Industrial Conservacion y Nutricion Microbiana Final

UNIVERSIDAD NACIONAL MICROBIOLOGIA
JORGE BASADRE GROHMANN INDUSTRIAL
CAPITULO I
CONSERVACION DE CULTIVOS MICROBIANOS
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El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial paras las

actividades de investigación o industriales basadas en la actuación de estos
microorganismos. Las cepas valiosas se tienen que conservar durante largos
periodos de tiempo libres de cambios fenotípicos adversos.
Además, y tomando como ejemplo los procesos de elaboración de alimentos

fermentados donde participan cultivos microbianos, nos encontramos con que el
éxito de la producción depende principalmente y directamente de las técnicas de
procesamiento utilizadas, pero lo que permite estandarizar y mantener una
calidad uniforme del producto final es una gran parte la correcta selección,
conservación, manipulación y resiembra o propagación de los cultivos (Tamime
y Robinson, 1991).
La elección del método de conservación utilizado debe permitir mantener las

características del microorganismo por las cuales fue seleccionado (Stanbury et
al., 1995).
En la industria alimentaria los cultivos microbianos se guardan en pequeñas

cantidades conocidas como cultivos de reserva. Cuando se reactivan para su
utilización industrial, se tienen que utilizar sistemas de siembra a gran escala con
el objetivo de obtener el volumen necesario para inocular los fermentadores de
producción (Tamime y Robinson, 1991 y Salminen et al., 1998).
Un cultivo de aplicación industrial tiene que reunir unas determinadas

características:
 Contener el máximo número de células viables.

 Estar libre de contaminantes.
 Ser activo en las condiciones de procesamiento.
Por esta razón el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No

existe un método universal para mantener los cultivos de microorganismos.
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La selección del método tiene que basarse en la naturaleza del cultivo y en las
ventajas e inconvenientes del método escogido. Si el microorganismo aun no se
conoce del todo es aconsejable utilizar varios métodos de conservación (Dhingra
y Sindair, 1995).
Los cultivos de microorganismos se siembran en medio estériles y en

condiciones de asepsia, y se mantienen activos aplicando alguno de los
siguientes métodos:
1. Reduciendo o controlando su actividad metabólica a través de la

refrigeración. Este método solo es aplicable durante periodos cortos de
almacenaje (por ejemplo en medios líquidos o tubos inclinados de Agar
nutritivo).
2. Conservación mediante
 Congelación
 Deshidratación
Normalmente se concentran o se separan de los productos residuales de

su metabolismo, a continuación se resuspenden en medio esteril y se
procede a la etapa final de conservación por alguno de los dos métodos
mencionados.
Este sistema permite mantener los cultivos durante largos periodos de

tiempo y la viabilidad de los cultivos conservados depende de (Dhingra y
Sinclair, 1985):
 El medio de cultivo base.

 El método de concentración.
 La rápida eliminación de metabolitos.
 La naturaleza del medio de suspensión.
 Las condiciones de deshidratación o congelación.
 La presencia de agentes crioprotectores (en la congelación).
 La velocidad de descongelación (en el caso de cultivos
congelados).
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1.1 Conservación en refrigeración
El objetivo general de la refrigeración es incrementar la vida útil de los cultivos,

y en consecuencia incrementar sus posibilidades de conservación (Casp y Abril,
1999).
Generalmente hace falta hacer resiembras en medio fresco a intervalos

regulares. Es un procedimiento laborioso y que consume mucho tiempo. El
intervalo entre las transferencias depende de la temperatura y la humedad de
almacenamiento. Los tubos de cultivos almacenados en contenedores que no
permiten la perdida de humedad pero si el intercambio de gases, a una
temperatura entre 5-8 ºC necesitan transferencias cada 6-8 meses. Las
condiciones que permiten que se dé una deshidratación rápida del cultivo
requieren intervalos de transferencia mas cortos.
1.2 Conservación por congelación
La congelación se puede emplear como método de conservación de cultivos

bacterianos, por ejemplo, para la elaboración de productos fermentados. La
mayor tasa de destrucción bacteriana se observa inmediatamente tras la
congelación, después se reduce notablemente y llega a estabilizarse durante
largos periodos de tiempo. Por eso, aunque el numero de supervivientes
disminuya, la congelación es un método efectivo para mantener la viabilidad de
las bacterias. Cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento, mayor será
la superviviencia de las bacterias. Para conseguir una mínima destrucción de las
bacterias interesa que la cristalización sea extracelular y que las bacterias se
deshidraten parcialmente impidiéndose la nucleacion intracelular, pero no lo
suficiente como para que se reduzca su viabilidad. En los medios suelen
incluirse, además, agentes crioprotectores (glicerol, clara de huevo, leche, etc.)
(Ordoñez et al., 1998).
El principal problema del mantenimiento de microorganismos a termperatura por

debajo del punto de congelación es la muerte durante los procesos de
congelación y descongelación. Si los microorganimos pueden sobrevivir a
temperatura del orden por debajo de -20 ºC seguidas de un recalentamiento
rápido hasta la temperatura ambiente es posible conservarlos congelados.
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La supervivencia de los microorganismos a los procesos de congelación y

descongelación depende de (1) el número inicial de células viables; (2) la tasa
de congelación y descongelación; (3) la temperatura de congelación y
almacenamiento (de 0 a -20 ºC son más destructivas que <-20 ºC); (4) tiempo de
almacenamiento; (5) presencia de protectores físicos.
Los principales inconvenientes de este sistema son los costes de los equipos y
mantenimiento, y los daños mecánicos que se pueden provocar en las células
(Dhingra y Sinclair, 1985).
1.2.1 Proceso de congelación
Al descender la temperatura las moléculas de agua tienden a agregarse en

cristales. Esta cristalización supone el paso de las moléculas de agua desde una
distribución desordenada (liquido) hasta un estado de ordenación molecular
(solido). El proceso de ordenación molecular requiere el desplazamiento de las
moléculas desde su posición inicial hasta aquella que les corresponde en la
estructura organizada, para ello será necesario que dispongan de la suficiente
movilidad y de tiempo. El proceso de congelación incluye una serie de fases
(Casp y Abril, 1999).
1.2.1.1 Subenfriamiento.
Antes de que se produzca la cristalización hay que colocar al producto en un

estado termodinámico inestable que propicie al comienzo de la formación de
agregados submicroscopicos de agua que produzcan la interfase adecuada,
necesaria para la transformación de liquido a solido. Esto se consigue con el
subenfriamiento, o sea enfriando el producto por debajo de su punto de
congelación. El grado de subenfriamiento necesario vendrá marcado por el inicio
de la nucleación.
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1.2.1.2 Nucleación.
La cristalización se inicia cuando las condiciones son apropiadas para que se

produzca la agregación de un grupo de moléculas en una diminuta partícula
ordenada, que se conoce como núcleo de cristalización. La nucleacion puede
ser homogénea o heterogénea. La nucleación homogénea se produce en
sistemas puros y lleva a la formación de cristales tridimensionales. La nucleación
heterogénea es más importante en los procesos de congelación. Este tipo de
nucleación tiene lugar cuando el medio no es totalmente puro, y los agregados
de agua se unen sobre un agente de nucleación extraño, como pueden ser las
paredes del recipiente o más comúnmente alguna partícula de material insoluble.
Produce cristales bidimensionales.
1.2.1.3 Crecimiento de los cristales.
Durante el subenfriamiento las moléculas de agua se encuentran en un estado

termodinámicamente inestable en el cual las fuerzas que tienden a ordenarlas
son mas importantes que las que tienden al desorden. A partir del momento en
que la nucleacion ya es efectiva, las moléculas de agua se mueven rápidamente
para alcanzar la estabilidad termodinámica como cristales de hielo. El
crecimiento de los cristales se produce cuando el numero de moléculas de agua
capaces de difundirse a lo largo de la interfase, y de situarse orientadas en una
posición de crecimiento del cristal, es mayor que las que se separan del mismo.
El mecanismo y la velocidad de crecimiento de los cristales dependen de la
morfología de su superficie. Mientras la superficie sea rugosa y con muchos
pliegues el crecimiento será continuo, pero cuando se vaya alisando se reducirá
la velocidad de crecimiento y comenzaran a funcionar otros mecanismos, En
condiciones de subenfriamiento ligero, la velocidad de crecimiento de los
cristales se ve favorecida por los defectos que estos tengan. En el caso de altas
velocidades de enfriamiento, la existencia de defectos parece que tiene menos
importancia ya que entonces las moléculas tienen mayor probabilidad de
orientarse correctamente en ausencia de los pliegues.
En el caso de estructuras celulares, normalmente primero se produce la

congelación del medio extracelular y provoca la salida de agua del interior del
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citoplasma hacia el espacio extracelular donde se congela. Dependiendo de la

tasa de congelación, la célula pierde diferentes cantidades de agua antes que se
produzca la solidificación del contenido intracelular.
Los cristales de hielo intracelulares provocan roturas mecánicas tanto en su

formación durante la congelación como durante la descongelación, debido a
fenómenos de recristalización, en los cuales el hielo se funde y se reorganiza en
cristales mas grandes termodinámicamente más favorables. Una
descongelación rápida aminora estos efectos.
Enfriamiento rápido: queda más agua retenida dentro de la célula

susceptible de formar cristales de hielo que provoquen daños físicos. Pero
si la tasa de enfriamiento es muy rápida se forman cristales muy pequeños
que no pueden dañar las estructuras celulares.
Enfriamiento lento: reduce este riesgo porque sale mas agua de las
células y por lo tanto se forman menos cristales, pero tiene efectos
negativos debido a que los cristales formados son mas grandes, al
incremento de concentración intracelular de sales y a cambios en la
membrana celular. El encogimiento del protoplasto y la reducción del area
superficial puede hacer que, después de la descongelación, se rompan
las membranas.
Para mantener la viabilidad de los cultivos el mejor método seria la combinación

de una tasa de enfriamiento intermedia (algunos estudios demuestran que la
velocidad optima se encuentra entre -1 y -2 ºC por minuto) y la adición de agentes
crioprotectores (Dhingra y Sinclair, 1985; Lamua, 2000).
1.2.2 Agentes crioprotectores
Estos agentes facilitan el flujo de agua a través de la membrana celular y

protegen estructuras moleculares y supra-moleculares a través de diferentes
formas de acción.
Son compuestos químicos no tóxicos, con facilidad para atravesar la membrana

celular y acumularse intracelularmente. Se mantiene en forma amorfa durante el
proceso de congelación y son capaces de unir electrolitos o molécula de agua
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para retrasar la congelación. Entre otros efectos protectores, sirven para

compensar la diferencia de de presión osmótica que se genera cuando empieza
a congelarse la superficie de la célula y se incrementa la concentración de
solutos en el medio que le rodea. De esta manera se evita una perdida excesiva
de agua que podría provocar la deshidratación y destrucción de las células
(Dhingra y Sinclair, 1985).
1.3 Conservación en nitrógeno liquido (-196 ºC)
La actividad metabólica de los microorganismos puede ser reducida

considerablemente almacenándolos a temperaturas muy bajas (-196 ºC) lo cual
se puede logar utilizando la refrigeración con nitrógeno liquido. Según Stanbury
et al (1995) este es el método mas adecuado para la mayoría de células. Hongos,
bacterias, virus, algas, levaduras y cultivos de tejidos de animales y plantas han
sido preservados satisfactoriamente mediante este método.
La técnica consiste en obtener el conocimiento del cultivo hasta lograr la máxima

densidad celular en fase estacionaria, resuspender las células en un agente
crioprotector (como por ejemplo glicerol al 10% estéril o dimetil sulfoxido DMSO
al 10%) y congelar la suspensión en viales cerrados herméticamente (-35 ºC)
antes de conservarlos en nitrógeno liquido. El cultivo puede sufrir pérdidas de
viabilidad durante las etapas de congelación y descongelación pero no se han
apreciado una reducción importante durante el periodo de almacenamiento.
Mediante esta técnica se puede lograr mantener la viabilidad de cultivos durante
un periodo de varios años.
Stanbury et al. (1995) propuso la congelación con nitrógeno liquido como la

técnica idónea o alternativa para conservar por largos tiempos aquellas células
que no sobreviven al proceso de liofilización. Sin embargo, el equipo es caro
aunque el proceso en si es económico. El mayor inconveniente es que el
nitrógeno liquido se evapora y debe ser reemplazado regularmente. Además, si
el equipo falla la consecuencia puede ser la perdida de la colección.
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1.4 Conservación por Deshidratación
Generalmente, se considera como deshidratación un procedimiento que permite

eliminar por vaporización o sublimación la mayor parte del agua de una producto
líquido o solido. Por el contrario, la concentración (por evaporación, congelación,
filtración a través de una membrana, concentración osmótica, centrifugación,
prensado mecánico, extracción de agua por disolventes) solo retira cierto
proporción de esa agua. La concentración constituye, a veces, una fase previa a
la deshidratación de productos líquidos (Cheftel et al., 1992).
1.4.1 Liofilización
Llamada anteriormente crio-desecacion, la liofilización, cuyo nombre

procede de la industria farmacéutica, es un proceso de secado cuyo
principio consiste en sublimar el hielo de un producto congelado. El agua
del producto pasa, por tanto, directamente del estado solido al estado de
vapor, sin pasar por el estado liquido (Casp y Abril, 1999).
El proceso de liofilización consiste esencialmente en dos etapas: 1) el

producto se congela y 2) el producto se seca por sublimación directa del
hielo bajo una presión reducida (Barbosa- Canovas y Vega-Mercado,
2000).
Según Casp y Abril (1999) la liofilización presenta una serie de ventajas:
 La temperatura de trabajo es muy baja y por lo tanto los productos

termolábiles no se alteran.
 No existe peligro de oxidación por la ausencia de aire durante el
procesado.
 No hay agua libre, por lo tanto no hay peligro de hidrólisis ni de
crecimiento microbiano.
 Al evaporarse el hielo, quedan poros que permiten una rehidratación o
reconstitución rápida.
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 La humedad residual es baja.

