LICENCIATURA EN CIENCIA Y

TECNOLOGÍA
Í DE LOS ALIMENTOS

QUÍMICA
Í DE LOS ALIMENTOS

ÁNALISIS DEL CONTENIDO

DE PROTEÍNAS
EN LOS ALIMENTOS

2017
Dra. Roxana Verdini

rverdini@fbioyf.unr.edu.ar
 Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
La determinación
ó de la CANTIDAD DE
PROTEÍNA de un alimento no es sencilla y el
valor obtenido en cada caso depende del
MÉTODO utilizado.
Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA
DE UNA DETERMINADA CADENA LATERAL
AMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).
los resultados analíticos se verán
condicionados por la proporción del
aminoácido en cuestión en las proteínas
sometidas al ensayo y necesitarán ser
referidos a alguna proteína estándar.
Otros métodos se basan en la determinación
del contenido de NITRÓGENO
Ó TOTAL
(Kjeldahl).
 Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos

Existen numerosas fuentes de NITRÓGENO

NO PROTEICO q que p pueden interferir en
algunos métodos de análisis:

aminoácidos
i á id libres,
lib péptidos
é tid
pequeños, ácidos nucleicos,
fosfolípidos aminoazúcares,
fosfolípidos, aminoazúcares porfirina,
porfirina
algunas vitaminas, alcaloides, ácido
úrico, urea, iones amonio, etc.

Otras fuentes de interferencia pueden ser

los otros macronutrientes presentes en los
alimentos como hidratos de carbono y lípidos.
 Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
Los métodos mas comúnmente empleados son:

Kjeldahl

Kjeldahl/Bethelot

Bi
Biuret
t

Lowry

Absorbancia a 280 nm

Fijación de colorantes

Turbidimétrico
 Métodos de análisis del contenido
proteínas en alimentos
Estos métodos se fundamentan en:

determinaciones de nitrógeno

enlaces peptídicos

aminoácidos
i á id aromáticos
áti

absortividad UV de las proteínas

grupos amino libres

propiedades de dispersión de la luz

capacidad de adhesión de colorantes

 Método de Kjeldahl
j

Es un método oficial descrito en múltiples

p
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y
distintas Directivas Comunitarias.

Se basa en los siguientes supuestos:

la
l proporción
ió ded nitrógeno
it ó no proteínico
t í i
en un producto alimenticio es demasiado
pequeña para ser significativa,
significativa
una determinación del contenido de
nitrógeno total (refleja con suficiente
precisión el contenido de proteína del
alimento,
alimento
la proporción que representa el nitrógeno
en la mayor parte de las proteínas
alimenticias es de 16%.
 Método de Kjeldahl
j

FUNDAMENTO

 Involucra la conversión del nitrógeno

presente
t a sulfato
lf t d
de amonio
i por
DIGESTIÓN, DESTRUCCIÓN OXIDATIVA O
MINERALIZACIÓN con ácido sulfúrico.
sulfúrico

Posteriormente el sulfato de amonio se

descompone por ALCALINIZACIÓN con
hidróxido de sodio y DESTILACIÓN del
amoníaco liberado captándolo en una solución
ácida.

Finalmente se realiza una VALORACIÓN

del amoníaco.
amoníaco
 Método de Kjeldahl
j
 El ácido sulfúrico OXIDA LA MATERIA
ORGÁNICA y se combina con el amonio
formado.
 Los elementos
L l carbono
b e hidrógeno
hid ó se
convierten en dióxido de carbono y agua.
Durante la digestión se libera el nitrógeno
proteico para formar iones de amonio.
Esta determinación incluye todo el
nitrógeno reducido presente (-NH2 y =NH),
de modo que los compuestos amoniacales,
urea y aminoácidos libres son también
valorados.
valorados
 El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo
para la
l formación
f ió de
d burbujas.
b b j
 Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES

Digestión:

n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralización y destilación

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2 BO3-

Titulación

H2BO3- + H+ H3BO3
 Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

 En 1883 el investigador danés Johann

Kj ld hl desarrolló
Kjeldahl d lló ell proceso básico
bá i d l
del
conocido método actual de análisis de
proteínas por el método Kjeldahl,
Kjeldahl más
propiamente, para analizar nitrógeno
g
orgánico.

El método original fue sufriendo luego

algunas
l modificaciones.
df

 Wilforth (1885)
 Gunning (1889)
 Arnold
 Winkler
 Método de Kjeldahl

UN POCO DE HISTORIA

 En el método original la digestión se

efectuaba con una mezcla de ácido sulfúrico y
anhídrido fosfórico y la oxidación se
completaba
p mediante la adición de
permanganato de potasio.

Las modificaciones
df d l método
del é d que han
h
resultado más útiles emplean:
 óxido de mercurio como catalizador
de oxidación (Wilfoth).
 K2SO4 para aumentar t ell punto
t de
d
ebullición del ácido sulfúrico (Gunning).
 CuSO4 también como catalizador de
oxidación (Arnold).
 Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA
 Los catalizadores permiten acortar el tiempo
de digestión y actúan como transportadores de
O2 .
Cuando se usa Hg como catalizador, éste debe
ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.
 Otra modificación ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilación propuesta
por Winkler:
 originalmente se utilizaba ácido sulfúrico
valorado para captar el amoníaco,
amoníaco
 titulando posteriormente su exceso con
NaOH valorado.
valorado
 Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA

La modificación consiste en:

 recibir el NH3 sobre una solución de

ácido bórico,
 valorarlo directamente con solución
valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas: la solución de ácido bórico no necesita

ser exactamente medida,
medida eliminando los errores en
la medición del ácido valorado en el colector y por
otra parte sólo se requiere una solución valorada
H2SO4 o HCl.
 Método de Kjeldahl
j
ESQUEMÁTICAMENTE
 Método de Kjeldahl
j
ESQUEMÁTICAMENTE
 Método de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN
 Método de Kjeldahl
j

ALGUNOS EQUIPOS

Los equipos
p mas modernos vienen con un
sistema de EXTRACCIÓNÓ Y
NEUTRALIZACIÓN DE GASES:

 una unidad “Scrubber” q

que bloquea
q el
paso y neutraliza las condensaciones
ácidas,

 una bomba de recirculación de agua que

proporciona un gran caudal de vacío para
la aspiración de los gases.
 Método de Kjeldahl
j
UNIDADES DE DIGESTIÓN, SCRUBBER Y BOMBA
 Método de Kjeldahl
j
DESTILADORES
 Método de Kjeldahl
j
DESTILADORES Y TITULADORES
 Método de Kjeldahl

VENTAJAS DEL MÉTODO

Apropiado para varios tipos de

productos.
d
Alta confiabilidad.
Usado como método de referencia.

DESVENTAJAS DEL MÉTODO

Interfieren compuestos nitrogenados no

proteicos.
proteicos
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.
 Método de Kjeldahl
j

FACTOR DE CONVERSIÓN
El contenido porcentual promedio de N en
las proteínas de diversos alimentos es de
16%.
El factor para convertir N en proteínas
sería entonces 100/16 = 6,25.
Este factor general de conversión no es sin
embargo exacto, ya que las proteínas de
origen animal contienen generalmente menos
nitrógeno y las de origen vegetal más.
Así,
Así el factor de conversión para la
proteína del trigo es 5,7 y para la de
productos lácteos es 6,38.
 Método de Kjeldahl
j

FACTOR DE CONVERSIÓN

Actualmente se conoce el contenido de N, y

por lo tanto el factor apropiado,
apropiado de una gran
cantidad de productos agrícolas.

Debido
bd a lla confusión
f ó que podría
d í derivarse
d
del hecho de utilizar el factor general de
conversión 6,25
6 25 o el específico para la
proteína en estudio

 Es necesario aclarar siempre en los

informes el factor de conversión utilizado
para ell cálculo
ál l ded proteínas.
t í
 Método de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIÓN
 Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES

Digestión:

n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralización y destilación

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2 BO3-

Titulación

H2BO3- + H+ H3BO3
 Método de Kjeldahl
j
CÁLCULOS

%N = V x N x 14 x 100
1000 P

%N = V x N x 0,014 x 100
P

V: mL de ácido
N: normalidad del ácido
P: gramos de muestra
,
0,014: equivalente
q volumétrico del N
 Método de Kjeldahl
j
Método de Kjeldahl/Berthelot
 Este método
E é d combina
b l d
la digestión
ó húmeda
hú d
del método de Kjeldahl con la reacción
colorimétrica de Bethelot.
Bethelot
 Al producto de la digestión se le reduce la
acidez,
id ll
lleva a volumen
l fi l y luego
final l una
alícuota se somete a la reacción
colorimétrica.
colorimétrica
 El NH4+ presente en la digestión sulfúrica
reacciona
i con ell fenol
f l e hipoclorito
hi l it ded sodio
di
en medio alcalino, formándose un complejo de
color azul.
azul
 La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.
 Método de Kjeldahl
j

Método de Kjeldahl
j /Berthelot

 La absorbancia del complejo

p j de se lee
a 540 nm.

