UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

LABORATORIO Nº 6:

“NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES

FECALES POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
(NMP), TÉCNICA DE FERMENTACIÓN DE TUBOS MÚLTIPLES”

CURSO:

MICROBIOLOGÍA SANITARIA I

PROFESOR:

ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS

ALUMNO:

LUIS AARON CABELLO CANDELA

CODIGO:

20132660B

2016-I
PARTE I: Técnica de fermentación en tubos múltiples: Fase presuntiva
(Determinación del NMP de coliformes totales y recuento de bacterias
heterotróficas).

1.1 Objetivo:
Evidenciar y observar la existencia de coliformes y determinar el N.M.P en las muestras que se
encontraron en los diferentes ambientes de UNI.
1.2 Fundamento Teórico
Determinación del N.M.P.
El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también
conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos
en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es
una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una
evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.
El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos
específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de
muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de
diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento
de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos
tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más
células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que
no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.
La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se
usan; cinco tubos por dilución se consideran como una relación adecuada entre precisión y
economía.
Una condición del método es la necesidad de poder reconocer un atributo específico de la
población en el medio de crecimiento que se emplee. La estimación de la densidad poblacional
se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo
del cálculo probabilístico.

ESTIMACION DEL NUMERO MÁS PROBABLE

Este método se basa en la presunción de que las bacterias se hallan uniformemente distribuidas
en un medio líquido, o sea que las muestras del mismo tamaño de un mismo producto tendrían
el mismo número de microorganismos. Naturalmente las muestras contienen algunos gérmenes
más o menos. Entonces la cifra media es el número más probable.
Las bacterias rara vez están separadas de sus vecinas. Ellas se agrupan en racimos, en especial
cuando se reproducen activamente. Además la agitación puede deshacer o inducir a la
formación de racimos. Por lo tanto carecen de valor las pruebas que se obtienen de una prueba
aislada.
Si el número de gérmenes es grande, la diferencia entre las muestras será pequeña, pero si son
pequeñas las diferencias relativamente serán mayores.
Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes en caldo Mac
Conkey, pero puede ser empleada para casi toda clase de gérmenes en muestras líquidas.
Es posible calcular el número de gérmenes por cada 100 ml. con cualquier combinación de
resultados obtenidos de tales muestras. Existen tablas para muestras de 10ml., 1ml. y 0,1 ml.
utilizando cinco o tres tubos para cada tamaño de la muestra.

Tabla 9221: III Índice de NMP y Límites de aceptación del 95 por 100 para distintas
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones
de 10 ml.
Numero de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados)
dan reacción positiva Indice
de un total de cinco NMP/100 ml SUPERIOR INFERIOR
de 10 ml cada uno
0 < 2.2 0 6.0
1 2.2 0.1 12.6
2 5.1 0.5 19.2
3 9.2 1.6 29.4
4 16.0 3.3 52.9
5 >16.0 8.0 Infinito

Tabla 9221: IV Índice de NMP y límites de aceptación del 95 por 100 para distintas
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones
de 10 ml.
Numero de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados)
dan reacción positiva Índice
de un total de cinco NMP/100 ml SUPERIOR INFERIOR
de 10 ml cada uno
0 < 1.1 0 3.0
1 1.1 0.03 5.9
2 2.2 0.26 8.1
3 3.6 0.69 10.6
4 5.1 1.3 13.4
5 6.9 2.1 16.8
6 9.2 3.1 21.1
7 12.0 4.3 27.1
8 16.1 5.9 36.8
9 23.0 8.1 59.5
10 <23.0 13.5 infinito
 Calculándose de acuerdo con la siguiente fórmula:

10
Valor del NMP (de la tabla)× 𝑚𝑎𝑦𝑜𝑟 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑢𝑑𝑖𝑎𝑑𝑜=NMP/100ml

Cuando se utilicen más de tres diluciones en series de diluciones decimales, solo se tomaran los
resultados de tres de ellas para calcular el NMP .Para seleccionar las tres diluciones a utilizar en
la determinación del índice del NMP, enlijándose la dilución más alta con resultado positivo
entre las cinco estudiadas (no hay ninguna dilución menor que hay dado un resultado negativo)
y las dos siguientes diluciones más altas. Para calcular el índice del NMP, utilícense los resultados
de estos tres volúmenes .En el ejemplo siguiente, los resultados de la dilución significativa se
ofrecen en negritas. El numerador representa los tubos positivos y el denominador, el total de
tubos estudiados, la combinación de positivos indica únicamente el número total de tubos
positivos por dilución:
Tabla 9221: V Índice de NMP y límites de aceptación de 95 por 100 para distintas
combinaciones de resultados positivos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml,
1.0 ml, 0.1 ml, etc.).