 La duración de la conservación es larga
 Son productos de peso ligero que no necesitan cadenas de refrigeración
para su distribución.
Pero también presenta algunos inconvenientes:
 El coste de las instalaciones y los equipos es muy elevado (alrededor

de tres veces el de los otros métodos).
 Proceso lento y largo (un ciclo habitual puede ser de 4-8 horas para
liofilizar 2 gramos de producto).
Los productos liofilizados pueden volver a su estructura original por adicion

de agua. La estructura esponjosa del producto liofilizado permite una rápida
rehidratación del mismo. Las características del producto rehidratado son
análogas a las que poseía el producto inicial (Barbosa-Canovas y vega-
Mercado, 2000).
Es un proceso en tres etapas:
Fase de solidificación: la mayor parte del agua que contiene el producto se

congela en forma de cristales de hielo (agua prácticamente pura) mientras
que el agua no congelada y los solutos se quedan en forma amorfa llamada
fase vítrea.
Es imprescindible la congelación completa de la muestra, que se puede

realizar previamente a la introducción del material dentro del liofilizador o
dentro del mismo liofilizador.
La forma y características del producto al final del proceso serán

esencialmente idénticas a las originales ya que la estructura queda fijada
durante esta etapa de congelación.
Fase de deshidratación: se pueden distinguir dos subetapas:
Desecación primaria o sublimación: Consiste en la sublimación de los

cristales de hielo de manera que solo queda la fase amorfa con estructura
porosa (los poros dejados por el agua sublimada).
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Esta etapa se realiza en condiciones por debajo del punto triple del agua
(punto donde coexisten agua, hielo y vapor) para evitar el paso por la fase
liquida, de manera que es un proceso ideal para productos termolábiles
ya que puede deshidratar a bajas temperaturas porque trabaja a presiones
inferiores a 610 Pa (4,58 Torr).
Es necesario un vacio elevado (baja presión absoluta) en el liofilizador

para favorecer la sublimación, cuando la presión de vapor sobre el hielo
disminuye, lo hace también la temperatura y son necesarias presiones
bajas para que se sublime el hielo.
La sublimación del hielo comienza cuando se produce el vacio y disminuye

la presión del sistema por debajo de la presión de vapor del hielo a la
temperatura del producto. Para sublimar el hielo tiene que absorber el
calor latente del sistema (aprox 650 calorías/gramo) que se tiene que
proporcionar en forma de calor. Si no es asi el material experimenta un
enfriamiento progresivo que provoca la disminución de la tensión de vapor
y no se produce la sublimación.
Desecacion secundaria o desorcion: el agua no congelada se traslada

hacia la superficie y sale fuera de la matriz vítrea. Hace falta aportar la
energía necesaria para provocar la adsorción del agua absorbida o fijada
por la matriz.
Para eliminar esta agua, se realiza una evaporación bajo vacio,

manteniendo la misma presión, o menor, que durante la desecación
primaria y elevando la temperatura del producto. Generalmente este
aporte de calor se hace el fondo del producto por conducción y en la parte
superior por radiación.
Si la muestra queda suficientemente seca se puede mantener a

temperatura ambiente.
Fase de rehidratación: consiste en la reconstitución del estado original

por adición de agua o una solución acuosa. Los productos liofilizados son
fácilmente rehidratables debido a que la estructura porosa facilita la
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penetración del agua (Barbosa-Canovas y Vega-Mercado, 2000; Casp y

Abril, 1999).
La eutexia es el fenómeno de cambio de fase de una mezcla binaria en el

cual el sistema se comporta como un elemento puro en solidificación,
produce un solo compuesto solido. El punto eutéctico seria el punto en el
diagrama de cambio de fases determinado por la proporción de la mezcla
eutéctica (abcisas), y la temperatura de solidificación de esta (ordenadas)
en condiciones de presión constante. En soluciones de compuestos que
cristalizan, el punto eutéctico coincide con la temperatura de congelación
de la solución. Hay qye mantener la temperatura de la mezcla por debajo
del punto eutéctico durante la desecación para asegurar la correcta
sublimación sin pasar por la fase liquida.
Cuando se trata de soluciones de sustancias amorfas, mientras el

solvente se congela se forma una solución intersticial progresivamente
mas viscosa. A partir de una determinada concentración de solutos se
produce la transición citrea y se obtiene un material tan viscoso que, a
efectos prácticos se considera un sólido clásico. La línea de transición
vítrea indica la temperatura que garantiza que no se produzca flujo de
material y, por lo tanto , la temperatura máxima a la cual se puede llevar
a cabo la desecación primaria y secundaria. Por encima de esta
temperatura el soluto podría fluir cuando se eliminase el hielo y esto
provocarla la destrucción de la estructura del material, por eso esta
temperatura se conoce también como “temperatura de colapso”.
Para asegurar la estabilidad del producto es importante mantener la

muestra a temperatura inferior a su temperatura de transición vítrea o
temperatura de colapso, que depende tanto del material como del
contenido de agua. Por eso, puede ser necesario utilizar una serie de
aditivos que mejoren las características de la muestra. Macromoléculas
(por ejemplo gelatina, albumina o azucares como la maltosa, lactosa,
sacarosa, etc.) se utilizan como estabilizantes ya que tienen temperaturas
de transición muy elevadas y forman una estructura vítrea estable.
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La liofilización es un buen sistema de conservación de cultivos de

microorganismos porque la operación es compatible con el procesamiento
en condiciones que evitan o minimizan las posibilidades de contaminación
(Mafart y Beliard, 1994; Casp y Abril, 1999).
1.4.2 Atomización
El método de secado por atomización es una de los mas importantes

métodos utilizados para secar determinados productos líquidos: leches
concentradas, extractos concentrados de café, huevos, extractos de
levadura, caseína, zumos de frutas, te, sangre y otros concentrados
proteicos, etc. Para ellos, se “atomiza” (es decir, se transforma en aerosol
o niebla) una solución o una suspensión mas o menos viscosa del producto;
las pequeñas gotas liquidas asi formadas se arrastran y deshidratan en una
corriente de aire dando un polvo seco antes de caer sobre las paredes
inferiores del aparato (Cheftel et al., 1995; Barbosa-Canovas y Vega-
Mercado, 2000).
Las partículas de polvo al final del proceso tienen una forma de esferas o
fragmentos de esferas vacías en su interior que permiten una fácil
rehidratación (Toledo, 1991).
La calidad del producto tratado no se altera mucho debido a que la intensa

evaporación protege el producto del efecto que tendría la elevada
temperatura del aire caliente (el proceso de evaporación absorbe buena
parte del calor aportado). En realidad la energía aportada en forma de calor
cede al producto el calor latente de vaporización haciendo que el
incremento de temperatura de las partículas (debido al calor sensible) sea
muy bajo. Ademas, la tasa de reacciones degradativas disminuye a bajos
contenidos de humedad, y por eso favorece que el corto tiempo de
exposición de la partícula seca temperaturas elevadas (entre 4 y 6
segundos si se utiliza un nebulizador a presión y hasta 30 segundos si el
nebulizador es centrifugo) no comporte un deterioro importante del
producto (Mafart y Beliard, 1994).
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Las ventajas del secado por atomización según Masters (1991), citado por
Barbosa-Canovas y Vega-Mercado (2000), son las siguientes:
 La especificaciones de los polvos permanecen constantes a lo largo de

secadero cuando las condiciones de secado son constantes.
 Es una operación de secado continua y fácil y se puede adaptar a una
control automático completo.
 Existe un amplio intervalo de diseños de secaderos que se pueden aplicar
a materiales sensibles al calor, corrosivos y abrasivos.
Las desventajas más grande de los atomizadores son los costes de

instalación, eficacia termina, calor residual y manejo del aire agotado en
condiciones de saturación o cercanas a ella (Masters, 1991).
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CAPITULO II
NUTRICION MICROBIANA
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2.1. NUTRICION MICROBIANA
La nutrición es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde
habitan, los compuestos químicos que necesitan para llevar a cabo sus procesos
energéticos y biosintéticos que les permiten crecer y reproducirse.
Los requerimientos nutricionales de cada grupo microbiano están dados por la

composición química de las células que los constituyen y por sus características
genéticas las que determinan sus propiedades fisiológicas y su capacidad para
utilizar y transformar los compuestos que se encuentran en el ambiente en que
se desarrollan.
En general los requerimientos nutricionales de los microorganismos reflejan el

ambiente natural en que viven; este conocimiento y el uso de medios de cultivo
de composición química definida, son de primordial importancia en el estudio de
la nutrición microbiana cuyas características varían ampliamente entre los
microorganismos. Algunos tienen requerimientos nutricionales muy simples,
obtienen su energía de compuestos inorgánicos y utilizan CO2 o carbonatos
como fuente de carbono, en tanto que otros requieren de compuestos orgánicos
con diferentes grados de complejidad. La fuente de nitrógeno, la obtienen a partir
de aminoácidos o nitrógeno inorgánico en diferentes estados de oxidación
incluyendo el nitrógeno molecular. Respecto a los requerimientos de oxígeno,
los microorganismos pueden vivir con diferentes concentraciones de este
elemento.
En el siguiente experimento se pondrán de manifiesto el tipo de nutrición y

necesidades de oxígeno de diferentes microorganismos, para ello, estos se
inocularán en dos medios de cultivo, en el primero se variarán las fuentes de
carbono y de nitrógeno y en el segundo la tensión de oxígeno y se relacionarán
sus características nutricionales con el desarrollo y las transformaciones
químicas microbianas obtenidas en los diferentes medios de cultivo.
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2.2. CLASIFICACION NUTRICIONAL
La clasificación nutricional de un organismo se realiza en base a tres criterios

importantes: el origen del carbono, la fuente de energía y los donadores de
electrones.
2.2.1. FUENTE DEL CARBONO.
Se refiere a la fuente del carbono usada por el organismo para su crecimiento y

desarrollo. Un organismo se denomina heterótrofo si usa compuestos orgánicos
y autótrofo si su fuente del carbono es el dióxido de carbono (CO2).
 NUTRICION AUTÓTROFA
Nutrición que presentan aquellos organismos capaces de elaborar su

propio alimento, es decir, materia orgánica, a partir de la materia
inorgánica (CO2 y agua).
Son organismos autótrofos: las plantas, las algas y algunas bacterias
 NUTRICION HETERÓTROFA
Nutrición que presentan aquellos organismos que incorporan materia

orgánica ya elaborada por otros organismos.
Son organismos heterótrofos: los animales, los hongos, la mayoría de

bacterias y los protozoos
Dentro de la nutrición heterótrofa podemos distinguir los siguientes:
 Saprofitismo. Se alimentan de materia orgánica en descomposición.

