EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD

DE REACCIÓN TRIPSINA

INTRODUCCIÓN

Cuando se utilizan concentraciones crecientes de sustrato en una serie de

determinaciones, se encuentra generalmente una curva hiperbólica. La velocidad se
expresa corrientemente en unidades (µmol de producto formado o de sustrato
transformado por minuto) o en actividad específica (unidades por miligramo de proteína).
La velocidad aumenta con la concentración de sustrato hasta que se aproxima de forma
asintótica a una v máxima (Vmáx), después de la cual concentraciones mayores de
sustrato no aumentan de forma significativa la velocidad de reacción. En la primera parte
inferior de la curva hiperbólica, la reacción se aproxima a una cinética de primer orden, lo
que significa que v es una función directa de la concentración de sustrato porque los sitios
activos de las moléculas de enzima no están saturados. En la porción superior de la
gráfica, la reacción se aproxima a cinética de orden cero porque los sitios activos de todas
las moléculas de enzima están saturados y la velocidad de reacción, es por consiguiente,
independiente de posteriores incrementos en la concentración de sustrato. El Km es la
concentración de sustrato necesario para obtener la mitad de la velocidad máixma. Y se
expresa en M(molaridad) (Armstrong y Bennett, 1982). Puede considerarse como medida
aproximada de la afinidad de una enzima. En esta ocasión para hallar el Km se trabajará
con el gráfico de Lineweaver y burck que es una modificación de la ecuación de michaelis
y menten. En esta práctica se trabajó con la tripsina que libera a la p-nitroanilina del
BAPNA; esto es medido con un elecrofotómetro a 410nm. Los objetivos son calcular el Km
y la Vm. Hallar las diferencias cuando se usan diferentes concentraciones de enzima

Metodología.

1. Se agregan a tubos 2.5ml de BAPNA más Tris, en cantidades de BAPNA señaladas

por el profesor (0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25) y cada uno tiene un tubo a reaccionar y
un tubo blanco
2. Se pre-incubas los tubos 5 minutos a 37°C
3. Se agregan a los tubos (que NO SON LOS BLANCOS) 0.25ml de la solución de
trabajo. Esta varía de acuerdo al grupo. Se trabaja con 2ml de tripsina en 25ml (enrasado
con una solución que contiene HCl y CaCl2), 3ml en 25ml, 1ml en 25ml, 1.33ml en 25ml.
Considerar que el stock de tripsina tiene una concentración de 12.3mg%
4. Se incuban todos los tubos 10 minutos a 17°C
5. Se agregan 0.25ml de ácido acético a los tubos
6. Se agregan 0.25ml de la solución de trabajo a los tubos blanco

Resultados

En la siguiente tabla (TABLA 1) se observan los siguientes títulos. Absorbancia obtenida

de la resta entre la absorbancia obtenida en un tubo con su respectivo blanco.
Concentración del producto (M) hallada dividiendo la Absorbancia entre el
coeficiente de extinción molar de nitroanilina 7760 (1/cm.M). Cantidad de moles de
producto obtenido en los 3ml totales de la reacción, esta fue obtenida por regla de tres
simple, trabajando con la concentración de producto obtenida anteriormente. UE
(mol/minuto), obtenida dividiendo la cantidad anterior entre 10 minutos.
La concentración del sustrato se encuentra sabiendo que hay 0.04g de BAPNA
(PM=434.88g), es decir 9,198.10 -5 moles de BAPNA. Entonces la concentración del BAPNA
en los 100ml en los que se encontraba es 9,198.10-4M. Con la fórmula de dilución
(C1V1=C2V2) se encuentra la concentración en las diferentes diluciones de BAPNA con las
que se trabaja en cada tubo. Cada grupo trabajó con diferente concentración de enzima
también señalada

Cantid Absorban Concentrac Cantidad UE Concentra 1/V 1/S (1/M)

ad de cia ión de de (mol/min) ción de (min/mol
BAPNA producto producto sustrato )
(ml) (M) (mol) (S)M.
2ml de tripsina en 25 ml (0.984mg% de tripsina)
0.75 0.122 1.57216E- 4.71649E- 4.71649E- 0.0002759 2120218 3624.015
05 08 09 4 58
1 0.172 2.21649E- 6.64948E- 6.64948E- 0.0003679 1503875 2718.011
05 08 09 2 97
1.25 0.18 2.31959E- 6.95876E- 6.95876E- 0.0004599 1437037 2174.409
05 08 09 04
1.5 0.207 2.66753E- 8.00258E- 8.00258E- 0.0005518 1249597 1812.007
05 08 09 7 42
1.75 0.206 2.65464E- 7.96392E- 7.96392E- 0.0006438 1255663 1553.149
05 08 09 5 43
1.25 0.177 2.28093E- 6.84278E- 6.84278E- 0.0004599 1461393 2174.409
05 08 09 60
1.5 0.187 2.40979E- 7.22938E- 7.22938E- 0.0005518 1383244 1812.007
05 08 09 7 21
1.75 0.196 2.52577E- 7.57732E- 7.57732E- 0.0006438 1319727 1553.149
05 08 09 5 89
2 0.212 2.73196E- 8.19588E- 8.19588E- 0.0007358 1220125 1359.005
05 08 09 3 79
2.25 0.221 2.84794E- 8.54381E- 8.54381E- 0.0008278 1170437 1208.005
05 08 09 1 41
3ml de enzima en 25 ml (1.476mg% de tripsina)
0.75 0.19 2.44845E- 7.34536E- 7.34536E- 0.0002759 1361403 3624.015
05 08 09 4 51
1.25 0.235 3.02835E- 9.08505E- 9.08505E- 0.0004599 1100709 2174.409
05 08 09 22
1.5 0.29 3.73711E- 1.12113E- 1.12113E- 0.0005518 8919540 1812.007
05 07 08 7 2.3
2 0.351 4.5232E-05 1.35696E- 1.35696E- 0.0007358 7369420 1359.005
07 08 3 7
2.25 0.327 4.21392E- 1.26418E- 1.26418E- 0.0008278 7910295 1208.005
05 07 08 1 6.2
1ml de la enzima en 25 ml (0492mg% de tripsina)
0.75 0.111 1.43041E- 4.29124E- 4.29124E- 0.0002759 2330330 3624.015
05 08 09 4 33
1.25 0.165 2.12629E- 6.37887E- 6.37887E- 0.0004599 1567676 2174.409
05 08 09 77
1.5 0.171 2.20361E- 6.61082E- 6.61082E- 0.0005518 1512670 1812.007
05 08 09 7 57
2 0.238 3.06701E- 9.20103E- 9.20103E- 0.0007358 1086834 1359.005
 05 08 09 3 73
2.25 0.261 3.3634E-051.00902E- 1.00902E- 0.0008278 9910600 1208.005
07 08 1 2.6
Dilución 1.33ml en 25ml (0.65436mg% de tripsina)
0.75 0.06 7.73196E- 2.31959E- 2.31959E- 0.0002759 4311111 3624.015
06 08 09 4 11
1.25 0.072 9.27835E- 2.78351E- 2.78351E- 0.0004599 3592592 2174.409
06 08 09 59
1.5 0.113 1.45619E- 4.36856E- 4.36856E- 0.0005518 2289085 1812.007
05 08 09 7 55
2 0.116 1.49485E- 4.48454E- 4.48454E- 0.0007358 2229885 1359.005
05 08 09 3 06
2.25 0.121 1.55928E- 4.67784E- 4.67784E- 0.0008278 2137741 1208.005
05 08 09 1 05
TABLA1

Si trabajo con UE/L como velocidad (considerando los mililitros de enzima que se
utilizaron para las diluciones), se obtiene la siguiente tabla:

(S) M V (UE/L) M/min (S) M V (UE/L) M/min

0.00027594 2.35825E-06 0.00027594 4.29124E-06
0.00036792 3.32474E-06 0.0004599 6.37887E-06
0.0004599 3.47938E-06 0.00055187 6.61082E-06
0.00055187 4.00129E-06 0.00073583 9.20103E-06
0.00064385 3.98196E-06 0.00082781 1.00902E-05
0.0004599 3.42139E-06 0.00027594 1.74405E-06
0.00055187 3.61469E-06 0.0004599 2.09286E-06
0.00064385 3.78866E-06 0.00055187 3.28463E-06
0.00073583 4.09794E-06 0.00073583 3.37183E-06
0.00082781 4.27191E-06 0.00082781 3.51717E-06
0.00027594 2.44845E-06 0.00073583 4.5232E-06
0.0004599 3.02835E-06 0.00082781 4.21392E-06
0.00055187 3.73711E-06
TABLA 2