Índice Límites de Índice Límites de

Combinación Combinación
NMP/100 confianza 95% NMP/100 confianza 95%
de positivos de positivos
ml Superior Inferior ml Superior Inferior
0-0-0 <2 - - 4-2-0 22 9.0 56
0-0-1 2 1.0 10 4-2-1 26 12 65
0-1-0 2 1.0 10 4-3-0 27 12 67
0-2-0 4 1.0 13 4-3-1 33 15 77
4-4-0 34 16 80
1-0-0 2 1.0 11 5-0-0 23 9.0 86
1-0-1 4 1.0 15 5-0-1 30 10 110
1-1-0 4 1.0 15 5-0-2 40 20 140
1-1-1 6 2.0 18 5-1-0 30 10 120
1-2-0 6 2.0 18 5-1-1 50 20 150
5-1-2 60 30 180

2-0-0 4 1.0 17 5-2-0 50 20 170

2-0-1 7 2.0 20 5-2-1 70 30 210
2-1-0 7 2.0 21 5-2-2 90 40 250
2-1-1 9 3.0 24 5-3-0 80 30 250
2-2-0 9 3.0 25 5-3-1 110 40 300
2-3-0 12 5.0 29 5-3-2 140 60 360

3-0-0 8 3.0 24 5-3-3 170 80 410

3-0-1 11 4.0 29 5-4-0 130 50 390
3-1-0 11 4.0 29 5-4-1 170 70 480
3-1-1 14 6.0 35 5-4-2 220 100 580
3-2-0 14 6.0 35 5-4-3 280 120 690
3-2-1 17 7.0 40 5-4-4 350 160 820
 5-5-0 240 100 940
4-0-0 13 5.0 38
5-5-1 300 100 1300
4-0-1 17 7.0 45
5-5-2 500 200 2000
4-1-0 17 7.0 46
5-5-3 900 300 2900
4-1-1 21 9.0 55
5-5-4 1600 600 5300
4-1-2 26 12 63
5-5-5 >=1600 - -

Combinación Índice NMP

Ejemplo 1 ml 0.1 ml 0.01 ml 0.001ml
de positivos /100 ML
A 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5000
B 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2200
C 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20

En “c” selecciónense las primeras tres diluciones de manera que se incluya el resultado positivo
en la dilución, media.
Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea “d” en el que una
dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el resultado se
incorporara a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en “e”

Índice
Combinación
Ejemplo 1 ml 0.1 ml 0.01 ml 0.001ml NMP
de positivos
/100 ML
D 5/5 3/5 1/5 0/5 5-3-2 1400
E 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1400

Si se desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá
a la media geométrica o la mediana.

En la tabla 9221.V se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen
combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 por 100, hay que pensar que la
técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se
basa el cálculo del NMP. El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras
combinaciones de tubos o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla formula de Thomas:

𝑁𝑀𝑃/100𝑚𝑙
𝑛° 𝑑𝑒 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
=
√(𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 × 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠)

Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son
aplicables para determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga
de los medios de estudio adecuados.
1.3 PROCEDIMIENTO
 Prueba presuntiva: Determinación del N.M.P. de Coliformes:
 Tomar muestras de agua de distintos sitios de la universidad y llevarlos al laboratorio.
 Alistar 15 tubos de ensayo y un frasco con 99ml de agua peptonada estéril para la
dilución de 10-2.
 Extraer con una pipeta 1.1ml de la muestra de agua y colocar 0.1ml en un tubo con Caldo
Lauril Triptosa y el 1ml restante en otro tubo con el mismo medio. Repetir este
procedimiento para 5 tubos (5 de 1ml y otros 5 de 0.1ml de la muestra). Ob teniendo de
esta manera muestras de caldo lauril triptosa con concentraciones de 1 y 10-1.
 Extraer 1ml de muestra de agua diluida en los 99ml de agua pepetonada y colocarlo en
un tubo con caldo lauril triptosa. Este paso se realiza para 5 tubos.
 Los tubos inoculados se incuban a 35°C ± 0.5°C tras 24 ± 2 horas, agítese cada tubo
suavemente y se observa si se produce gas o un crecimiento ácido (color amarillo) y en
caso contrario reincúbese y vuélvase a examinar al final de 48 ± 7 horas. Regístrese la
presencia o ausencia de gas, sino se ha utilizado el vial, un crecimiento con acidez
significa una presunta reacción positiva.