 Parasitismo. Obtienen su alimenta a expensas de otro organismo.
 Simbiosis. Obtención de beneficios mutuos de tipo nutritivo.
 Biofagia. Se alimentan de seres vivos.
 Necrofagia. Se alimentan de cadáveres o excrementos.
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2.2.2. DONADOR DE ELECTRONES.
Se refiere a los compuestos donadores de electrones que se utilizarán en la

biosíntesis (por ejemplo, en forma de NADH o NADPH). Un organismo se
denomina organotrofo cuando utiliza compuestos orgánicos como fuente de
electrones, mientras que se denomina litotrofo cuando utiliza compuestos
inorgánicos. Los organismos organotrofos son a menudo también heterótrofos,
y así usan compuestos orgánicos como fuente de electrones y de carbono al
mismo tiempo. De forma similar, los organismos litotrofos son a menudo también
autótrofos, con fuentes inorgánicas de electrones y dióxido de carbono como
fuente inorgánica del carbono.
 NUTRICION LITOTROFA
Los organismos litótrofos son un grupo diverso que utilizan sustratos

inorgánicos con el fin de obtener reductores de igual equivalencia para su
uso en la biosíntesis o conservación de energía a través de la respiración
aeróbica o anaeróbica
 NUTRICION ORGANOTROFA
Un organotrofo es un organismo que obtiene hidrógeno o electrones de

sustratos orgánicos. Este término se usa en microbiología para clasificar
también dibujar los organismos en base a cómo se alcanzan los
electrones en sus procesos de respiración. Los organotrofos pueden ser
anaerobios o aerobios. Algunos organotrofos como los animales también
muchas bacterias son también heterótrofos
2.2.3. FUENTE DE ENERGÍA.
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Se refiere al método empleado por el organismo para producir ATP, que se

requiere para aprovisionar de combustible los caminos anabólicos de biosíntesis
de los componentes de la célula. Un organismo es fotoautótrofo cuando utiliza
luz como fuente de energía, mientras que es quimioautótrofo cuando obtiene la
energía de reacciones con compuestos químicos.
 NUTRICION FOTOAUTOTROFA
Organismo que usa la luz como fuente de energía para generar ATP y el CO2
atmosférico como fuente de carbono para producir compuestos orgánicos. Un
ejemplo es la cianobacteria Anabaena.
 NUTRICION QUIMIOAUTOTROFA
Organismo que usa energía de reacciones químicas como fuente de energía

para generar ATP y el CO2 atmosférico como fuente de carbono para producir
compuestos orgánicos. Un ejemplo es la bacteria nitrificante Nitrosomonas.
La base del metabolismo energético de la mayoría de los organismos

quimiotrofos es una reacción de oxidación-reducción en la cual los electrones se
mueven desde un donador a un receptor de electrones. La energía se libera
durante la reacción. Por lo tanto, los compuestos usados como donadores de
electrones por los quimiotrofos deben ser reversibles en caminos oxidativos
productores de energía y en caminos reductores biosintéticos. La gama de pares
posibles de donadores y aceptadores de electrones para los quimiotrofos se
limita a las reacciones que son lo bastante exoenergéticas para conservar
bastante energía después de la transición de por lo menos un protón sobre una
membrana (igual a -15 a -20 kJ/mol). En cambio, los fotoautótrofos pueden
utilizar cualquier donador de electrones y pueden incluso catalizar reacciones
altamente endoenergéticas (por ejemplo, la producción fotosintética de almidón
a partir de agua y de CO2).
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Debe notarse que lo términos respiración aerobia, respiración anaerobia y

fermentación no se refieren a la clasificación nutricional básica, sino que
simplemente reflejan el diferente uso de los posibles receptores de electrones en
el metabolismo energético de los organismos quimiotrofos, tales como O2
(respiración aerobia), NO3-, SO42- o fumarato (respiración anaerobia), o los
intermediarios metabólicos intrínsecos (fermentación). Puesto que todos los
pasos de generación de ATP en la fermentación implican modificaciones de los
intermediarios metabólicos en vez de una cadena de transporte de electrones es
menudo denominada como fosforilación a nivel de substrato.
Tabla Nro. Clasificación de acuerdo al metabolismo
FUENTE DE DONADOR DE FUENTE DE DENOMINACIÓN

ENERGÍA ELECTRONES CARBONO
Orgánica Fotoorganoheterótrofo
-heterótrofo
Orgánico
-organo- Dióxido de
carbono Fotoorganoautótrofo
-autótrofo
Luz
Foto-
Orgánica Fotolitoheterótrofo
-heterótrofo
Inorgánico
-lito- Dióxido de
carbono Fotolitoautótrofo
-autótrofo
Orgánica Quimioorganoheterótrofo
-heterótrofo
Orgánico
Compuesto -organo- Dióxido de
químico carbono Quimioorganoautótrofo
Quimio- -autótrofo
Inorgánico Orgánica Quimiolitoheterótrofo

-lito- -heterótrofo
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Dióxido de
carbono Quimiolitoautótrofo
-autótrofo
Ejemplos
Todas las combinaciones pueden existir en la naturaleza. Por ejemplo, la

mayoría de las cianobacterias son fotoautótrofas puesto que utilizan luz como
donante de electrones y CO2 como fuente de carbono. Los hongos son
quimiorganotrofos puesto que utilizan carbono orgánico tanto como donador de
electrones como fuente de carbono. Los Eukarya son generalmente fáciles de
categorizar. Todos los animales son heterótrofos al igual que los hongos. Las
plantas son fotoautótrofas. Algunos microorganismos eucariontes, sin embargo,
no se limitan a un solo modo nutricional. Por ejemplo, algunas algas viven
fotoautotróficamente cuando hay luz, pero cambian a quimiorganotrofía en la
obscuridad. Incluso las plantas más evolucionadas han conservado su
capacidad de utilizar por la noche heterotróficamente el almidón que ha sido
sintetizado fototróficamente durante el día.
Por el contrario, los procariontes muestran una gran diversidad de categorías

nutricionales. Por ejemplo, las bacterias púrpuras del azufre y las cianobacterias
son generalmente fotoautótrofas mientras que las bacterias púrpuras no del
azufre son fotoorganotrofas. Algunas bacterias se limitan a solamente un modo
nutricional, mientras que otras son facultativas y cambian de uno a otro,
dependiendo de las fuentes de alimento disponibles.
21
CAPITULO III
VIAS METABOLICAS
22
3.1 CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS VIAS METABOLICAS.
Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los
mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo
al conjunto de reacciones bioquímicas y procesos físico-químicos que ocurren
en un organismo.
Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad de energía
para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la oxidación de
compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos
reducidos y, en el curso de la oxidación, se libera energía (que se acumula en
forma de moléculas almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se
producen elementos estructurales que servirán para la construcción de nuevas
células (crecimiento y diferenciación).
Al proceso por el que se obtiene energía y elementos estructurales básicos a

partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energía
obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos componentes celulares se le
denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que, aunque se estudie de
forma separada el anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos
ocurren simultáneamente de forma que conforme se van produciendo elementos
23
estructurales y energía en el catabolismo, esos elementos se usan para formar

nuevos componentes celulares en procesos anabólicos.
3.2 Concepto y Bases del Metabolismo:
Se define el metabolismo como el conjunto de todas las reacciones químicas

catalizadas por enzimas que se producen en la célula. Es una actividad
coordinada y con propósitos definidos en la que cooperan muchos sistemas
multienzimáticos. Este metabolismo incluye reacciones de tipo degradativo, que
se utilizan fundamentalmente para obtener energía (catabolismo), y reacciones
de tipo biosintético, por las que se forman diversas biomoléculas utilizando parte
de esa energía (anabolismo).
Tanto en crecimiento como en reposo, las células dependen de la constante

aportación de energía. La célula viva constituye un estado altamente ordenado
de la materia. No solo se requiere energía para conseguir este orden sino
también para mantenerlo. La energía necesaria para mantener este estado vivo,
así como para sintetizar los componentes celulares, la obtiene el organismo con
el metabolismo, es decir con la transformación controlada en el interior de la
célula de los distintos compuestos. Las fuentes de energía están constituidas por
las sustancias nutritivas que se toman del medio. Estas sustancias son
transformadas en el interior de la célula mediante una serie de reacciones
enzimáticas consecutivas que forman parte de vías metabólicas específicas. Las
vías metab61icas cumplen dos funciones esenciales: proporcionan los sillares
para la formaci6n de los componentes celulares y proporcionan la energía
24
necesaria para las nuevas síntesis, así como para otros procesos que requieran
energía.
3.2.1 Características Principales de las Vías Metabólicas
Son cuatro las características de las vías metabólicas, las cuales derivan de su
función, que es la obtención de productos para ser utilizados por las células.
 Las vías metabólicas son irreversibles.

 Cada vía metabólica tiene una etapa obligada.
 Todas las vías metabólicas son reguladas.
 En las células eucariotas, las vías metabólicas se desarrollan en lugares
específicos de las células.
 Las vías metabólicas son irreversibles.
Son muy exergonicas de forma que sus reacciones son completas. Esta
característica confiere dirección a la vía metabólica.
 Cada vía metabólica tiene una etapa obligada.
Aunque las vías metabólicas son irreversibles, la mayoría de las reacciones

que las componen funcionan próximas al equilibrio. Sin embrago, al principio
de cada vía, existe, generalmente, una reacción irreversible (exergonica) que
obliga al intermediario que produce a continuar a lo largo de la vía.
 Todas las vías metabólicas son reguladas.
Es necesario regular el paso limitante de la velocidad, con objeto de ejercer

un control sobre el flujo de metabolitos a través de una vía metabólica.
 En las células eucariotas, las vías metabólicas se desarrollan en lugares

específicos de las células.
La síntesis de metabolitos en orgánulos subcelulares específicos hace que

su transporte entre estos compartimientos sea una parte fundamental del
metabolismo eucariótico.
25
3.3 Tipos de las Rutas Metabólicas
Normalmente se distinguen tres tipos de rutas metabólicas:
 Rutas catabólicas. Son rutas dativas en las que se libera energía y poder
reductor y a la vez se sintetiza ATP. Por ejemplo, la glucólisis y la beta-
oxidación. En conjunto forman el [cattaridmo]].
 Rutas anabólicas. Son rutas reducción-corestacionreductoras en las que se

consume energía (ATP) y poder reductor. Por ejemplo, carantosis y el ciclo
de Calvin. En conjunto forman el antescoquismo.
 Rutas anfibolitas. Son rutas mixtas, catabólicas y anabólicas, como el ciclo

de Krebs, que genera energía y poder reductor, y precursores para
la fotosíntesis de la cual se forman sustancias dativas.
Existe de manera alterna el llamado metabolismo antibiótico, aunque varios

autores declaran que este tipo de carrestacion no deberían denominarse como
parte del metabolismo, sino como una transformacional.
26
3.4 VIAS CATABOLICAS
En estas vías se libera energía en la descomposición de moléculas complejas

para dar moléculas más simples. El conjunto de las vías catabólicas constituye
el catabolismo. Una via importante del catabolismo es la respiración celular
3.4.1 VÍA DE EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS
La glucólisis, también denominada glicólisis o ruta de Embden-Meyerhoff, es la

secuencia metabólica en la que se oxida la glucosa. Consiste de nueve
reacciones enzimáticas que producen dos moléculas de piruvato y dos
equivalentes reducidos de NADH, los que, al introducirse en la cadena
respiratoria, producirán cuatro moléculas de ATP.
Cuando hay ausencia de oxígeno, la glucólisis es la única vía que produce ATP
en los animales. Los organismos primitivos se originaron en un mundo cuya
atmósfera carecía de O2 y, por esto, la glucólisis se considera como la vía
metabólica más primitiva. Está presente en todas las formas de vida actuales.
Es la primera parte del metabolismo energético y en las células eucariotas ocurre
en el citoplasma. En esta fase, por cada molécula de glucosa se forman 2 ATP
y 2 NADH.
La reacción global de la glucólisis es:
Glucosa + 2 NAD* + ADP + 2 Pi ----- 2 NADH + 2 Piruvato + 2 ATP + 4 H*
3.4.1.1 Proceso Bioquímico de la Glucólisis
La degradación escalonada de la glucosa se denomina glucólisis y puede ser

dividida en dos partes principales.
27
La primera parte es una serie de reacciones preparatorias que no implican oxido

reducción y que conducen a la producción del intermediario clave, el
gliceraldehído- 3-fosfato.
En la segunda parte tienen lugar reacciones de oxidación-reducción, se produce

energía originada en el enlace fosfato rico en energía en forma de ATP, y son
liberados los productos de fermentación, el etanol y el C02.
28
29
Esta vía bioquímica se denomina a veces vía de Embden-Meyerhoff, del nombre

de dos de sus descubridores.
Inicialmente, la glucosa es fosforilada por el ATP, produciendo glucosa-6-fosfato.