 Se calibra con solución de sulfato de

amonio.

Por lo tanto lo que se determina por

este
t método
ét d es NITRÓGENO TOTAL.
TOTAL
 Otros métodos
m

 Los alimentos son una matriz compleja

p j
por lo que se sugiere que estos métodos
empíricos
p e indirectos sean calibrados con
el método de Kjeldahl.

 Se espera una buena correlación entre

estos dos tipos de determinaciones de
proteína
í cuando la l relación
l ó N no
proteico/N proteico es baja y constante.

Son satisfactorios para leche y

cereales
l e insatisfactorios
i ti f t i para la
l
mayoría de los vegetales y mezclas de
alimentos.
alimentos
 Otros métodos
m

Método de absorbancia a 280 nm

 El método se basa en la medición de
absorbancia a 280
80 nm.
 La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm.,
nm la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina y al grupo
p
indólico del triptofano.
 Otros métodos
m
Método de absorbancia a 280 nm
 Es un método
E é d simple,
l rápido
á d y no
destructivo.
 Es un método directo para la
determinación de proteínas que puede
aplicarse
li en algunos
l sistemas
i t alimenticios.
li ti i
 Es necesaria la calibración con una
proteína estándar.
Generalmente se toma una proteína
p
como la Albúmina Sérica Bovina (BSA), que
es soluble en agua, para construir curvas
patrón
ó que sirvan ded referencia
f para
cuantificar otras proteínas, que serán más
precisas mientras la proteína en cuestión
se parezca más a la BSA.
 Otros métodos
m
Método de absorbancia a 280 nm
La solución
l ó debe
d b ser clara
l e incolora,
l l
la
turbidez puede afectar los resultados.
 El contenido de aminoácidos aromáticos
difiere considerablemente entre las distintas
proteínas.
t í
Los ácidos nucleicos interfieren (anillos de
purina y pirimida), no así el amonio.
 Otros métodos
m
Método de Biuret
Comprende un ensayo colorimétrico de un
paso donde se cuantifica la formación de un
p j estable entre p
complejo proteínas y cobre ((II))
de configuración desconocida.
El complejo presenta un color violeta
característico, que se puede observar a
310nm o 540-560nm, el cual se da p por la
coordinación de un átomo de cobre con cuatro
átomos de nitrógeno.
El complejo se basa en la desprotonación de
los grupos amida para formar el enlace con el
cobre (II) o por el establecimiento de un
enlace coordinado entre el metal y los pares
d electrones
de l t lib
libres d los
de l átomos
át d oxigeno
de i
y de nitrógeno del péptido.
 Otros métodos
m

Método de Biuret
 Otros métodos
m

Método de Biuret
 Después de la adición del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para desarrollar
una coloración de Biuret estable; es necesario
considerar la posible influencia de aminoácidos
libres que forman buffer en configuración tris
y amoniaco.
 El complejo tiene dos máximos a 330 y a
545 nm.
 La lectura se hace usualmente a 545 nm,
dado q
que a la longitud
g de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.
 Otros métodos
m
Método de Biuret
Es rápido,
rápido simple y no detecta nitrógeno de
fuentes no proteicas o no peptídicas.
Es necesaria la calibración con una proteína
estándar.
Altas concentraciones de carbohidratos,
carbohidratos
lípidos pueden causar opalescencia en la solución
f
final.
.
Las sales de amonio también interfieren en la
reacción.
Se ha encontrado poca aplicación en análisis
de alimentos debido a la presencia de
interferentes como azúcares reductores que
p
reducen el ion cúprico en medio alcalino
produciendo resultados insatisfactorios.
Ejemplo: leche.
 Otros métodos
m
Método de Lowry
El método
ét d ded Lowry
L combina
bi l reacción
la ió ded
Biuret con la reducción del reactivo de Folin-
Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico)
por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína,
cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen,
1988).
1988)
El proceso de oxido-reducción se acompaña de
lla formación
f ió de
d un color
l azull característico.
t í ti
Los quelatos de cobre en la estructura del
péptido
é tid facilitan
f ilit l transferencia
la t f i de
d electrones
l t d
de
los grupos funcionales amino al cromóforo ácido.
 Este
E t método
ét d es útil para determinar
d t i pequeñas
ñ
cantidades de proteína en una disolución.
El desarrollo
d ll de
d color
l es dependiente
d di t del
d l pH,
H
que se debe mantener entre 10 y 10.5.
 Otros métodos
m
Método de Lowry
 Otros métodos
m
Método de Lowry
Tiene mayor sensibilidad que el método del
Biuret.
La respuesta del color varía de acuerdo al
tipo de proteína.
La
L iintensidad
t id d del
d l color
l no es estrictamente
t i t t
proporcional a la concentración de proteína.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e
hidratos de carbono interfieren en la
reacción.
ió
Es menos afectado por la turbidez de la
muestra.
Es afectado p por la presencia
p de azúcares
reductores al igual que el método de Biuret.
 Otros métodos
m
Métodos de adhesión de colorante

 Controlando el pH y la fuerza iónica del medio

los g
grupos
up funcionales ácidos y básicos de las
fu
proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos
de carga opuesta.
Al realizarse la unión se presenta coloración o
bien un cambio de ésta.
Comúnmente se usan colorantes sulfonados los
cuales reaccionan a pH ácido con el grupo ε-amino
d la
de l lisina
li i y ell grupo guanidina
idi d
de l arginina,
la i i ell
imidazol de la histidina y un número limitado de α-
amino
am n tterminales.
rm na .
Pueden adherirse colorantes ANIÓNICOS o
CATIÓNICOS
N ((BRADFORD).
DF D).
 Otros métodos
m

Métodos de adhesión de colorante aniónico

El COLORANTE ANIÓNICO se une a los
grupos catiónicos de los residuos básicos de
las proteínas (histidina, arginina, lisina) y
forman un complejo insoluble.
El colorante en exceso permanece soluble y
se relaciona inversamente con la
concentración de proteínas.
El método con el colorante NARANJA 12
está descripto en la AOAC para leche fluida,
helados, leche en p polvo descremada (λ=480
nm).
Algunos compuestos no proteicos como
almidón o metales pueden unirse al colorante.
 Otros métodos
m
Método de Bradford
Se basa en lla unión
b ó del
d l colorante
l Coomassie
Blue G-250 a las proteínas.
Las proteínas (aminoácidos básicos y
aromáticos) se unen a la forma azul para
f
formar un complejo
l j proteína-colorante
t í l t con un
coeficiente de extinción mayor que el
colorante libre.
libre
Este método es sensible, simple, rápido,
b
barato
t y pocas sustancias
t i i t fi
interfieren en su
determinación.
Entre
E llas sustancias que interfieren
f están
á
los detergentes y las soluciones básicas.
No interfieren los carbohidratos.
 Otros métodos
m