 Recuento de Bacterias Heterotróficas:

 Extraer con una pipeta estéril de 1.1ml agua del frasco de muestreo y agregar 0.1ml en
una placa de Petri y el 1ml restante en otra placa.
 Agregar el agar nutritivo en las placas anteriores. Esperar 5min para su solidificación.
 Las placas se incuban 35°C durante 48 horas.
1.4 RESULTADOS
Prueba Presuntiva:
Determinación de número más probable (NMP) de coliformes totales
Recuento de bacterias heterotróficas
Dilución
Muestra UFC/ 100 ml
1ml 10-1 10-2
Est. de Arquitectura 142 57 6 142
Est. de Electrónica 0 0 4

Dilución
Muestra NMP/100ml
1ml 10-1 10-2

Est. de Arquitectura 4/5 2/5 0/5 22*10=200

Est. de Electrónica 4/5 0/5 0/5 13*10=130

Nota : El tiempo de incubación fue de 72 horas.

Combinaciones de INDICE N.M.P/100ml Limite de confianza 95%
positivos Sup. inf
4-2-0 22 9.0 56
4-0-0 13 5.0 38
0-0-0 <2 - -

1.5 OBSERVACIONES
 El NMP de coliformes totales por 100ml para el estanque de Arquitectura y Electrónica son
220 y 130 respectivamente.

1.6 DISCUSIONES
En los resultados de Recuento de bacterias heterotróficas observados para el estanque de
Electrónica, en las disoluciones realizadas de 1 ml y 10-1 ml el resultado dado es de cero colonias
para ambos diluciones esto nos indica que no se ha realizado correctamente el experimento, ya
que no puede darse que al inocular bacterias en un medio de cultivo no exista presencia de
colonias.

1.7 CONCLUSIONES
Dado que se sobrepasó el tiempo óptimo de incubación en el recuento de bacterias
heterotróficas, este generó que el número de colonias no esté en el rango admisible, por lo tanto
se pude concluir que los resultados obtenidos en el estanque de Arquitectura son incorrectos.

1.8 RECOMENDACIONES
 Por un mal control en el desarrollo del laboratorio, se deberá realizar nuevamente análisis
del estanque de Arquitectura para comprobar si son correctos.
 Para el estanque de Electrónica es necesario repetir el experimento, porque no puede
presentarse tales resultados en el recuento de bacterias heterotróficas.

1.9 BIBLIOGRAFIA:
 Microbiología Roger Y. Stanier, Julio R. Villanueva
 Hugo Humberto Montoya -Microbiología básica para el área de la salud y afines.
Betty A. Forbes-Diagnostico Microbiológico
Parte II: Técnica de Fermentación en Tubos múltiples: FASE
CONFIRMATIVA y prueba para coliformes Fecales. N.M.P.

2.1 OBJETIVO:
Confirmar la presencia de coliformes en las muestras de agua de algún establecimiento
de la UNI para poder determinar la calidad de agua.

2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO

Fase presuntiva
Utilícese un medio liquido de lauril triptosa en la porción presuntiva de la prueba de tubo
múltiple. Como alternativa, puede emplearse un medio líquido de lactosa, siempre que se haya
demostrado que no aumenta la frecuencia de resultados positivos falsos ni enmascara los
coliformes que existen en las muestras de agua potable. Si se ha refrigerado el medio después
de su esterilización, se incubara de un día a otro a 35°C antes de utilizarlo. Rechácense los tubos
que muestren crecimiento, burbujas o ambas cosas. Hágase el medio de lauril triptosa con
fuerza suficiente como para que al añadir 100ml o 10ml de muestra, la concentración de los
ingredientes no sea menor que la del medio estándar
Fase confirmativa
Es un procedimiento mediante el cual una reacción negativa excluye la presencia de coliformes
fecales, mientras que una reacción positiva indica su presencia inequívoca. Deben someterse a
esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva.
Prueba complementaria
Para establecer definitivamente la existencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el
control de calidad, practíquese la prueba completa en todos los tubos positivos confirmados.
Puede utilizarse la doble confirmación en medio líquida verde brillante de lactosa bilis para
coliformes totales y el medio liquido EC para coliformes fecales. Considérese como respuesta
positiva de la prueba completa los resultados positivos en medio liquido EC a temperatura
elevada (44.5°C). Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y
negativos en medio EC indican la presencia de coliformes no fecales y, por tanto, deben ser
sometidos a la prueba completa para obtener un valor del NMP