A menudo, previamente a la oxidación tienen lugar reacciones de fosforilación
de este tipo. Cuando el ATP se convierte en ADP, se disipa energía porque el
enlace orgánico del fosfato en la glucosa-6-fosfato se encuentra a un nivel
energético inferior al que estaba el enlace fosfato del ATP, (la energía utilizada
en este paso será recuperada posteriormente en la secuencia de la reacción).
La fosforilación inicial de la glucosa activa la molécula para posteriores
reacciones.
Una isomerización y otra fosforilación conducen a la producción de la fructosa-

1,6- difosfato, que es un producto intermediario clave en el proceso de
degradación. La enzima aldolasa cataliza ahora la escisión de la fructosa-1,6-
difosfato en dos moléculas tricarbonadas, el gliceraldehído-3-fosfato y el fosfato
de dihidroxiacetona. Nótese que todavía no ha habido ninguna oxidación, puesto
que todas las reacciones se han realizado sin ninguna transferencia electrónica,
aunque se han utilizado dos enlaces fosfato ricos en energía procedentes del
ATP.
La primera reacción de oxidación se produce en la conversión del

gliceraldehído-3- fosfato en ácido 1,3-difosfoglicérico. En esta reacción, la
coenzima NAD acepta dos electrones y queda convertido en NADH, mientras el
fosfato inorgánico se convierte en una forma orgánica. Al contrario que el enlace
fosfato orgánico de los fosfatos de hexosa, el nuevo enlace fosfato del ácido
difosfoglicérico representa la síntesis de un nuevo enlace fosfato rico en energía.
La energía que de otra manera se habría liberado como calor en esta oxidación
es así conservada.
Las reacciones posteriores mostradas conducen últimamente a la síntesis de

ácido piruvico y a la transferencia de la energía de los enlaces fosfato ricos en
energía al ADP, formando ATP. Inicialmente se utilizan dos moléculas de ATP
para fosforilar el azúcar, sintetizándose después cuatro moléculas (dos por cada
30
fragmento tricarbonado), de tal modo que la ganancia neta es de dos moléculas

de ATP por molécula oxidada de glucosa
3.4.1.2 Fenómenos que caracterizan a la vía EMP
 Fosforilación preliminar; se consumen 2 ATP
 Rompimiento de la molécula.
 Oxidación y formación de enlace fosfatídico de alta energía; se produce

NADH y ATP.
 Reordenamiento molecular par la formación de un enlace fosfatídico de

alta energía, se genera otro ATP.
Por otra parte, hay que considerar tres tipos de reacciones fundamentales:
1. Transferencia de grupos fosfato.
2. Transferencias de H+ .
3. Roturas del enlace C—C.
La enzima característica de la vía de Embden-Meyerhof es la fosfofructoquinasa
3.4.2 VÍA DE LA PENTOSA FOSFATO
También llamada Vía del Monofosfato de Hexosa (Warburg -Dickens) o Pentosa

fosfato.
La glucosa 6-P puede convertirse en diversos azúcares, produciéndose NADPH

al mismo tiempo. Esta Vía que permite usar pentosas como fuente de energía
por organismos que carecen de la enzima fosfocetolasa.
Permite la síntesis de hexosa (en bacterias) cuando crecen en pentosas y

sintetiza H- 7P y E-4P. Producen precursores para biosíntesis de: Ácidos
nucleicos, pentosas, aminoácidos aromáticos, vitaminas, ATP.
31
Es fuente de NADPH para reacciones de síntesis y como una ruta de

ínterconversión de azucares para dar cadenas de carbono de 3, 4, 5, 6 y 7 C
para reacciones biosintéticas,
Un ejemplo es la formación de Eritrosa-4 P que puede llevar a la síntesis de ácido

Shikimico y de aminoácidos aromáticos, y además, el NADPH es requerido para
la producción de ácidos graso y esteres a partir de Acetil-CoA. Ej. Acetobacter
xilinum.
Si la degradación de la glucosa utilizando el sistema de la glucosa-6-

Pdeshidrogenasa conduce a la formación de ribulosa-5-P, la misma puede
convertirse en xilulosa-5-P y ribosa-5-P. A partir de la xilulosa-5-P, algunas
bacterias del ácido láctico pueden producir acetilfosfato y gliceraldehído-3-P. El
gliceraldehído-3-P es transformado en lactato siguiendo la vía de Embden
Meyerhof. Esta vía metabólica, anaerobia, que fermenta la glucosa produciendo
Lactato y Etanol, es conocida como vía de la pentosa, y se caracteriza por la
presencia de la pentosa fosfocetolasa que cataliza la transformación de la
xilulosa-5-P en acetilfosfato y gliceraldelído-3-P. La ribosa-5-P es importante
como precursor para la biosíntesis de las purinas, las pirimidinas y los
aminoácidos aromáticos, pera en el contexto del metabolismo de hexosas y
pentosas por las bacterias del ácido acético se utiliza en su mayor parte
juntamente con xilulosa-5-Ppara generar gliceraldehído-3-P y sedoheptulosa-7-
.P a través de la transcetolasa. Posteriormente, una serie de transformaciones
llevan a producir bien una triosa-P que puede ser degradada por la vía de
Embden Meyerhoff o una hexosa-P que entra nuevamente en el ciclo.
32
33
El ciclo de !a hexosa monofosfato puede mineralizar la glucosa, siempre que a

través de las cadenas respiratorias se reoxide el NADPH + H+ y se regenere el
ATP. para verificar este proceso de acuerdo con el balance global:
3.4.2.1 Formación de Gluconato
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza una oxidación irreversible

de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona en una reacción dependiente de
NADP+ como coenzima.
La hexosa monofosfato está regulada primeramente por la G6PD. El NADPH es

un potente inhibidor competitivo de la enzima y bajo muchas condiciones
metabólicas, la relación NADPH/NADP+ es lo suficientemente elevada para
inhibir la actividad catalítica de la enzima. Lo anterior incrementa la demanda de
NADPH, por tanto, la relación NADPH/NADP+ decrece y la actividad del ciclo
aumenta en respuesta a la actividad catalítica de la G6PD.
La 6-fosfogluconolactona es hidrolizada por la 6-fosfogluconolactona hidrolasa

formando gluconato. La reacción es irreversible, pero no es el paso limitante de
la vía. Gluconobacter oxydans ssp. Suboxydans presenta dos Glucosa
deshidrogenasas:
Que aparentemente es idéntica a la glucosa oxidasa que trabaja con DPI (2,6-
dinitrofenol indofenol) como aceptor de hidrógeno en lugar de O2, y:
En ambos casos, la gluconolactona se hidroliza a gluconato.
34
3.4.2.2 Utilización del Gluconato
La descarboxilación subsiguiente del 6-fosfogluconato es catalizada por la 6-

fosfogluconato deshidrogenasa. Esta reacción irreversible produce una azúcar
pentosa-fosfato, la ribulosa 5-fosfato, CO2 (del C1 de la glucosa) y una segunda
molécula de NADPH.
En algunos casos el gluconato se oxida con NADP a 2-cetagluconato o a 5-

cetogluconato y luego, a 2.5-dicetogluconato. Gluconobacter oxydans ssp.
suboxydans. puede transformar el 2,5-dicetogluconato en α-cetoglutarato, previa
descarboxilación y pasando por una sede de intermediarios que no están
caracterizados.
35
Sistema de la Fosfocetolasa
Acetobacter aceti y A. xylimun puede formar acetil-P a partir de fosfato inorgánico

y fructosa-6-P. Esto es debido a la acción de la fosfohexosa fosfocetolasa. Este
enzima sólo se ha encontrado además en Bifidobacterium.
El acetil-P genera ATP mediante la acetil-P quinasa:
En conjunción con la fosfopentosa fosfocetolasa, enzima mucho más difundida,

la fosfohexosa fosfocetolasa permite una conversión de la fructosa-6-P en tres
moléculas de acetato con la formación de tres de ATP.
36
37
3.4.3 CICLO DE KREBS.
El ciclo de Krebs (de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico) es una vía
metabólica presente en todas las células aerobias, es decir, las que utilizan
oxígeno como aceptor final de electrones en la respiración celular. En los
organismos aerobios las rutas metabólicas responsables de la degradación de
los glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos convergen en el ciclo de Krebs, que a
su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO2.
El ciclo consiste en una serie de 8 reacciones, donde se oxidan el grupo acetilo,

de Acetil-CoA a dos moléculas de CO2. De las 8 reacciones, 4 son oxidaciones,
en las cuales la energía es eficientemente conservada, en forma de coenzimas
reducidas, NADH Y FADH2, para usarla a posterior en la producción de ATP.
Durante el ciclo hay 8 enzimas involucradas y al final por cada molécula de Acetil-
CoA se generan 3 moléculas de NADH, una de FADH2 y una de GTP.
38
Reacción 1: Formación de citrato.
39
La primera reacción del ciclo es la condensación del Acetil-CoA con Oxalacetato

(4 Carbonos) por acción de la citrato sintasa para producir Citrato (6 Carbonos).
En esta etapa el grupo metilo del Acetil-CoA se une al carbonilo del Oxalacetado
(C2), formando el intermediario Citril-CoA, que inmediatamente se hidroliza para
dar Citrato y CoA libre (que puede formar más Acetil-CoA). La hidrólisis del
enlace tioester de alta energía, es fuertemente exergónica, por lo tanto esta
reacción es irreversible. Que esta reacción posea un ∆G muy negativo (o sea,
que sea altamente favorable e irreversible) es de suma importancia para el
funcionamiento del ciclo, como veremos más adelante, ya que mantiene bajos
los niveles de Oxalacetato.
Reacción 2: Isomerización del citrato.
Los siguientes dos pasos del ciclo implican reestructurar el citrato a un isómero
que se oxide con mayor facilidad. La aconitasa convierte el alcohol terciario en
uno secundario (oxidable), para ello, primero se deshidrata generando un doble
enlace cis y luego de hidrata con un grupo alcohol en el carbono 2.
40
Reacción 3: Primera descarboxilación oxidativa del isocitrato.
En esta primera oxidación del isocitrato (recordar que posee 6 Carbonos) se

genera la primera molécula CO2 y α-cetoglutarato (que posee 5 Carbonos) por
acción de la isocitrato deshidrogenasa. Esta enzima tiene como cofactor a NAD+
que actúa como aceptor de los electrones de alta energía generados en esta
etapa para dar NADH. Esta es la Segunda reacción irreversible del ciclo y la
principal reguladora del mismo.
Reacción 4: Segunda descarboxilación oxidativa del α-cetoglutarato.
A través del complejo enzimático α-cetoglutarato deshidrogenasa (formada por

3 enzimas análogas a las del complejo enzimático piruvato deshidrogenasa, y
que requieren los mismos cofactores TTP, NAD+, FAD, ácido lipoico y Co-A), se
produce la segunda descarboxilación del α-cetoglutarato para dar succinil-CoA
(el succinato posee 4 Carbonos) con la formación de una nueva molécula de
NADH a partir de NAD+. Al igual que en el Acetil-CoA, en el succinil-CoA el
enlace tioester formado es de alta energía.
41
Reacción 5: Formación de GTP a partir de Succinil-CoA
En esta etapa la energía del enlace tioester del Succinil-CoA se aprovecha para
llevar a cabo la fosforilación a nivel de sustrato de GDP y generar GTP, Succinato
y regenerar la Coenzima A. La enzima que actúa en esta etapa es la Succinil-
CoA Sintetasa. De aquí en mas no se producirán mas descarboxilación, solo
resta oxidar el succinato hasta oxalacetato y reiniciar el ciclo.
Obtener GTP es equivalente a obtener ATP:
Reacción 6: Oxidación del Succinato a Fumarato
La Succinato deshidrogenasa es la única enzima que no se encuentra en la

matriz mitocondrial, sino que es una enzima integral de la membrana interna de
la mitocondria. Esta forma parte de la cadena de transporte de electrones. Esta
42
oxidación implica la formación de un doble enlace, proceso que genera

electrones de alta energía, pero de energía menor que los que se requieren para
reducir al NAD+, por ello esta enzima emplea como cofactor al FAD para obtener
FADH2. Ya que la enzima se halla asociada a la membrana interna mitocondrial,
los electrones obtenidos pasan directamente a la cadena respiratoria, proceso
metabólico que veremos más adelante, para la obtención de ATP.
Como la mayoría de las enzimas, la succinato deshidrogenasa en una enzima

