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PRÁCTICA Nº10 CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR ELISA

10.1 Marco Teórico

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de
inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar
un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en
ocasiones, con el fin de reducir los costes del ensayo, nos
encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al
antígeno y que a su vez es reconocido por un antígeno secundario
que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La
aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante
espectrofotometría el antígeno en la muestra.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo

particular está presente en la muestra de sangre de un paciente.
Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran
número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura,
medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente
puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.

La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser

utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una
enfermedad autoinmune. Un resultado positivo indica que el
anticuerpo está en la sangre e implica que la persona ha contraído
una determinada enfermedad.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un

inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realice,
mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la
fracción retenida y la fracción libre.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos

campos en los que se precisaba la cuantificación de productos
mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc.

10.2 Competencias
 Conocer los principios básicos de cuantificación de
anticuerpos mediante el uso de la técnica de ELISA.
 Conocer la utilidad de la prueba de ELISA en la detección de
anticuerpos.

10.3 Materiales y equipos

Lector de ELISA
Kit para ELISA
Placas de ELISA
 Micropipetas
Puntas amarillas y azules
Pipeta multicanal

10.4 Procedimiento
1. Cubrir la placa de ELISA con el antígeno diluido e incubar durante
la noche en 4c.

2. Lave 4 veces los pocillos con PBS-Tween 20.

3. Bloquee el atascamiento no específico usando el 1% BSA/PBS e
incube por 30 minutes en la temperatura ambiente.

4. Lave la placa. Agregue los estándares y 100uL de muestras

diluidas a los pocillos apropiados.

5. Incube por 1 hora a temperatura ambiente.

6. Agregue la dilución apropiada 100 ul del anticuerpo secundario

conjugada con la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa (HRP) e
incube por 30 minutos.
7. Agregue 100uL del substrato a cada pocillo e incube a
temperatura ambiente por 30 minutos.
8. Leer las placas en un lector de ELISA.
 10.5 Resultados

(A) Un ELISA indirecto, la producción de color indica la cantidad de

un anticuerpo para un antígeno específico
(B) En ELISA sandwich, la producción de color indica la cantidad de antígeno

10.6 Cuestionario
1.-Los anticuerpos detectados por la prueba de ELISA son de tipo G o M?

2.-La prueba de Elisa solo sirve para detectar anticuerpos?

se recomienda realizar un ELISA en todas las situaciones en las que se

quieran detectar antígenos cuya existencia pueda ser determinante para un
diagnóstico o para establecer conclusiones en un estudio científico. Algunas
de las situaciones más frecuentes donde se usa el ELISA son:
 Diagnóstico de VIH: es la primera prueba que se realiza para descartar una
infección por VIH. Se trata de una prueba muy sensible, así que
prácticamente detecta todos los casos. Sin embargo, puede dar falsos
positivos, por lo que se suele repetir de nuevo un ELISA y se confirma con
un Western-Blot.
 Detección de anticuerpos contra microorganismos: a veces el antígeno a
estudiar puede ser otro anticuerpo. Esta situación se da, por ejemplo, en la
identificación de anticuerpos contra el bacilo de la tuberculosis, entre otros.
 Diagnóstico de hepatitis B: Al igual que con el VIH, el virus de la hepatitis B
puede ser reconocido fácilmente mediante un ELISA en sangre.
 Detección de gérmenes en heces: ciertos virus pueden detectarse en
las heces cuando provocan diarreas; los más frecuentes son los rotavirus. A
veces no se detecta al propio germen, sino que se pueden identificar
toxinas que produce el mismo, como sucede con el E. coli
 Detección de antígenos en orina: es una prueba muy útil y sencilla para
identificar gérmenes causantes de neumonías. En las infecciones
respiratorias las bacterias pasan a la sangre y de ahí a la orina, por lo que
se pueden identificar antígenos fácilmente con un ELISA, que orienta el
tratamiento antibiótico directamente.

3.-El método ELISA es difícil de realizar en los diferentes laboratorios de salud

pública?

Uso de nuevas tecnologías para mejorar las pruebas del VIH Las nuevas
tecnologías como las pruebas de flujo lateral que son sencillas (es decir,
de uno o dos pasos), que pueden usar una gran diversidad de muestras y
proporcionar resultados inmediatos están cambiando notablemente el
panorama de las pruebas del VIH. Al mismo tiempo, como las pruebas
domiciliarias diseñadas para ser usadas por uno mismo han pasado a
convertirse prácticamente en una realidad, los problemas éticos poten-
ciales han suscitado la atención internacional. Esos problemas se
acompañan de preocupaciones prácticas tales como asegurar que se
facilite consejo, garantizar la precisión de la prueba y velar por que los
resultados positivos iniciales se confirmen adecuadamente.

10.7 Fuentes de info

o Abbas AK y Lichtman AW (2004) Inmunología celular y
molecular. 5ª ed., McGraw-Hill – Interamericana, Madrid.
Janeway CA Jr, Travers P, Walport M y Shlomchik M (2003)
Inmunobiología. El sistema inmune en condiciones de salud y
enfermedad. 5ª ed., Masson, Barcelona.
o R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology,
4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
o Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed.
UNMSM, 2007.
http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA