en cuenta que las moléculas más pequeñas se degradaran más fácilmente, es
un proceso lento y los contaminantes son devueltos a la atmósfera sin sufrir depuración sin
embargo estos compuestos tienden a degradarse rápidamente.
Enjuague del suelo
Esta técnica consiste en inundar el suelo con una solución que transporta los contaminantes
hasta un sitio donde puedan extraerse, el tipo de solución va a depender del contaminante a
tratar y por lo general consiste en agua sola o con aditivos como ácidos, hidróxidos.
Cuando los contaminantes son fáciles de disolver se usa solamente agua, en el caso que
sean metales y contaminantes orgánicos los cuales se encuentran, por lo general, en el
reciclaje de baterías o en los procesos de cromado industrial se deben usar las soluciones
ácidas. Las soluciones básicas se usan para tratar los fenoles (alcohol) y ciertos metales.
En lugares donde hay arcilla o limo los resultados no son óptimos debido a que la solución
de enjuague no puede desplazarse libremente y no entra en contacto fácilmente con el
99
contaminante, otro inconveniente es que en ocasiones el enjuague contiene aditivos que si

no se retiran completamente pueden contaminar el agua subterránea.
Cuando hay varias sustancias peligrosas como metales y aceites este tratamiento no es
eficaz debido a que es difícil hacer un enjuague que sirva para retirar varios contaminantes
a la vez.
Se utiliza para tratar principalmente contaminantes como metales, gasolina, plaguicidas y
fuel oil, este tratamiento tiene varias ventajas a más de ser un tratamiento que se puede
realizar en el sitio, crea un sistema que no es afectado por las condiciones externas y siendo
el costo bajo puede usarse como tratamiento preliminar.
Extracción con solventes
Este tratamiento consiste en utilizar solvente para separar o retirar los contaminantes
inorgánicos peligrosos, no destruyéndolos sino concentrándolos para poder reciclarlos o
eliminarlos con mayor facilidad.
Los solventes utilizados principalmente para la extracción con solventes son:

 Dióxido de carbono liquido
 Butano
 Propano
 Acetona
 Metanol
 Éter dimetílico
Al poner en contacto la tierra contaminada con el solvente dentro de un tanque, ésta se

dividirá en tres elementos: agua, sólido y solventes con contaminantes disueltos, cada uno
de estos componentes pueden ser tratados de manera individual; este método es eficaz para
tratar fangos residuales, suelo con contaminantes orgánicos y desechos de petróleo, no es
recomendable para contaminantes inorgánicos puesto que en la mayoría de los solventes
estos materiales no se disuelven fácilmente.
100
Incineración
La incineración es utilizada para destruir sustancias orgánicas y en algunos casos hasta para
transformar ciertas sustancias inorgánicas en condiciones controladas en sólidos inertes y
gases. Este proceso transforma los metales pesados en sus óxidos los cuales son menos
tóxicos, también ha sido utilizada en la eliminación de compuestos procedentes de
plaguicidas con óptimos resultados.
Tratamiento térmico
Esta técnica consiste en suministrar calor al sitio afectado, sometiendo el suelo a altas
temperaturas (entre los 1000º C) se produce la desintegración de los contaminantes, se
realiza en dos fases, en la primera se oxida la mayor parte de los contaminantes y en la
segunda fase se elimina el contaminante por completo los contaminantes y los gases
manteniendo el suelo a altas temperaturas.
Este tratamiento es comúnmente usado para eliminar la contaminación producida por
hidrocarburos poliaromáticos. En algunos casos se somete el suelo a temperaturas más
bajas (entre 250 y 550 ºC) consiguiendo con esto la desorción de los contaminantes en
lugar de la destrucción de los mismos, es muy usada para remediar suelos contaminados
con lubricantes, aceites minerales, gasolinas y en ciertos casos metales pesados como el
mercurio.
Solidificación o estabilización
Esta técnica se encarga de inmovilizar el contaminante reduciendo la generación de los

lixiviados, es especialmente útil para residuos altamente peligrosos que no son posibles de
destruir como es el caso de los compuestos inorgánicos.
Este tratamiento tiene un origen muy antiguo, al observar la eficiencia de la mezclas de
suelo-cemento en la construcción de los terraplenes se adoptó esta técnica a la remediación
de suelos.
101
Tabla G1: Ventajas y desventajas de algunos métodos de remediación (Heinke, 1999).
Métodos de Remediación Ventajas Desventajas
 Solo funciona en suelos

permeables.
 El procedimiento es
Extracción por fluidos
sencillo.  No es efectivo en suelos
con alta absorción.
 Proporciona buenos
resultados en el caso de  Costos elevados en cuanto
metales pesados y a equipos.
compuestos orgánicos.
 La textura y la
permeabilidad del suelo
Tratamiento electroquímico  El suelo tratado pierde
tienen una influencia
ligeramente su fertilidad.
ínfima en la aplicación
de este tratamiento.
 El contaminante puede
 Es necesario hidratar el
separarse con facilidad
suelo 24 horas antes de la
del suelo, incluso en
aplicación del tratamiento.
forma pura.
 Bajo presupuesto
Inyección de aire  Procedimiento lento.
económico.
 En arcilla o limo los
resultados no son óptimos
debido a que la solución
 Su proceso y efectividad
de enjuague no puede
no son afectados por las
desplazarse libremente y
condiciones externas.
no entra en contacto
fácilmente con el
contaminante.
 En ocasiones el enjuague
 Siendo el costo bajo contiene aditivos que si no
puede usarse como se retiran completamente
Enjuague del suelo tratamiento preliminar. pueden contaminar el agua
subterránea.
 Cuando hay varias