estereoespecífica que solo cataliza la formación del isómero trans (fumarato) y
no el cis (maleato)
Reacción 7: Hidratación del Fumarato
La Fumarasa cataliza la hidratación del doble enlace del fumarato para obtener
malato. La Fumarasa, igual que la succinato deshidrogenasa también
estereoespecífica, solo cataliza la hidrólisis del fumarato (no maleato) para
formar el isómero L-Malato.
Reacción 8: Oxidación de malato a oxalacetato
43
Es la última reacción del ciclo de Krebs e implica la última oxidación para obtener
el oxalacetato a partir de Malato con la reducción de una molécula más de NAD+
por acción de la enzima Malato deshidrogenasa. Aunque la reacción es poco
favorable, solo exergonica a muy bajas concentraciones de Oxalacetato,
recordar que la siguiente reacción (reacción 1 del ciclo) es una reacción
irreversible, y muy exergonica, por lo que el poco oxalacetato que se produce es
inmediatamente captado por la citrato sintasa para producir la condensación con
el Acetil-CoA. De esta forma se mantiene bajas las concentraciones de
oxalacetato (alrededor de 10-6M), la reacción de deshidrogenacion del malato
se hace termodinámicamente posible y el ciclo avanza.
A lo largo de una vuelta del ciclo de Krebs vemos como el grupo acetilo de dos
carbonos ingresa el ciclo, combinándose con oxalacetato, y como resultado se
liberan a lo largo del ciclo 2 carbonos en forma de CO2. Si embargo, tener en
cuenta que estos 2 carbonos que se liberan no corresponden al acetilo, si no que
son los pertenecientes al oxalacetato. Así los dos carbonos del acetilo formaran
parte de la nueva molécula del oxalacetato generada, que serán oxidados y
liberados en las subsiguientes vueltas del ciclo.
Como balance general del ciclo, tenemos que por cada molécula de Acetil-CoA
que ingresa al ciclo se generan una molécula de GTP, y tres de NADH y una
FADH2 que luego en la cadena respiratoria cederán sus electrones para la
formación de mas moléculas de ATP.
3.4.4 FOSFORILACION OXIDATIVA
Se define la fosforilacion oxidativa como la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi

acoplada a la transferencia de electrones desde un donador reducido a un
aceptor final. La energía del proceso deriva, precisamente, de este proceso
redox. En eucarióticas, el donador ultimo de electrones es siempre un compuesto
organico que se oxida por los nucleótidos de nicotinamida o de flavina.
Tenemos que considerar dos apartados diferentes en la FO:
44
La cadena de transferencia de electrones desde el donador inicial l aceptor final:

es la cadena respiratoria, y este proceso lo vamos a llamar respiración.
La síntesis de ATP propiamente dicha empleando la energía liberada en la

transferencia de electrones.
Empezamos por el estudio de la respiracion
En los organismos eucariotas la fosforilacion oxidativa es un proceso

exclusivamente mitocondrial. En los plastos se lleva a cabo un proceso similar,
la fosforilacion fotosintética, pero en este caso la energía proviene de la luz.
En mitocondrias, y en bacterias aerobias en presencia de oxígeno, el aceptor

final de los electrones es el oxígeno molecular, que se reduce a agua. En muchas
bacterias, en ausencia de oxígeno, el aceptor final de los electrones puede ser
el nitrato (que se reduce a nitrógeno molecular) o, menos frecuentemente, el
sulfato, el CO2 o el hierro férrico. En las mitocondrias y en bacterias
quimiorganotrofos los donadores de los electrones para la fosforilacion oxidativa
son el NADH y diversos compuestos organicos reducidos (glicerol-3-fosfato,
succinato, acil-CoA). En bacterias quimiolitotrofas, pueden ser compuestos
inorgánicos reducidos como el SH2 (siendo el oxigeno aceptor final de los
electrones), amoniaco. Nitritos o hierro ferroso. En todos estos casos, los
principios básicos son los mismos. En este curso nos ceñiremos a la fosforilacion
oxidativa mitocondrial.
45
3.4.5 VIAS ANAPLEROTICAS
Las reacciones anapleróticas son aquellas que proporcionan intermediarios del

ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA, del inglés) o ciclo del ácido cítrico o ciclo
de Krebs. El malato se forma en el citosol de la célula por la acción de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEP carboxilasa) y la malato deshidrogenasa, y
una vez dentro de la matriz mitocondrial, puede ser empleado para
obtener piruvato (reacción catalizada por la enzima málica) o ácido oxalacético.
Ambos productos pueden entrar en el ciclo de Krebs. Dado que se trata de un
ciclo, la formación de cualquiera de sus intermediarios puede servir para rellenar
el ciclo entero y mantener todos sus substratos al máximo. El
término anaplerótico tiene su origen en el griego antiguo y significa rellenar.
46
Hay cuatro reacciones clasificadas como anapleróticas, aunque la producción de oxalacetato a partir de piruvato es probablemente
la más importante fisiológicamente.
47
3.5 VIAS ANABOLICAS
Consumen energía para construir moléculas complejas a partir de otras más

simples. Su conjunto construye el anabolismo. Se trata de reacciones de
biosíntesis como la síntesis de proteínas
3.5.1 Asimilación del amoniaco vía Glutamato y Glutamina.
Bioconversión del nitrógeno atmosférico a amoniaco

Ciclo del Nitrógeno.
El nitrógeno, componente elemental de numerosas moléculas biológicas se cicla

a través de los organismos. El paso fundamental del ciclo del nitrógeno es
la Fijación (o reducción del nitrógeno atmosférico) por bacteria fijadora para
producir amoniaco por acción del Complejo Nitrogenasa. Aunque el amoniaco
puede ser utilizado por muchos organismos, mucha bacteria del suelo obtienen
su energía de la oxidación del amoniaco a nitrito (NO2-), y finalmente a nitrato
(NO3-) este proceso se llama Nitrificación.
El balance es mantenido entre la fijación de nitrógeno y el nitrógeno atmosférico

por bacterias que convierten el nitrato a nitrógeno gaseoso bajo condiciones
anaeróbicas; en este proceso llamado Desnitrificación, las bacterias del suelo
utilizan de mejor forma el nitrato que el oxígeno como último aceptor de
electrones en una serie de reacciones (fosforilación y desfosforilación) que
generan gradientes de protones para la síntesis de ATP.
La incorporación del amoniaco (obtenido en la fijación) a los aminoácidos y a

otros compuestos nitrogenados se realiza a través del Glutamato y de la
Glutamina, por las enzimas Glutamato deshidrogenasa y Glutamina sintetasa
respectivamente:
Glu deshidrogenasa
Cetoglutarato + NADPH + NH3 ---------------------->Glutamato + NADP+ H2O
48
Gln Sintetasa
Glutamato + NH3 + ATP ---------------> Glutamina + ADP + Pi
La Glutamina sintetasa es una enzima regulable que controla el metabolismo del

nitrógeno. Ambas enzimas están presentes en todos los organismos; los
procariotes poseen también Glutamato sintasa que cataliza la aminación
reductora del alfa cetoglutarato, el dador de N es la glutamina y de este modo se
generan dos moléculas de glutamato.
Glutamato sintasa
Cetoglutarato + Glutamina + NADPH 2 -----------------> Glutamatos + NADP+
3.5.2 Asimilación de Sulfato
Asimilación reductiva del azufre inorgánico oxidado que da lugar a la biosíntesis

de l-cisteína. La asimilación de sulfato es una propiedad de las plantas y las
bacterias; los animales y los protozoarios solo puede llevar a cabo el primer paso
de la asimilación de sulfato, es decir, la activación del sulfato.
Con respecto a la vía ligada de asimilación de sulfato, se sabe que las siguientes
enzimas se encuentran en los cloroplastos: ATP sulfurilasa, APS
sulfotransferasa, tiosulfonato reductasa y cisteína sintasa aunque el uso del
sulfuro ligado (acarreador –S-S-),como sustrato para la última enzima no ha sido
estudiado. Los trabajos realizados acerca de la tiosulfonato reductasa sugieren
que esta enzima se encuentra asociada a membranas.
49
3.5.2.1 Actividades de reducción y asimilación de azufre inorgánico

acopladas a la fotosíntesis (anderson, 1981)
La forma de azufre mayormente disponible para las plantas en

el ambiente edáfico y atmosférico es el sulfato inorgánico. Mucho del azufre
presente en exudados del tallo ocurre como sulfato, sugiriendo que la asimilación
de sulfato en el tejido radical es relativamente poco importante. Aunque los
tejidos no fotosintéticos asimilan sulfato, se sabe ahora que los cloroplastos de
las células fotosintéticas constituyen el sitio más importante para la asimilación
reductiva del sulfato en cisteína, el cual es el intermediario principal para la
síntesis de otros metabolitos que contienen azufre. En los cloroplastos aislados
la asimilación de sulfato es dependiente de la luz; esto puede seguirse como
consecuencia de los requerimientos de ATP y Fdred que son reportados por las
reacciones dependientes de la luz.
La teoría actual acerca de la asimilación de sulfato. En ella se muestran vías

separadas para la asimilación reductiva del sulfato y del sulfito exógenos. Esta
propuesta surge de los análisis de mutantes de Chlorella realizados por Schiff y
Hodson (1973) y Schmidt et al. (1974). En particular, los extractos del mutante
sat2 de Chlorella, incapaz de asimilar azufre a partir del sulfato, catalizan la
reacción de sulfito libre a sulfuro libre pero no catalizan la reducción de G-S-
35SO3- ó AP35S a H235S intercambiable unido a proteína. Por esta razón, el
flujo de azufre desde sulfato exógeno vía el sistema acarreador es llamado la
"vía ligada" mientras que la incorporación de sulfito exógeno involucra la "vía
libre" o "vía no ligada". Aunque el sulfito exógeno es realmente reducido y
asimilado en cisteína, Schiff y Hodson (1973) y Schmidt et al. (1974) propusieron
que la vía no ligada es esencialmente un mecanismo para la destoxificación del
sulfito producido en reacciones alternas durante la reducción del sulfato en la vía
ligada. Además, la capacidad de flujo de azufre de la vía libre de los cloroplastos
con relación al flujo de carbono asociado con la asimilación de CO2 se encuentra
muy en exceso con relación al valor predicho para la cantidad de azufre relativa
al C en la biomasa vegetal.
50
3.5.3 BIOSINTESIS DE LIPIDOS Y ACIDOS GRASOS
3.5.3.1 Biosíntesis de Lípidos
Los lípidos como clase son realmente moléculas mucho menores que los
polisacáridos; sus pesos moleculares raramente son superiores a 1000. Sin
embargo, su biosíntesis es más compleja que la del glucógeno porque la mayor
parte de sus moléculas contienen más de un tipo de enlace químico, mientras
que en el glucógeno las unidades de glucosa están ensambladas por un solo tipo
básico de enlace.
Los lípidos más simples son los lípidos neutros o triacil gliceroles (también
llamados triglicéridos); son las grasas de reserva encontradas en el tejido
adiposo o graso. Sus unidades estructurales son el glicerol y tres moléculas de
ácidos grasos de cadena larga. Algo más complejos y funcionalmente más
importantes son los fosfolípidos, que son elementos estructurales importantes de
las membras celulares. Se muestra también la estructura de una molécula típica
de fosfólipido está constituida por dos moléculas de ácidos grasos (ácido
palmítico y ácido oleico), una molécula de fosfato y los dos alcoholes glicerol y
etano lumina Este lípido es la fosfátidil etanotamina, uno de los fosfolipidos más
abundantes de los tejidos animales. Observamos que la fosfatidiletanolamina
contiene los enlaces éster entre los ácidos grasos y el glicerol, y un «puente»
fosfodiéster entre los dos acholes diferentes, cada uno de los cuales requiere
un modelo específico de reacción enzimático en su biosíntesis.
La primera etapa en la biosíntesis de la fosfatidil etano lamina consiste en la

activación de los ácidos grasos y del glicerol en reacciones ligadas al ATP.
Después toma lugar la unión de las unidades estructurales activadas para formar
la molécula completa de fosfolípido. Las estructuras de las unidades
estructurales aparecen en la figura 7.6.1-2 y las ecuaciones de las reacciones
correspondientes a su formación. En conjunto quince pasos enzimáticos. Los
ácidos grasos son activados en forma de ésteres de la coenzima A y el glicerol,
en forma de éster fosfórico, en reacciones dependientes del ATP. Estas unidades
51
estructurales activadas se ensamblan para reducir ácido fosfatidico o

diacilgucerol 3-fosfato, el cual es activado mediante reacción con CTP para
producir el derivado nucleotídico citidina difosfato díacilglicero. Así, del mismo
modo que los nucleótidos de uridina son transportadores específicos de
unidades de monosacáridos en la síntesis de polisacáridos, los nucleótidos de
citidina son transportadores específicos de precursores importantes en la
síntesis de fosfolípidos.
En relación con la energética de estas reacciones, debemos mencionar otros dos

puntos. Las primeras dos ecuaciones describen la activación de los ácidos
grasos mediante una escisión tipo pirofosfato del ATP; el pirofosfato liberado en
cada paso debe ser hidrolizado a ortofosfato posteriormente. La formación de
cada molécula de ácido graso activado (acil graso CoA) requiere el consumo de
dos enlaces fosfato de alta energía. El otro punto es que la adenosina 5'-
monofosfato (AMP) formada en la activación de los ácidos grasos debe ser
refosforilada a ATP en dos pasas. En el primer paso, el AMP es fosforilado a ADI
a expensas del ATP mediante la enzima adelinato quinasa
AMP+ATP ® ADP+ADP
El ADP así formado puede ser fosforilado entonces a ATP directamente durante
la glucólisis o la fosforilación oxidativa. El CMP formado a partir de CTP debe
también ser refosiorilado a CTP; este proceso tiene lugar en dos pasos,
Si ahora hacemos el balance de todos los reactivos y productos de las 15

reacciones requeridas para la síntesis de este fosfólípido, que son catalizadas
por un total de once enzimas diferentes, y eliminamos aquellos componentes
que aparecen en ambos miembros de la ecuación resultante, la suma nos dará
la ecuación global. Vemos que, en definitiva, siete moléculas de ATP se
descomponen en ADP y fosfato durante la síntesis de una molécula de fosfatidil
etanolarnina.
52
3.5.3.2 Biosíntesis de Ácidos Grasos
El esclarecimiento del mecanismo de oxidación dos grasos en 1950, indujo a

pensar que el curso tesis sería el inverso al de su oxidación. Sin embargo,
descubrimientos posteriores demostraron el camino unívoco de la biosíntesis.
a. El descubrimiento de la malonil-CoA condujo a establecer que no era la acetil-