Método de Bradford

Los aminoácidos que son reconocidos por el

colorante son arginina, fenilalanina, triptofano
y prolina.
El azul de Coomasie libre se detecta a 470
nm mientras q
que la forma unida a p
proteínas a
595 nm.
Esto se debe a que el Coomassie se une
preferencialmente a los aminoácidos
mencionados y cambia de un estado
catiónico a uno aniónico.
 Otros métodos
m
Método de Bradford
 Otros métodos
m
Espectroscopia infrarroja
Se aprovecha la absorción del grupo amida
del enlace peptídico.
 Ventajas:
Es un método rápido
rápido, análisis de
multicomponentes
No destructivo
destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibración complejo
complejo.
 Otros métodos
m
Espectroscopia infrarroja reflectante
 La muestra se ilumina
l con seis longitudes
l d
de onda cercanas a la radiación infrarroja y
se detecta la luz reflejada.
reflejada
Consideración
Es necesaria la calibración contra un
conjunto de muestras estadísticamente
significativas, analizadas por métodos de
referencia tradicionales.
Ventajas
Rápido,
Rápido análisis de multicomponentes.
multicomponentes
Aplicable a materiales sólidos.
Cuantifica proteína en presencia de
agua.
 Determinación
m de la secuencia de
aminoácidos
La
L d t mi
determinación
ió d
de l
la composición
m i ió
proporciona una información sobre una
proteína.
proteína
A veces se necesita identificar la secuencia
de los aminoácidos,
aminoácidos para lo que se cuenta con
dos métodos:
 secuenciación
i ió de
d lal cadena
d polipeptídica
li tídi
en equipos automatizados llamados
secuenciadores de proteínas.
proteínas
 análisis con espectrometría de masas
d los
de l péptidos
é tid generados
d y sus masas
moleculares respectivas.
 Determinación
m de la secuencia de
aminoácidos
Por
P ell tamaño
t m ñ d
de l
las m lé l
moléculas, se
hidrolizan con proteasas específicas, para
posteriormente secuenciar e identificar más
fácilmente porciones de 10 a 20 aminoácidos
de los ppéptidos
p generados.
g
La combinación de proteasas específicas y
los péptidos generados alimentados a bases
de datos que tengan la información de
g
digestiones enzimáticas, permiten
p ir
completando las secuencias.
Se ensaya el orden posible de los péptidos
al compararlos con bases de datos que tengan
la información de digestiones enzimáticas
provenientes de proteínas cuya secuencia ha
sido ya elucidada.
 Determinación
m de la secuencia de
aminoácidos
Pehr
P h Edman
Edm d
descubrió
b ió una secuencia
i de
d
reacciones que permiten identificar los N-
terminales y que al realizarse repetidamente
permiten identificar la secuencia completa de
los p
polipéptidos
p p en cuestión.
El reactivo utilizado por Edman es el
fenilsiotiocianato que reacciona con el amino
terminal para producir el feniltiocarbamilo del
p p
péptido.
El conocimiento de la secuencia de
proteínas es cada vez más necesario para
identificar la presencia de variantes naturales
a la luz de los nuevos alimentos de origen
transgénico.
 Determinación
m de proteínas
p por
p
electroforesis
Pueden
P d realizarse
li electroforesis
l t f i en
condiciones nativas en las que las proteínas
migran conservando su diversidad y
propiedades físicas, especialmente su punto
isoeléctrico y p
peso molecular.
Es posible utilizarla en una sola dimensión o
en dos dimensiones (2D).
(2D) Se les denomina 1D
o 2D-PAGE (por sus siglas en inglés,
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).
Una vez realizadas las separaciones,
generalmente se continúa con una digestión
proteolítica y la separación de los fragmentos
por electroelución o para su análisis por
espectroscopia de masas (MS).
 Determinación
m de proteínas
p por
p
electroforesis
La
L PAGE puede d ll
llevarse a cabo b en
condiciones denaturalizantes si se utilizan
tiol-reductores fuertes como mercaptoetanol
y ditiotreitol (DTT) y un detergente
desnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato de
sodio (SDS).
El tratamiento con ambas sustancias las
despliega y las cargas negativas conferidas
por los g
p grupos
p sulfato del SDS p permite la
migración de las moléculas hacia el ánodo, de
acuerdo con su peso molecular
exclusivamente.
l i t
 Determinación
m de proteínas
p por
p
electroforesis
Las
L técnicas
té i 2D permiten
mit una segunda
d
separación que discrimina proteínas que en 1D
se traslapan,
traslapan por ejemplo,
ejemplo cuando son
especies moleculares múltiples, aun cuando se
trate de pproteínas p
purificadas.
Para el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separación por carga eléctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separación
por p
p peso molecular.
Esta poderosa técnica se ha convertido en
un sinónimo de Proteómica y el mejor método
para la resolución de mezclas complejas de
proteínas.
 Determinación
m de proteínas
p por
p
electroforesis
Las
L técnicas
té i 2D permiten
mit una segunda
d
separación que discrimina proteínas que en 1D
se traslapan,
traslapan por ejemplo,
ejemplo cuando son
especies moleculares múltiples, aun cuando se
trate de pproteínas p
purificadas.
Para el primer paso en una 2D-SDS-PAGE
se aplica una separación por carga eléctrica
(isoelectroenfoque) y una segunda separación
por p
p peso molecular.
Esta poderosa técnica se ha convertido en
un sinónimo de Proteómica y el mejor método
para la resolución de mezclas complejas de
proteínas.