2.3 PROCEDIMIENTO
Prueba Confirmativa:
 Llevar a la fase confirmativa todos los tubos en los que haya aparecido cualquier
cantidad de gas.
 Agitar suavemente o girar, para que se produzca una suspensión de los
microorganismos.
 Con un esterilizador pasar una gota de cultivo al tubo de fermentación que contiene el
medio Verde Brillante Billis.
 Repetir esta operación en todos los tubos posiblemente positivos.
 Incubar el medio Verde Brillante de la lactosa billis a 35 ± 0.5°C durante 48 ± 3 horas.
Procedimiento del N.M.P. de Coliformes Fecales:
 Aplicar este procedimiento a los tubos presuntivos
que hayan mostrado alguna cantidad de gas.
 Agitar suavemente o girar los tubos de fermentación
que muestres gas.
 Con un asa estéril pasar el cultivo de cada tubo de
fermentación al medio EC.
 Incubar los tubos con medio EC inoculados en un
baño de agua maría a 44.5 ± 0.2°C durante 24 ±2
horas.

Procedimiento en el medio LESENDO:

 tomar muestra de un tubo presuntivo que haya hayan mostrado alguna cantidad de gas
(ya tomado para el medio EC).
 Inocular en dos placas Petri estériles por el método del estriado. Incubar a 24 ± 2 horas
a 35 ± 0.5°C.

2.4 RESULTADOS
Para Coliformes Fecales:
a) Prueba preventiva (media verde brillante bilis)

MUESTRA DILUCION
1 ml 10-1 ml
3/4 0/2
Estanque de FAUA
3/4 *
Estanque de FIEE
 b) PRUEBA CONFIRMATIVA

Dilución
MUESTRA 1ml 0.1
Estanque de FAUA 1/4 0/2
Estanque de FIEE 0/4 -*

2.5 DISCUSIONES
 Ya que en nuestra universidad el agua es subterránea, y esta se extrae de una misma
poza, entonces debe contener la misma carga microbiana, pero los resultados obtenidos
del laboratorio nos indican que las muestras obtenidas se pudieron contaminar en
algunos puntos de su distribución o en el laboratorio.
 En los resultados de la muestra proveniente el estanque de FIEE, no se analizó los tubos
con dilución 10-1 al resultar negativo en la prueba presuntiva.

2.6 CONCLUSIONES
 Para las muestras de FAUA y de FIEE, se puede confirmar presencia de coliformes.
 Los resultados son dudosos al calcular en NMP por alguna falla en el experimento, y se
tendrá que repetir.

2.7 RECOMENDACIONES
 El procedimiento establecido se debe seguir correctamente para poder realizar un buen
estudio.
 Para analizar la presencia de coliformes en el agua, no debe faltar ningún tubo en las
diferentes soluciones.
 En el medio Les-Endo se debe de buscar la colonia que se formó aisladamente.
Parte III: Técnica de Fermentación en Tubos múltiples: PRUEBA
COMPLEMENTARIA.

3.1 OBJETIVOS
 Determinar la presencia de bacterias gram no esporuladas procedentes de los cultivos con
agar (Demostración del grupo coliforme)
 Ver si el tipo de coliforme es del tipo fecal o no fecal.
 Ver qué tipo de bacteria se presenta en las muestras mediante una prueba IMVIC

3.2 FUNDAMENTO TEÓRICO

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRÓFICAS
La medición de bacterias heterótrofas en el agua potable puede proporcionar información útil a
los operadores de plantas de agua, ingenieros sanitarios, supervisores de la calidad del agua y
analistas de laboratorios de calidad del agua. Durante el tratamiento la densidad bacteriana
varía y en la red de distribución se puede monitorear el deterioro de la calidad a través de los
métodos de recuento heterotrófico en placas (RHP). La aplicación constante del método de RHP
seleccionado proporcionará datos básicos para evaluar cambios en la calidad bacteriana del
agua potable.
RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA
Es un método muy utilizado cuando se necesita determinar el tamaño de la población bacteriana
de una muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno
desarrollará una colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homogénea
con respecto a su composición microbiológica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este último caso un recuento menor del real.
También es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en
las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este caso el
recuento también será inferior al real. Lo que sí se sabe es que cada colonia observada se formó
a partir de por lo menos un microorganismo. Esta es una condición necesaria y suficiente.
Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (UFC) a los efectos de los
cálculos.