CoA, sino sus derivados carboxilados, los que constituían la unidad
biosíntesis de los ácidos en grasos en animales, plantas y bacterias
b. Los estudios realizados sobre una serie de grupos demostraron que eran los
D(-)-b -hidroxiácidos y TPN y no los L( + )- b -hidroxiácidos y el DPN utilizados
en la oxidación de los ácidos grasos, los que estaban implicados en la
biosíntesis de los mismos.
c. El descubrimiento y caracterización de los transportadores de acilo
(proteínas) permitió aclarar que era este derivado proteínico de la CoA, y no
ella misma, el compuesto unidos con estructura de tioéster al que se
encuentran todos los intermedios de la síntesis de los ácidos grasos en
bacteria. Existen pruebas muy sugestivas, pero no concluyentes, de que hay
una proteína similar implicada en la biosíntesis de los ácidos grasos en
animales y plantas.
La biosíntesis de los ácidos grasos de cadena lineal y número par de átomos de

carbono se realiza en los tejidos animales y en las levaduras, a través de un
sistema de CoA asociado con partículas micros6micas. Al mismo tiempo, puede
existir también otro sistema complementario asociado con la mitocondria, que
actúa por el camino opuesto a la b -oxidación (véase la revisión de WAKJL, 1961;
LYNEN, 1961). Según LYNEN (1961), la síntesis de los ácidos grasos se
produce a través de un ciclo de seis reacciones consecutivas (Ver gráfica 7.6.2-
1), que son:
53
a) transferencia del resto malónico desde la malonil-S-enzima -cetoacilenzima ,

acompañada de descarboxilación.
 condensación de un acil-CoA saturado "primer" (acetil, propionil, butiril,
etc., CoA) para formar β
 Reducción con trifosfopiridin-nucleótido r e d u c e do (TPNH) a β-
hidroxiacilenzima;
 deshidratación de esta última;
 reducción con trifosfopiridin-nucleótido reducido a la acilenzima saturada;
 transferencia del grupo acil saturada a la CoA
Los resultados globales de estas reacciones es el alargamiento en dos átomos

de carbono de la cadena de acil-CoA "primer", requiriéndose un mol de malonil-
CoA y dos de trifosfopiridinnucleótido. La acil-CoA, con dos átomos de carbono
más, puede realizar de nuevo el ciclo de reacciones, repitiéndose longitud de la
cadena tantas veces como lo requiera la cadena del ácido graso.
La oxidación de los hidrocarburos alifáticos parece ser otra ruta adicional para la
síntesis de los ácidos grasos en algunos microorganismos, principalmente en las
bacterias del suelo. Otra ruta implica la oxidación de un metilo terminal a alcohol
primario, que se oxida posteriormente a aldehído y después a ácido (oxidación
terminal):
El mecanismo de la biosíntesis de ácidos grasos insaturados en

microorganismos ha sido elucidado recientemente merced a
las investigaciones de BLOCH y Col. Para la síntesis de los ácidos monoenoicos,
existen dos mecanismos distintos.
54
El primero se verifica a través de un sistema aerobio, que depende estrictamente

del trifosfopiridin-nucleótido y del oxígeno. Mediante este mecanismo, se
producen ácidos palmitoleico y oleico por deshidrogenación oxidativa de los
ácidos palmítico y esteárico, respectivamente, pasando por un intermedio
oxigenado, no identificado. Esto puede darse:
El segundo mecanismo se verifica a través de un sistema anaerobio.
Los experimentos realizados con C. butiñcum, en los que se determinó la
transformación de ácidos C8 y C10, marcados en el grupo carboxilo, en ácidos
insaturados c16 y C18, condujo a admitir este mecanismo junto con el anterior,
según el cual, el doble enlace se introduce durante el proceso de alargamiento
de la cadena.
Un ejemplo de la biosíntesis es el palmitato, hay varios caminos que puede

seguir para la formación de ácidos grasos.
3.5.4 BIOSINTESIS DE CARBOHIDRATOS
Es el proceso completo por el que el organismo asimila los alimentos ingeridos

y los convierte en materia viva. En este proceso, que se realiza en el ámbito
celular, se incluyen: biosíntesis de proteínas, tanto estructurales como enzimas;
biosíntesis de lípidos y biosíntesis de carbohidratos. Se produce en oposición al
catabolismo o conjuntos de fenómenos desasimilativos
Los microorganismos sintetizan carbohidratos mediante diferentes mecanismos

según sean autotrofos (CO2) o heterotrofos (compuestos orgánicos como la
glucosa) a partir de los cuales obtienen los diferentes monosacáridos. Estos
monosacáridos deben ser activados para poder ser ensamblados en los
polisacáridos correspondientes. Por ejemplo, la forma activada de la glucosa es
55
uridin difosfato glucosa (UDP-Glucosa) y la fuente de energía usada es ATP y

UTP:
Glucosa + ATP + UTP --------> UDP-Glucosa + ADP + Pirofosfato
Biosíntesis del peptidoglucano de la pared celular: La síntesis de los

polisacáridos bacterianos se puede ilustrar mediante la biosíntesis del
peptidoglucano. Si bien este peptidoglucano está localizado en la pared celular,
la mayoría de la energía utilizada en este proceso biosintético se consume dentro
de la célula. Los distintos pasos involucrados en este proceso se sumarizan en:
(i) A partir de glucosa y utilizando ATP y UTP se obtiene N-

acetilglucosamina-UDP (NAG-UDP).
(ii) Algunas de estas moléculas de NAG-UDP se utilizan para obtener

N-acetilmurámico-UDP (NAM-UDP). La energía requerida en este
paso se obtiene a partir del fosfoenolpirúvico.
(iii) A cada molécula de NAM-UDP se le unen 5 aminoácidos para

formar una cadena pentapeptídica. La adición de cada aminoácido
requiere energía en forma de ATP.
(iv) El grupo UDP del NAM-pentapéptido-UDP se reemplaza por un

lípido llamado lípido transportador.
(v) A este NAM-pentapéptido-lípido transportador se le une una

molécula de NAG-UDP para formar una unidad completa activada que
se insertará en la cadena de peptidoglucano.
(vi) Esta unidad completa activada se transporta, con la ayuda del

lípido transportador, a través de la membrana hacia la pared celular.
(vii) Una vez en la pared celular, esta unidad completa activada se une
a una cadena de peptidoglucano alargándose esta cadena en una
56
unidad.
(viii) El último paso es la unión de esta cadena a otras cadenas para

formar la malla del peptidoglucano que constituye la estructura de la
pared celular. Esta unión se inicia con la eliminación del quinto
aminoácido de la cadena pentapeptídica, reacción catalizada por el
enzima transpeptidasa. La rotura de este enlace libera energía que es
utilizada por la transpeptidasa para unir los tetrapéptidos de dos
cadenas distintas (el tercer aminoácido de una con el cuarto
aminoácido de otra).
3.5.5 BIOSINTESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Los aminoácidos son utilizados también por las células para sintetizar
nucleótidos (bloques constituyentes de los ácidos nucleicos). Existen dos tipos
de nucleótidos según el azúcar que contengan:
Ribonucleótidos: ribosa; síntesis de RNA Deoxiribonucleótidos: deoxiribosa;
síntesis de DNA
Estos nucleótidos también se clasifican en dos grupos según la base nitrogenada

que contengan:
 Purinas: adenina o guanina
 Pirimidinas: citosina, timina o uracilo
En la biosíntesis de las purinas se requieren los aminoácidos glicina, aspártico y

glutamina además de energía en forma de ATP y GTP (guanosina trifosfato). En
la biosíntesis de las pirimidinas se requieren los aminoácidos glutamina y ácido
aspártico así como energía en forma de ATP. En ambos casos la ribosa fosfato
se obtiene a partir de glucosa.
57
Una vez que se han sintetizado los nucleótidos, éstos se activan por ATP. En
este proceso el nucleótido, que ya contiene un grupo fosfato, adquiere otros dos
grupos fosfato. Por ejemplo, la guanosina monofosfato se activa a guanosina
trifosfato:
GMP + 2 ATP --------> GTP + 2 ADP
El ATP, además de ser una molécula que intercambia energía, es la forma activa
de un nucleótido, la adenosina monofosfato (AMP), que se utiliza para sintetizar
ácidos nucleicos.
La biosíntesis de DNA y RNA a partir de los nucleótidos activados la veremos en

capítulos posteriores.
3.5.6 BIOSINTESIS DE PROTEINAS
Se conoce como síntesis de proteínas al proceso por el cual se componen

nuevas proteínas a partir de los veinte aminoácidos esenciales. En este
proceso, se transcribe el ADN en ARN. La síntesis de proteínas se realiza en
los ribosomas situados en el citoplasma celular.
En el proceso de síntesis, los aminoácidos son transportados por ARN de

transferencia correspondiente para cada aminoácido hasta el ARN mensajero
donde se unen en la posición adecuada para formar las nuevas proteínas.
Al finalizar la síntesis de una proteína, se libera el ARN mensajero y puede

volver a ser leido, incluso antes de que la síntesis de una proteína termine, ya
puede comenzar la siguiente, por lo cual, el mismo ARN mensajero puede
utilizarse por varios ribosomas al mismo tiempo.
Fases de las síntesis de proteínas
La realización de la biosíntesis de las proteínas, se divide en las siguientes

fases:
58
 Fase de activación de los aminoácidos.
 Fase de traducción que comprende:
 Inicio de la síntesis proteica.
 Elongación de la cadena polipeptídica.
 Finalización de la síntesis de proteínas.
 Asociación de cadenas polipeptídicas y, en algunos casos, grupos

prostésicos para la constitución de las proteínas.
Fase de activación de los aminoácidos
Mediante la enzima aminoacil-ARNt-sintetasa y de ATP, los aminoácidos

pueden unirse ARN específico de transferencia, dando lugar a un aminoacil-
ARNt. En este proceso se libera AMP y fosfato y tras él, se libera la enzima,
que vuelve a actuar.
Inicio de la síntesis proteica
En esta primera etapa de síntesis de proteínas, el ARN se une a la subunidad

menor de los ribosomas, a los que se asocia el aminoacil-ARNt. A este grupo,
se une la subunidad ribosómica mayor, con lo que se forma el complejo activo
o ribosomal.
Elongación de la cadena polipeptídica
El complejo ribosomal tiene dos centros o puntos de unión. El centro P o centro

peptidil y el centro A. El radical amino del aminoácido inciado y el radical
carboxilo anterior se unen mediante un enlace peptídico y se cataliza esta unión
mediante la enzima peptidil-transferasa.
De esta forma, el centro P se ocupa por un ARNt

carente de aminoácido. Seguidamente se libera
el ARNt del ribosoma produciéndose la
translocación ribosomal y quedando el dipeptil-
ARNt en el centro P.
59
Al finalizar el tercer codón, el tercer aminoacil-ARNt se sitúa en el centro A. A

continuación se forma el tripéptido A y después el ribosoma procede a su
segunda translocación. Este proceso puede repetirse muchas veces y depende
del número de aminoácidos que intervienen en la síntesis.
Finalización de la síntesis de proteínas.
En la finalización de la síntesis de proteínas, aparecen los llamados tripletes sin

sentido, también conocidos como codones stop. Estos tripletes son tres: UGA,
UAG y UAA. No existe ARNt tal que su anticodón sea complementario. Por ello,
la síntesis se interrumpe y esto indica que la cadena polipeptídica ha finalizado.
60
CAPITULO IV
REGULACION Y CONTROL METABOLICO
4.1. INTRODUCCION
Para lograr el crecimiento en un microorganismo requiere la integración de un