sustancias peligrosas como
metales y aceites este
 Efectivo para tratar
tratamiento no es eficaz
suelos arenosos o muy
debido a que es difícil
permeables.
hacer un enjuague que
sirva para retirar varios
contaminantes a la vez.
102
 No es aplicable para
extraer contaminantes
 Es eficaz para tratar
inorgánicos debido a que
Extracción con solventes contaminantes
estos materiales no se
orgánicos,
disuelven fácilmente en la
mayoría de los solventes.
 Emisiones gaseosas.
 Se pueden tratar grandes
Incineración volúmenes en tiempo
cortos  Alto costo de los
incineradores.
 La principal desventaja de
utilizar este método es que
 Permite tiempos rápidos el suelo queda desprovisto
Tratamiento térmico
de limpieza de toda la materia orgánica
imposibilitándolo así para
su posterior utilización.
Solidificación o  Solo se retiene el

 Bajo costos en equipos.
estabilización contaminante.
ANEXO H : DE MEDIOS Y REACTIVOS.
AGAR NUTRICIO
Peptona de carne………………….3 g
Extracto de carne…………………0.9 g
NaCl………………………………..1,5 g
Agar…………………………………4,5 g
Agua destilada……………………..300 ml
pH…………………………………..7,0
Esterilización: 21ºC por 15 minutos.

Ponce Contreras Daniela

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Universidad del Bío-Bío.

Red de Bibliotecas - Chile

UNIVERSIDAD DEL BIO-BIO

DEPARTAMENTO INGENIERIA CIVIL Y AMBIENTAL

Profesor Patrocinante : Carmen González L.

Profesor comisión : Ricardo Riveros V.

PROYECTO DE TITULO PRESENTADO EN CONFORMIDAD A LOS REQUISITOS

DANIELA SOLEDAD PONCE CONTRERAS

CONCEPCIÓN, ENERO 2014

En segundo lugar, quiero agradecerles principal y fundamentalmente a mis padres, Daniel

3.5.2. Bioestimulación ................................................................................................... 30

Figura 1: Estructuras químicas de componentes de un crudo de petróleo. ......................... 14

Figura 2: Apariencias físicas generales de las bacterias ..................................................... 25

Figura 3: Tipos de biorremediación. ................................................................................... 28

Figura 4: Fases en el estudio de tratabilidad de un suelo contaminado .............................. 42

Tabla 1: Industrias que generan contaminación de suelos con hidrocarburos. ..................... 7

Tabla 2: Ventajas y desventajas de la biorremediación....................................................... 18

Tabla 3: Tipos de reacciones en los procesos aeróbicos y anaeróbicos. ............................. 19

Tabla 4: Bacterias y hongos más usados en biorremediación. ............................................ 27

Tabla 6: Rangos óptimos para procesos de biorremediación. ............................................. 46

Tabla 7: Análisis de características físicas. ......................................................................... 46

Tabla 8: Cantidad de agua aplicada y volteos manuales por semana .................................. 47

BIORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Autor: Daniela Ponce Contreras

Profesor Patrocinante: Carmen González Labbé

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad del Bío-Bío

La contaminación por hidrocarburos está ampliamente distribuida en el mundo y nuestro

Palabras claves: Contaminación con hidrocarburos, biorremediación, protocolo de ensayo

Keywords: hydrocarbon contamination, bioremediation test protocol

En la naturaleza existe una amplia variedad de microorganismos que se encuentran en el

En consecuencia, los productos del proceso de biodegradación son: dióxido de carbono,

Es necesario, inicialmente, distinguir entre los siguientes conceptos:

Inoculación, adición de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales pueden

1.2 Identificación y justificación del problema

La obtención de energía que posibilita el desarrollo de las actividades humanas, proviene en

1.3 Alcances de la investigación

se diseña la metodología o protocolo, que se definen como conjunto de experimentos

1.4 Objetivos de la investigación

1.4.1. Objetivo general.

 Proponer un protocolo de ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio previos a la

1.4.2. Objetivos específicos.

 Comparar técnicas de biorremediación para mejorar suelos contaminados.

2.1 CONTAMINACIÓN DEL SUELO CON HIDROCARBUROS.

La contaminación por hidrocarburos es una problemática de carácter mundial y amplia

En la actualidad existe un creciente interés por la contaminación del suelo con

La contaminación de suelo por hidrocarburos es dinámica, los componentes individuales

 Los Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs) se evaporan.

 Algunos se solubilizan gracias a la polaridad de sus moléculas.

 Otros se absorben en la superficie de la fase sólida del suelo por reacciones

 Mientras otros son degradados por microorganismos en el suelo.

Como resultado de estas transformaciones los hidrocarburos se enriquecen en compuestos

Tabla 1: Industrias que generan contaminación de suelos con hidrocarburos.

TIPO DE INDUSTRIA PRINCIPALES CONTAMINATES DEL SUELO

Fuente: Elaboración propia.

Efectos de los hidrocarburos en el suelo. (2)

Cuando la cantidad de hidrocarburos disminuye ya sea por disolución u otro mecanismo de

 Disminución del rendimiento de los cultivos y pérdida de calidad de los productos

 Impide o retarda el crecimiento de la vegetación en el área contaminada.

 Alteraciones en la población microbiana del suelo.

 Contaminación de aguas superficiales a través de la escorrentía.

 Contaminación de aguas subterráneas a través de lixiviados.

 Contaminación del aire por combustión, evaporación, sublimación o arrastre por el

 Envenenamiento a través de la cadena alimenticia.