3.3 PROCEDIMIENTO
Prueba Complementaria:
Las colonias que se desarrollan en el agar LES ENDO puede ser típicas, atípicas (rosas, rojas
blancas o incoloras sin brillo a las 24 horas de incubación o negativas (todas las demás).
 Tomar de cada placa una o más colonias típicas bien definidas, y si no existen dos o más
entre los que se consideran como probablemente formadas por m.o. del grupo
coliforme y se pasan a un tubo de fermentación en medio caldo lauril triptosa ya uno
con agar inclinado.
 Sembrar las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas,
separadas por lo menos 0.5 cm.
  Inocular los tubos con el medio caldo lauril triptosa con viales de fermentación
invertidos a 35°C ± 0.5°C durante 24 ± 2 horas si no se produce gas en este periodo, se
prolonga la incubación hasta 48 ± 3 horas.
 Si hay formación de gas en el tubo con caldo hacer la coloración Gram del tubo con
cultivo agar inclinado.

3.4 RESULTADOS
Prueba Complementaria

Procedencia de la Formación de gas en el caldo lauril Coloración Gram

muestra tiptosa
Gram(+)
Estanque FAUA
(+) Diplococos
Gram (-)
Estanque FIEE (+) Bacilos cortos no
esporulados

3.5 OBSERVACION
 La presencia de bacilos gram - y ausencia de esporas constituye una prueba completa
positiva. La presencia de bacilos gram- acompañados de esporas a la ausencia de bacilos
gram – viene a ser una prueba completa negativa
 Si hay formación de gas en el tubo con caldo hacer la coloración Gram del tubo con
cultivo agar inclinado.
 Si hay producción de gas en los tubos se tiene una prueba completa negativa.
 Si no hay gas, no ha y coliformes.

3.6 DISCUSIONES
Ya que el agua en toda la UNI es extraída de la misma poza, se debe asumir que contiene la
misma carga microbiana, pero los análisis se muestran lo contrario en algunas facultades, esto
se puede deber a una contaminación en las redes de distribución del agua.
3.7 CONCLUSIONES
 Para el estanque de la FIEE se puede observar presencia de coliformes.
 En la muestra del estanque de arquitectura se debe repetir el procedimiento a partir de la
prueba confirmativa.

3.8 RECOMENDACIONES
 Se debe seguir correctamente el procedimiento para poder realizar un buen estudio.
 El ambiente donde se realiza el análisis debe estar descontaminado y sin presencia de
ventilación
 La coloración Gram es la que debe realizarse con mucho cuidado, ya que es ahì donde
se presenta la mayor dificultad.
 Se recomienda coger una gran cantidad de colonias para poder efectuar un mejor
análisis.

3.9 BIBLIOGRAFÍA
 Métodos Normalizados en el análisis de Agua y desagües.
 Elementos de Microbiología –MICHAEL PELCLZAR
Parte IV: Diferenciación del grupo coliforme: Fecal y no Fecal. PRUEBA
IMVIC. PRUEBA BIOQUÍMICA.