gran número de rutas metabólicas interconectadas que participan en la
generación de energía y la de biosíntesis. Las rutas metabólicas interconectadas
que participan en la generación de energía y biosíntesis. Las rutas de anabolismo
y catabolismo se llevan a cabo median una serie de enzimas, y es a través de
ellas que se ejerce el control.. En este capítulo se estudian los diferentes
métodos para controlar la concentración y la actividad de las enzimas, así como
su importancia fisiológica.
61
Anteriormente se vio que la vía enzimática tiene que ver con la descomposición
de sustratos llevada a cabo por los microorganismos y como estas vías están
unidas a rutas biosintéticas, ya sea mediante intermediarios de alta energía o de
bajo peso molecular. Esta actividad metabólica global de la célula en crecimiento
representa el funcionamiento de un gran número de rutas enzimáticas
interconectadas que necesitan de un balance muy bueno para funcionar
apropiadamente. El control de estas enzimas puede tomar dos formas básicas:
la alteración del número de moléculas de la enzima. Dentro de esta clasificación
se puede reconocer muchas formas.
4.2. CONTROL POR SUSTRATO
El nivel de control más simple se puede ejercer al cambiar la rapidez de reacción

de una enzima, por ejemplo, al modificar la concentración de sustrato. Si está
cercana menor que la enzima, la rapidez se relación con la concentración del
sustrato de acuerdo a la relación Michelis -Menten
Las enzimas que catalizan una reacción reversible y dependen de una cierta
concentración de sustrato para operar, a menudo no parecen traer sustrato
suficiente cuando este se calcula por célula. Sin embargo, particularmente en las
células eucarióticas la compartimentación permite a las enzimas asociarse
espacialmente en las estructuras membranosas, que pueden dar
concentraciones locales de sustrato muy altas. Lo mismo puede ser enzimática
62
cierto para otros factores necesarios para la actividad como los iones metálicos,
co enzimas y pH.
4.3. CONTROL ALOSTERICO
Durante los estudios iniciales sobre enzimas, se aclaró que la actividad de estas
y por tanto el control metabólico, puede ser afectado por ciertos metabolitos
reguladores (efectores, modificadores o moduladores). Estos metabolitos
pueden inhibir o activar la actividad enzimática; sus mecanismos y cinética.
Además de la cinética básica de reacciones con un solo sustrato analizadas, hay

enzimas que no siguen la cinética de Michaelis-Menten.
Cuando la velocidad de reacción V se grafica contra la concentración de sustrato

estas enzimas muestran una curva sigmoidal en lugar de una gráfica hiperbólica.
A menudo estas enzimas son complejos con múltiples componentes difíciles de
aislar; se trata de enzimas reguladores conocidas como enzimas alostéricas. De
estas se pueden distinguir tres clases:
 Homotropicas: Aquí el sustrato puede actuar como efector sobre la

rapidez de la reacción enzimática, por lo general, incrementándola.
 Heterotropicas: La inhibición o estimulación es causada por sustancias de
origen natural que no sea el sustrato.
 Mixtas: algunas enzimas muestran ambas características.
63
Fig. 01 Velocidad de reacción enzimática vs concentración de sustrato
La naturaleza sigmoidal de la curva que depende del sustrato indica que la unión
de las primera moléculas de sustrato mejora la unión de las primeras moléculas
posteriores. En las enzimas heterotropicas la inhibición o estimulación daría
como resultado cambios en la Km o en la Vmax de la enzima. Se han propuesto
de modelos para explicar la reacción alostéricas: las interacciones concertadas
y las secuenciales, las cuales se ajustan a las observaciones experimentales.
 Interacciones concertadas
El modelo concertado predice que la unión de una molécula de sustrato
convierte a la enzima (toda la subunidad) a una forma de alta afinidad, la
cual puede unir más rápidamente al sustrato. El efecto de los inhibidores
o de los activadores en una enzima heterotropica también se puede
explicar con este modelo.
64
Fig. 02 Modelo concertado para interacciones alostéricas
 Interacciones secuenciales
El modelo secuencial sugiere que hay dos estados conformacionales para
las subunidades de la enzima. La unión del sustrato provoca un cambio
en la conformación de la subunidad en cuestión. Este cambio no altera
significativamente la otra subunidad, pero aumenta o disminuye la
afinidad de las subunidades por el sustrato nuevamente, un inhibidor o un
activador puede encajar en el modelo.
Fig. 03 Modelo secuencial para interacciones alostéricas
65
4.4. CONTROL POR RETROALIMENTACION
El método por el cual las enzimas reguladoras con comportamiento alosterico

controlan varias vías en su forma más simple, el que se conoce como
retroinhibicion o inhibición por producto final. Se ha encontrado que estas
enzimas alostéricas se localizan en o cerca del comienzo de una vía enzimática
y que sin inhibidas o estimuladas por el producto final de esa vía. Muchos de
estos tipos de control han sido investigados en la síntesis de aminoácidos en E.
coli y se pueden identificar en muchos sistemas.
 CONTROL POR RETROALIMENTACION SIMPLE

Un buen ejemplo de este tipo se encuentra en las síntesis del aminoácido
isoleucina en la E. coli. Aquí si se permite que se forme la isoleucina
inhibirá la actividad de la treonina desaminasa, la primera enzima en la
cadena de la síntesis.
Fig. 03 Retroinhibicion simple, inhibición de la treonina desaminasa por

la isoleucina.
66
 CONTROL POR RETROALIMENTACION SECUENCIAL

En ese caso, los productos de una ruta ramificada solo afectan a la enzima
que actúa desde el punto de ramificación, y el punto de ramificación
intermedio afecta la vía común. Un ejemplo de esta forma de control es la
síntesis de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano
en Bacillus subtilis. La formación de triptófano, fenilalanina y tirosina
inhibe las enzimas en el punto de ramificación, lo cual provoca la
formación de ácido corismico. El exceso de ácido corismico, a su vez
inhibe las primeras enzimas de la secuencia que conduce a este acido.
Fig. 04 Retroinhibicion secuencial, control de biosíntesis de tirosina,

fenilalanina y triptófano.
 CONTROL POR RETROALIMENTACION CONCERTADO

En este caso las enzimas reguladoras en el punto de ramificación de una
vía enzimática tienen sitios múltiples para efectores alostericos diferentes,
67
de modo que la inhibición completa se puede lograr solo cuando ambos

efectores estén presentes. Un ejemplo es el efecto de la fenilalanina y la
tirosina sobre la enzima que forma al acido frénico a partir de ácido
corismico.
Fig. 05 Control concertado, efecto combinado de la fenilalanina y tirosina

sobre la formación de ácido prefenico.
 CONTROL ENZIMATICO MULTIPLE
La característica de este tipo de control es que la enzima en el comienzo
de una ruta ramificada se presenta en más de una forma, cada una de las
cuales es inhibida por uno de los productos finales. Un ejemplo es el
control de a lisina, metionina y la isoleucina en la E. coli con la enzima
controlante, asparto cinasa, que se presenta en tres formas, las cuales
son afectadas en forma separada por la lisina, historina e isoleucina.
68
Fig. 06 Control enzimático múltiple.

 CONTROL POR RETROALIMENTACION ACUMULATIVA
Este ocurre en algunas enzimas reguladoras donde los productos finales
de la vía son muy diferentes. La enzima tiene múltiples sitios alostericos
en los que los efectores originan individualmente solo la inhibición parcial.
Se requieren cantidades saturantes de todos los efectores para completar
la inhibición. Un ejemplo impresionante de esta clase de control es la
enzima glutamina sintetasa, la cual participa en las vías que conducen a
varios compuestos como la histidina, el triptófano y la glucosamina-6-p.
Fig. 07 Retrocontrol acumulativo de la glutamina sintetasa.
69
4.5. CONTROL INTEGRADO MEDIANTE LA CARGA ENERGETICA
No es irrazonable esperar que el uso y la producción de ATP, el intermediario de

alta energía, deban encontrarse balanceados dentro de la célula. En periodos
cortos, el contenido de la célula de compuestos adenilados, AMO, ADP y ATP,
se puede considerar constante. Por lo tanto, la cantidad de energía presente en
la célula puede considerarse como la proporción de ATP y ADP con respecto al
total de compuestos adenilados, el ATP es el de ADP. Esta suma se conoce
como la carga energética:
La relación entre la carga energética y los compuestos adenilados se muestran

en figura. Se ha investigado el efecto de la carga energética sobre algunas
enzimas y este proviene de la función enzimática o el uso o generación de ATP.
Dos ejemplos muy buenos de estas clases de enzimas y su control, son la
fosfofructocinasa y el piruvato deshidrogenasa.
La enzima fosfofructocinasa se sitúa en una etapa esencialmente irreversible del

glucolisis. La enzima es estimulada tanto por ADP como por AMP, e inhibida por
ATP y nitrato. Por lo tanto, si la carga energética dentro de la célula es baja, la
fosfofructocinasa se activa y el flujo de carbono a través del glucolisis aumenta
para producir más ATP. La formación de acetil CoA por el piruvato
deshidrogenasa y, por lo tanto, controla la rapidez con la que funciona el ciclo de
Krebs, así como la producción de CoA, NADH y ATP ya activada por AMP. Por
lo tanto, la enzima puede controlar el flujo de carbono a través del ciclo de Krebs
dependiendo de los niveles de NADH, ATP y acetil CoA.
70
Fig. 08 Ejemplo de control por carga energética.
4.6. CONTROL POR MODIFICACION DE LA ENZIMA
Las enzimas pueden activarse o desactivarse por modificaciones ya sea

reversibles o irreversibles, que a menudo son efectuadas por otras enzimas.
 MODIFICACION IRREVERSIBLE
Algunas enzimas, en particular las enzimas digestivas, se sintetizan en
una forma inactiva conocida como zimógeno. Esta forma se activa por la
acción de una segunda enzima que rompe la molécula en un punto
específico. Un ejemplo de esta forma de control es el quimiotripsinogeno,
la forma inactiva de la quimiotripsina, el quimiotripsinogeno se sintetiza en
el páncreas y consiste en una sola cadena polipeptídica, reticulada por
cinco enlaces disulfuro. Cuando el enlace peptídico que une a la arginina
15 y la isoleucina 16 se rompe por la acción de la tripsina, el
quimiotripsinogeno se convierte en la quimiotripsina totalmente activa.
71
Fig. 09 Modificacion irreversible del quimiotripsinogeno a quimiotripsina.
 MODIFICACION REVERSIBLE
La modificación de las enzimas de formas inactivas a formas activas
puede ser reversible por ejemplo una fosforilasa que se encuentra en el
musculo existe dos formas: una activa y otra inactiva. La forma inactiva
pasa a la forma activa por la fosforilación de un residuo especifico de
serina mediante una enzima fosforilasa cinasa especifica. Bajo diferentes
condiciones, el grupo fosfato es removido de la enzima activa por una
segunda enzima específica, fosforilasa fosfatasa, para producir la enzima
inactiva.
A menudo esta forma de fosforilación reversible está bajo un segundo
sistema de control puesto que la fosforilación y defosforilacion continua
serian un desperdicio de energía. Se puede ver un buen ejemplo en el
metabolismo del glucógeno, una forma de almacenamiento de glucosa
donde la síntesis y el rompimiento deben ser controlados y coordinados.
En los animales el metabolismo del glucógeno está bajo el control de
hormonas en una serie compleja de reacciones que incluyen la
modificación reversible de las enzimas.
La hormona epinefrina se une a la membrana celular estimulando una
enzima adenil ciclasa. La adenil ciclasa unida a la membrana produce
AMPc a partir de ATP. Las mayores concentraciones celulares de AMPc
activan al enzima glucógeno sintetasa con lo que se obtiene su forma
72
inactiva. Este tipo de control puede formar una cascada de reacciones

donde un cambio muy pequeño puede amplificarse para causar cambios
bastante drásticos.
Otra forma de modificación reversible de la actividad enzimática, se
encuentra en la enzima glutamina sintetasa de E. coli. La enzima puede
ser adenilada por una enzima adenil transferasa, la cual hace a la enzima
más susceptible al control por retroalimentación por parte de la glutamina.
Además, la glutamina inhibe a una enzima deadenilante y por tanto un
aumento de glutamina permitirá la formación de más enzimas susceptible,
reduciendo así la formación de glutamina.
Fig. 10 Activación e inactivación de la fosforilasa por fosforilación

reversible de un residuo de serina.
4.7. CONTROL POR ALTERACION DEL NUMERO DE MOLECULAS DE

ENZIMA
Hasta aquí se ha estudiado el control ejercido sobre las enzimas y se ha

considerado el efecto en las enzimas ya existentes. Hay un segundo tipo de
control, posiblemente controles aproximados, que determinan el número de
73
moléculas de enzima presentes dentro de una célula. Con respecto al dogma

centro de que el DNA forma el RNA que dirige la síntesis de las proteínas, se
puede ver que el control seria ejercido tanto en el estado transcripcional como
en el traduccional. Un tercer control posible es un incremento en la degradación
de la enzima en cuestión sin afectar su rapidez de síntesis reduciendo así su
concentración global.
4.8. SISTEMAS PROCARIOTICOS
Los procariotas tienen cromosomas individuales en forma superior arrollada.