4.1 FUNDAMENTO TEÓRICO

Grupo Coliforme
La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen
ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de
contaminación del agua y los alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia
coli, descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor von Escherich en 1860. Von Escherich la
bautizó como bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego κολον, kolon, "intestino"). Con
posterioridad, la microbiología sistemática nombraría el género Escherichia en honor a su
descubridor.
Este grupo de bacterias comprende todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos, gram
negativos, no esporulados que producen ácido y gas al fermentar la lactosa.
Entre los coliformes más importantes se encuentra la E.coli, enterobacter, klebsiella y
citrobacter. Los coliformes se clasifican en Totales y Fecales. Los coliformes totales como
características comunes destacan que:
 Poseen morfología bacilar
 Pueden ser aerobias o anaerobias facultativas.
 No forman endosporas
 Gram Negativas
 Fermentan la lactosa produciendo ácido y gas en 24-38 hrs. A 36oC
Los coliformes Fecales comparten las mismas características que los totales pero además:
 Crecen con lactosa y la fermentan a 44.5oC ± 2oC produciendo ácido y gas en lasprimeras
48 hrs. De incubación.
 Son coliformes termotolerantes. Incluye cepas de los géneros Klebsiella yEscherichia
siendo esta última el más útil indicador de calidad de alimentos.
Caracteres bioquímicos
El grupo coliforme agrupa a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las
siguientes propiedades bioquímicas:
 Ser aeróbias o anaeróbias facultativas;
 Ser Gram negativas;
 No ser esporógenas;
 Fermentar la lactosa a 35 °C en 48 horas.
Hábitat del grupo coliforme
Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de
los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas
en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y
animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en
el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.
Los coliformes como indicadores
Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control
de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los
coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es
principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura.
Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más
coliformes se aíslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.
En general, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial
del agua o en los sedimentos del fondo. Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido
divido en dos grupos: coliformes totales y coliformes fecales.
Coliformes totales y coliformes fecales
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas
para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen,
por lo tanto, los coliformes totales (que comprende la totalidad del grupo) y los coliformes
fecales (aquellos de origen intestinal).
Desde el punto de vista de la salud pública esta diferenciación es importante puesto que permite
asegurar con alto grado de certeza que la contaminación que presenta el agua es de origen fecal.
Coliformes fecales
Se define como coliformes fecales a aquellos que fermentan la lactosa a 44,5 – 45,5 °C, análisis
que permite descartar a Enterobacter, puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica
este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente E. coli (90%) y algunas bacterias de
los géneros Klebsiella y Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de
probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli.
El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de contaminación de origen
fecal, alrededor del 99%. No es absoluta porque se han aislado cepas de E. coli que no tienen
origen fecal, pero es un grado de certeza es más que razonable para certificar contaminación
con ese origen.
Sin embargo, el aislamiento de este microorganismo no permite distinguir si la contaminación
proviene de excretas humana o animal, lo cual puede ser importante, puesto que la
contaminación que se desea habitualmente controlar es la de origen humano.
Contaminación fecal humana o animal
La Escherichia coli de origen animal y la de origen humano son idénticas. Sin embargo, algunos
investigadores han encontrado que las bacterias del género Rodococcus se asocian solamente a
la contaminación fecal por animales.
Coliformes e Higiene de alimentos
En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminación fecal
sino solamente indicadores de calidad.
Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo,
helados, pastas frescas, fórmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno.
Los coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos.
Por último, la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales para el
desayuno, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.
Coliformes y aguas servidas
La prueba de coliformes totales y fecales también se utiliza para determinar la calidad
bacteriológica de los efluentes de los sistemas de tratamiento de aguas servidas.

REACCION

ORGANISMO INDOL ROJO DE VOGES- CITRATO

METILO PROSKAUER

Origen Fecal + + - -

Origen no - - + +
Fecal

PRUEBA IMVIC
El IMVIC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone de
cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se
expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de cada prueba,
siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así por ejemplo, el IMVIC
de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter
es --++.
Medios reactivos y procedimientos.
Los medios y reactivos comerciales ayudan a reducir el trabajo y el costo; sin embargo, hay que
incluir controles positivos y negativos de cultivos conocidos para asegurar su exactitud y
fiabilidad. Pueden consultarse detalles sobre estos métodos.
Indol (I)
Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico
en triptófano; después de 24-48 horas de crecimiento se adiciona al
tubo sobre el caldo xilol, para conseguir separar el indol producido,
y tras agitar se incorpora el reactivo de Kovacs (p-dimetil animo
benzaldehido) un resultado positivo mostrará la formación de un
anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondrá de
manifiesto la presencia de Indol debido a la utilización del triptófano
por el microorganismo (la molécula de tritófano se rompe y uno de
esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un
anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs.
Rojo de Metilo (M)
El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando
desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos
orgánicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo en
estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es
la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc,
adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje
del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa
por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánico
producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo).
Voges-Proskauer (VI)
Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por descarboxilación de dos
moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis). La acetoína es un producto
intermedio de la fermentación butilén-glicólica, que conduce a la formación de 2, 3 butanodiol.
Tanto la acetoína como el 2,3 butanodiol son productos neutros de la fermentación de la glucosa
que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6 o más, y un aumento en la producción
de dióxido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetoína en un medio
fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo
reacciona con compuestos que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en
el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosado-violáceo. Se agrega α-
naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las
Enterobacteriaceae, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.
Citrato (C)
Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente
de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del
citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos
tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un
resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano.
Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento. Actualmente el medio más utilizado
es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un
indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer con citrato como
única fuente de carbono, también será capaz de utilizar las sales de amonio como única fuente
de nitrógeno; con la liberación del amoniaco en utilización de las sales de amonio el pH
aumentara y el indicador dará un vire a azul, dando un resultado positivo. El medio sin inocular
es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá
siendo verde.