Como se describió para los vectores de expresión génica correcta en los
procariotas depende de las secuencias de DNA que flanquean las secuencias
de instrucciones, la transcripción de los genes requiere RNA polimerasas, que
pueden tener asociación a factores polipeptídicos sigma y rho. El factor sigma
promueve la unión de la RNA polimerasa al DNA en sitios específicos ubicados
justo antes de las secuencias de instrucciones de la proteína, conocidos como
región del promotor. Algo importante en el sitio del promotor son diez nucleótidos
ubicados antes de su comienzo, conocidos como la caja de Pribnow y que
contienen la secuencia TATAAT. El segundo sitio esta aproximadamente de 23
a 25 nucleótidos cuesta arriba, con la secuencia TTGACA. En los genes cuya
secuencia de bases de la región del promotor se ha analizado, se ha encontrado
poca variación entre los promotores que puede tener algún efecto sobre la
resistencia del promotor y la longitud de la copia.
Una vez que se inicia la transcripción sobre la hebra con sentido del DNA, el
factor sigma se disocia. Una característica adicional de la secuencia de
nucleótidos ubicada cuesta arriba de la mayoría de los genes, es la presencia de
un sitio de unión para los ribosomas o secuencia de Shine-Delgarmo. Esto
sucede a pocos pares de bases cuesta arriba del codón de iniciación que
comúnmente es AUG. La terminación de la transcripción también se realiza en
sitios específicos del DNA, caracterizados por un par de secuencias repetidas
invertidas, las cuales, por emparejamiento interno, originan una estructura de
tallo y lazo. En algunos casos es necesario el polipéptido rho para la terminación
de la transcripción, pero desconoce su participación.
74
Fig. 11 Estructura de las regiones promotoras, en el ADN de los

organismos procariotas.
 OPERONES
En las bacterias los genes para funciones relacionadas en un proceso

metabólico con frecuencia se localizan adyacentes entre sí y se transcriben
como una molécula de RNA mensajero simple (RNA policistronico). Este
RNA mensajero contiene secuencias interpuestas cortas no codificadores.
Este acomodo de genes se conoce como un operon. Por lo tanto, el mRNA
simple puede producir varias proteínas relacionadas rápidamente en la
traducción.
Algunos genes se expresan constantemente y se describen como genes con
expresión constitutiva, mientras que otros pueden inducirse por una señal
intracelular. Los genes inductibles presentan expresión elevada bajo el
estímulo apropiado. La presión de genes puede ocurrir cuando son
desconectados por un estímulo adecuado. El mecanismo de la inducción y
represión se debe a secuencias reguladoras localizadas cuesta arriba de los
genes estructurales.
Además de la región del promotor, existe otra secuencia de bases que es
adyacente o traslapa la región del promotor conocida como región del
operador. Esta región es responsable del control de la unión de la RNA
75
polimerasa al promotor. Las proteínas conocidas como represores, se

pueden unir al operador y evitar la transcripción. Este tipo de control puede
funcionar como control positivo o negativo.
- En el control negativo el operon se transcribe en condiciones normales,

pero es detenido por el enlace de un co-represor ya presente para formar un
represor activo que tiene la transcripción.
- En el control positivo, por lo general el operon no se transcribe sino por la
unión de un coactivador con el apo-activador que favorece la combinación
para unir a un operon que inicia la transcripción.
Fig. 12 Controles positivos y negativos de la transcripción

del ADN en ARNm.
 OPERON LAC
El primer operon descubierto fue el operon lac, el cual se compone de tres
genes estructurales que intervienen en la captación y metabolismo de la
76
lactosa; la B galactosidasa, una permeasa y transcetilasa. A contra

corriente de los genes estructurales se encuentra un operador, un
promotor y un sitio que es reconocido por una proteína que actúa como
activador positivo, conocida como proteína activadora de catabólicos
(CAP). Esta proteína tiene un sitio de enlace para el AMPc AMP el cual
se induce cuando baja la concentración de glucosa. La unión de AMPc
activa a la proteína y le permite unirse al DNA en el sitio cuesta arriba del
sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa lo cual presumiblemente
facilita la unión de la RNA polimerasa. Además de la regulación inductible
positiva del operon lac, también existe un elemento inducible negativo que
reprime al operon en ausencia de lactosa. Una proteína represora de lac
se une al operador y evita la transcripción. La inducción es causada por
un isómero de la lactosa llamada alolactosa que se une a la proteína
represora dando como resultado la detención del enlace del represor lac
con el operador e induciendo así la transcripción.
Lo anterior ilustra los tipos de mecanismos que dan como resultado la
expresión genética en los procariotas. Se han estudiado muchos otros
operones y se han encontrado genética en los procariotas. Se han
estudiado muchos otros operones y se han encontrado mecanismos
similares para la regulación coordinada de genes de funciones
relacionadas que no están organizadas como operones.
77
Fig. 12 Operon lac.
4.9. SISTEMAS EUCARIOTICOS
Las células eucarióticas contienen un núcleo separado del resto de la célula por
una membrana, el cual contiene cromosomas lineales múltiples. Cada
cromosoma tiene un DNA individual de doble hélice, aunque generalmente los
cromosomas se encuentran en pares y por lo tanto contienen información
homologa. En los mamíferos un par de cromosomas determina el sexo con dos
cromosomas tipo X que determinan las características femeninas y un
cromosoma X y uno Y que determina las características masculinas.
El DNA nuclear se encuentra asociado con proteínas, las histonas. Estas

proteínas son responsables de mantener la estructura y el metabolismo del DNA,
incluyendo la expresión genética. En las células eucarióticas se encuentras
cuatro RNA polimerasas. La RNA polimerasa I es responsable de la producción
78
del RNA ribosomal, la polimerasa III de la producción de RNA de transferencia y

la polimerasa II participa en la producción del mRNA.
En el control de la producción de m RNA, se encuentra una secuencia similar a

la caja de PRIBNOW en los genes eucarióticos donde esta se denomina caga
de Goldberg Hogness. Esta caja contiene la secuencia consenso TATAA y, la
transcripción. Se supone que su función es corregir la posición de la RNA
polimerasa II. Cuesta arriba de la caja de Goldberg-Hogness, se ha identificado
una segunda secuencia en algunos genes llamada caja CAAT, que puede ser
importante para la unión de polimerasa II.
Estos tipos de secuencias que afectan la transcripción pueden operar sobre

grandes distancias. Las secuencias mejoradas identificadas en genes virales
pueden actuar sobre distancias de hasta 3kb. Estos elementos exhiben
homología secuencial, pero con frecuencia su efecto se restringe a tipos
específicos de tejido. No existe información clara sobre señales de terminación
de la transcripción en los eucariotas. En la expresión genética del eucariota, se
han incluido otras características como la capacidad de la hélice para cambiar a
la forma Z, así como la presencia de residuos metilados de citosina como
mecanismo para desconectar genes.
Luego de la transcripción en eucariotas, el RNA mensajero se modifica por

adición de un cap 5, a partir de un radical 7- metilgianilil, el cual ayuda al RNA
mensajero a unirse al ribosoma. También se adiciona una cola de 100-200
nucleótidos de longitud de poli-A en el extremo 3’ del RNAm y es señalada por
unos 13-20 nucleótidos ubicados cuesta debajo de una secuencia AAUAAA.
79
Fig. 13 Estructura de la región promotora en el ADN de los
Organismos eucariotas.
 INTRONES
La secuencia de instrucciones de genes eucarióticos también puede

contener secuencias sin instrucciones llamadas intrones, los cuales se
procesan o eliminan del RNAm en el núcleo. Las secuencias de
instrucciones que son interrumpidas por los intrones se llaman exones.
 REGULACION POR MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL
La secuencia de aminoácidos determina las estructuras secundarias y

terciara en las cuales se dobla la proteína. Puede ocurrir también otra
modificación que afecte la especificidad, las propiedades y la actividad
de las proteínas.
Las proteínas destinadas a la exportación tienen una secuencia

principal N-terminal de 15-30 aminoacidos, que tiene propiedades
hidrofóbicas. Esta secuencia tiene alta afinidad por las membranas y
permite la secreción posterior. En el proceso de secreción hay también
remoción de la secuencia líder por una proteasa. El proceso proteolítico
también es importante para producir otras proteínas precursoras, por
ejemplo, la producción de insulina a partir de la proinsulina. Muchas
proteínas también pueden tener residuos de carbohidratos unidos para
80
formar glucoproteínas. El proceso de glucosilacion se realiza en el

aparato de Golgi de las células después del rompimiento de la
secuencia principal. La glucosilacion puede ser necesaria para corregir
la estructura de las proteínas y para el reconocimiento adecuado de la
proteína por el sistema inmune.
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V. STEINER Y. Roger INGRAHAM. L. John; 2005, MICROBIOLOGIA

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83

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UNIVERSIDAD NACIONAL MICROBIOLOGIA

JORGE BASADRE GROHMANN INDUSTRIAL

El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial paras las

Además, y tomando como ejemplo los procesos de elaboración de alimentos

La elección del método de conservación utilizado debe permitir mantener las

En la industria alimentaria los cultivos microbianos se guardan en pequeñas

Un cultivo de aplicación industrial tiene que reunir unas determinadas

 Contener el máximo número de células viables.

Por esta razón el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No

Los cultivos de microorganismos se siembran en medio estériles y en

1. Reduciendo o controlando su actividad metabólica a través de la

Normalmente se concentran o se separan de los productos residuales de

Este sistema permite mantener los cultivos durante largos periodos de

 El medio de cultivo base.

1.1 Conservación en refrigeración

El objetivo general de la refrigeración es incrementar la vida útil de los cultivos,

Generalmente hace falta hacer resiembras en medio fresco a intervalos

1.2 Conservación por congelación

La congelación se puede emplear como método de conservación de cultivos

El principal problema del mantenimiento de microorganismos a termperatura por

La supervivencia de los microorganismos a los procesos de congelación y

1.2.1 Proceso de congelación

Al descender la temperatura las moléculas de agua tienden a agregarse en

Antes de que se produzca la cristalización hay que colocar al producto en un

La cristalización se inicia cuando las condiciones son apropiadas para que se

1.2.1.3 Crecimiento de los cristales.

Durante el subenfriamiento las moléculas de agua se encuentran en un estado

En el caso de estructuras celulares, normalmente primero se produce la

citoplasma hacia el espacio extracelular donde se congela. Dependiendo de la

Los cristales de hielo intracelulares provocan roturas mecánicas tanto en su

Enfriamiento rápido: queda más agua retenida dentro de la célula

Para mantener la viabilidad de los cultivos el mejor método seria la combinación

1.2.2 Agentes crioprotectores

Estos agentes facilitan el flujo de agua a través de la membrana celular y

Son compuestos químicos no tóxicos, con facilidad para atravesar la membrana

para retrasar la congelación. Entre otros efectos protectores, sirven para

1.3 Conservación en nitrógeno liquido (-196 ºC)

La actividad metabólica de los microorganismos puede ser reducida

La técnica consiste en obtener el conocimiento del cultivo hasta lograr la máxima

Stanbury et al. (1995) propuso la congelación con nitrógeno liquido como la

1.4 Conservación por Deshidratación

Generalmente, se considera como deshidratación un procedimiento que permite

Llamada anteriormente crio-desecacion, la liofilización, cuyo nombre

El proceso de liofilización consiste esencialmente en dos etapas: 1) el

Según Casp y Abril (1999) la liofilización presenta una serie de ventajas:

 La temperatura de trabajo es muy baja y por lo tanto los productos

 La humedad residual es baja.

Pero también presenta algunos inconvenientes:

 El coste de las instalaciones y los equipos es muy elevado (alrededor

Los productos liofilizados pueden volver a su estructura original por adicion

Es un proceso en tres etapas:

Fase de solidificación: la mayor parte del agua que contiene el producto se

Es imprescindible la congelación completa de la muestra, que se puede

La forma y características del producto al final del proceso serán

Fase de deshidratación: se pueden distinguir dos subetapas:

Desecación primaria o sublimación: Consiste en la sublimación de los

Es necesario un vacio elevado (baja presión absoluta) en el liofilizador

La sublimación del hielo comienza cuando se produce el vacio y disminuye

Desecacion secundaria o desorcion: el agua no congelada se traslada

Para eliminar esta agua, se realiza una evaporación bajo vacio,

Si la muestra queda suficientemente seca se puede mantener a

Fase de rehidratación: consiste en la reconstitución del estado original

penetración del agua (Barbosa-Canovas y Vega-Mercado, 2000; Casp y