4.2 PROCEDIMIENTO

PRUEBA DE ROJO DE
PRUEBA INDOL
METILO

Incubar a 35° ± 0.5°C durante

Incubar a 35° durante 5 días
24 ± 2 horas

PRUEBA VOGUES PROSKAUER PRUEBA DEL CITRATO

Incubar a 35° ± 0.5°C durante 48 Incubar a 35° ± 0.5°C durante 72 –

horas 96 horas
4.3 RESULTADOS
 Prueba INDOL:
Como el indol es un producto del metabolismo del triptófano, entonces:
Existe reacción positiva cuando aparece un color rojo oscuro en el alcohol amílico, si se
mantiene el color original del reactivo (amarillo), la prueba es negativa, un color naranja indica
probable presencia de escatal, que es un producto de la degradación del INDOL.
 Prueba del Rojo de Metilo:
Un resultado positivo es la aparición de un color rojo, mientras tanto un color amarillo
constituye un resultado negativo.
 Prueba VOGUES PROSKAUER:
Un resultado positivo viene dado por la separación a los 5 minutos de un color rosa a carmesí.
Nos e debe leer después de los 5 minutos. Se rechazarán los tubos en los que aparezca un
color de tono cobrizo.
 Prueba del Citrato de Sodio:
Registrándose como resultado negativo la ausencia de crecimiento.

4.4 DISCUSIONES
 No existen discusiones debido a que no se presentaron resultados para esta parte,
solamente se presenta el modo de reacción para cada tipo de prueba.

4.5 RECOMENDACIONES
 El procedimiento establecido debe seguir correctamente para poder realizar un buen
estudio.
 No confundirse a la hora de verter los reactivos al tubo de ensayo.
 No debe pasar el tiempo de espera límite.
 Al momento de usar el inoculador para extraer las cantidades necesarias de muestra,
se debe tener cuidado para dejar muestra para los siguientes análisis.

4.6 BIBLIOGRAFÍA
 http://es.wikipedia.org/wiki/IMVIC
 http://www.upemor.edu.mx/labo/tarchivos/archivos/HEAL/practica_7.pdf
 libro: Examen Microbiològicos del agua, pàg :120-124.
Parte V: Técnica del Filtro de membrana para coliformes totales.

5.1 FUNDAMENTO TEÓRICO

El número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtración de
volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Por lo general, están
compuestos de ésteres de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que
retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Después se
incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica, la técnica de
filtración de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el método de
tubos múltiples.
Una de las ventajas del método de filtración a través de membrana es la prontitud con que
pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rápidamente
acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta técnica puede
aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, también se utiliza en el análisis de leche
y otros alimentos líquidos.
Filtros de membrana
Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran una
estructura microporosa precisa. Durante la filtración las partículas
mayores que los poros de la membrana son retenidas de forma fiable
en la superficie de la misma. Las partículas más pequeñas pueden pasar
el filtro.
Aparatos y técnicas de filtración
 El aparato de filtración consiste de un
disco incrustado (portafiltros) sostenido
por soporte de goma o caucho y que se
ajusta a una base donde puede fijarse un
embudo graduado o una rampa múltiple
de filtración.
 El disco incrustado o perforado
(portafiltros) sostiene el filtro de
membrana.
 El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtración bien sea único o colector
múltiple (rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de
vacío.
Volumen de agua analizada
El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en
las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en
general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas
decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir
de orientación:

Tipos de agua Coliformes totales

Potable de consumo público 100 ml
Envasadas 250 ml
Manantiales 15; 60; 100 ml
Lagos, depósitos 4; 15; 60; 100 ml
Acometidas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ríos 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar 0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiéndolas al

embudo de filtración.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución tamponada
estéril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución
tamponada estéril.

5.2 PROCEDIMIENTO
 Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se
ha esterilizado.
 Separar el embudo de la base del filtro.
 Colocar la membrana filtrante de 0,45 µm de
tamaño de poro sobre el portafiltros de las base
del mismo. El manejo de las membranas se debe
realizar con pinzas de punta plana o guantes de
goma para no lesionarlas.
 Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que
esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situado entre el embudo
y la base-soporte del filtro.
 Filtrar 100 ml de la muestra de agua a través del filtro. Poner en marcha el sistema de
vacío.
  Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacío y separar el embudo de la
base del filtro.
 Retirar con pinzas estériles o flameadas la membrana filtrante.

 Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de

forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y el medio y que
quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio.

 Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 35ºC ± 0.5°C
durante 24 horas.

5.3 RESULTADOS

Condiciones de toma de la muestra

Muestra 1 Muestra 2
Día 05/12/2016 Día 05/12/2016
Hora: 5:05 p.m. Hora: 4:35 p.m.
Temperatura: 22.5°C Temperatura: 21°C
Lugar: Acequia del CEI Ingenieritos Lugar: Grifo de Civiles
 Muestra
Acequia del CEI ingenieritos Las colonias se caracterizaban por una coloración
rosada.

Grifo de civiles No hay crecimiento de colonias.

5.4 DISCUSIONES
 En la acequia de ingenierieritos se observo crecimiento de colonias mientrara que para
el grifo de civiles no hubo crecimiento alguno.

5.5 CONCLUSIONES
 Para la muestra del grifo de civiles sale libre de grupo coliforme, decimos que tiene un
buen control del agua de sus grifos.
 El medio les endoes muy selectivo, solo se usa para determinar grupos coliformes.

5.6 RECOMENDACIONES
 El procedimiento establecido se debe seguir correctamente para poder realizar un buen
estudio.
 Limpiar adecuademente los envases a usar.
 Colocar la memabrana con una pinza.
 La muestra de agua no debe contener residuos sòlidos.

5.7 BIBLIOGRAFÍA
 http: //www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan2/032981-I-II/032981-I-07b.pdf
 libro: Examen Microbiològico del agua, pàg :95-105.
 http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html#b
(Filtro de membrana)
 ANEXO
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los límites máximos permisibles de coliformes fecales para las
descargas de aguas residuales vertidas a aguas y bienes nacionales así como
el suelo?
 La NOM-001-SEMARNAT-1996 establece los límites máximos permisibles de
contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes
nacionales, con el objeto de proteger su calidad y posibilitar su reúso.
 Para determinar la contaminación por elementos patógenos se tomara como
indicador a los coliformes fecales. El límite máximo permisible para las
descargas de aguas residuales vertidas a aguas y bienes nacionales, así como las
descargas vertidas al suelo (uso en riego agrícola) es de 1000 y 2000 como
número más probable (NMP) de coliformes fecales por cada 100 ml.

Bibliografía:

http://www.profepa.gob.mx/innovaportal/file/3290/1/nom-001-semarnat-
1996.pdf … NORMA OFICIAL MEXICANA nom-001-semarnat-1996

2. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el agente

etiológico correspondiente.

Enfermedad Agente etiológico Trasmisión

Shigelosis Shigella spp. Fecal-oral, de persona a persona

Cólera Vibrio cholerae Fecal-oral, de persona a persona

Paratifoidea Salmonella paratyphi Fecal-oral, de persona a persona

Leptospirosis Leptospira spp. Excretada por animales (especialmente

roedores) con la orina infectan al hombre a
través de la piel

Malaria Plasmodium spp. Transmitida por mosquitosAnopheles, de

persona a mosquito a persona

Bibliografía
http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/contenido/capitulo13.html ....enfermedades
transmitidas por el agua
3. Además de representar un riesgo para la salud publica el vertidos de aguas
residuales tratadas inadecuadamente o sin tratar a los depósitos naturales,
¿qué otros efectos indeseables pueden representar?

Los efectos de la contaminación del agua incluyen los que afectan a la salud humana. La
presencia de nitratos (sales del ácido nítrico) en el agua potable puede producir una
enfermedad infantil que en ocasiones es mortal. El cadmio presente en los fertilizantes
derivados del cieno puede ser absorbido por las cosechas; de ser ingerido en cantidad
suficiente, el metal puede producir un trastorno diarreico agudo así como lesiones en el hígado
y los riñones. Hace tiempo que se conoce o se sospecha de la peligrosidad de sustancias
inorgánicas como el mercurio, el arsénico y el plomo.

Bibliografía

http://html.rincondelvago.com/aguas-residuales_2.html ........ efectos aguas residuales

4. ¿Cuáles son los limites máximos permisibles de coliformes fecales en aguas

residuales tratadas que se reúsan en servicios al público? indicar NOM
NORMA Oficial Mexicana NOM-003-ECOL-1997, Que establece los límites máximos
permisibles de contaminantes para las aguas residuales tratadas que se reúsen en
servicios al público.

BIBLIOGRAFIA:
http://www.sedema.df.gob.mx/sedema/images/archivos/sedema/leyes-
reglamentos/normas/federales/NOM-003-SEMARNAT-1997.pdf ... NORMA Oficial
Mexicana NOM-003-ECOL-1997