Es decir en resumen de la TABLA 2 se

obtiene la siguiente TABLA 3 y el GRÁFICO1 de acuerdo a la fórmula de Michaelis y
Menden

S (M) V (M/min)
0.000275 2.7105E-06
94
 0.000367 3.32474E-06
92
0.000459 3.68017E-06
9
0.000551 4.24971E-06
87
0.000643 3.78866E-06
85
0.000735 5.2985E-06
83
0.000827 5.5233E-06
81
TABLA 3

DILUCIÓN DE LA ENZIMA 3ml en 2

tripsina)

f(x) = 35799.65x + 69656250.21

R² = 0.91 f(x) = 25785.94x + 45153766.79
R² = 0.95

DILUCIÓN DE
LA ENZIMA 2ml en 25ml (0.984mg% de tripsina)

Vmax= 2.10-08mol/min
Km= 0.00051572
Vmax= 1.42857.10-08mol/min
Km=0.000511429 M
 DILUCIÓN DE LA ENZIMA 1ml en 25 ml (0492mg%
DILUCIÓN
de DE LA ENZIMA 1.33ml en 25m
tripsina) tripsina)

f(x) = 54249.02x + 39348181.86

R² = 0.98 f(x) = 95271.53x + 97284182.83
R² = 0.88

Vmax=2.510-08mol/min
Km= 0.001356225

Vmax= 1. 10-08mol/min
Km=0.00095272

Trabajando con el gráfico de lineweaver y burlk para cada diferente concentración de enzima se
obtienen los siguientes gráficos (GRAFICA2). En todas, 1/S (1/M) está en las ordenadas y 1/V
(min/mol), en abscisas. (VER DATOS DE TABLA1)

Variación de la Velocidad de reacción (mol/min) de acuerdo a concentración

de enzima

1/V (min/mol)
1/S (1/M) 1/25 (0492mg%) 1.33/25(0.65436mg
2/25 (0.984mg%)
3/25(1.476mg%)
%)
3624.01 233033033 431111111 212021858 136140351
563
2174.40 156767676.8 359259259 144921532 110070922
938
1812.00 151267056.5 228908555 131642082 89195402.3
781
1359.00 108683473.4 222988506 122012579 73694207
586
 1208.00 99106002.55 213774105 117043741 79102956.2
521

TABLA 4

GRÁFICA3

1/S (1/M) vs 1/V (min/mol)

GRÁFICA3

DISUSIÓN DE RESULTADOS

1. Se observa en la TABLA 4 y GRÁFICA 3 que conforme aumenta la

concentración de enzima la velocidad incrementa (Excepto a concentración de
0.65436mg% de tripsina)

Se espera que la velocidad inicial de la reacción sea proporcional a la concentración de la

enzima. (Eisenthal y Danson, 2002). Si bien, en los resultados se ha observado un incremento
de la velocidad inicial conforme aumenta la concentración de la enzima, este no ha sido
proporcional. (ver TABLA4)
 Observando el conjunto de gráficas de la GRAFICA2, se observa que las
velocidades máximas no coinciden con lo antes propuesto porque se observa que la
velocidad máxima cuando la dilución de enzima es 1/25 (2.510-08mol/min) es mayor
que cuando la dilución es 3/25 (2.10-08mol/min).

2. En el gráfico de Michaelis y menten obtenido en la GRÁFICA 1 se

observa que a mayor concentración de sustrato mayor velocidad

En la GRAFICA1 cuando se unen todos los valores obtenidos en la práctica se puede

observar que la gráfica coincide con el gráfico hiperbólico que normalmente se
obtiene y que demuestra que a mayor concentración de sustrato mayor velocidad
(Armstrong y Bennett, 1982)

3. Se observa que el valor del Km varia muy poco conforme varia la

concentración de enzima.

El Km por definición es la concentración de sustrato cuando la velocidad es la mitad de la

velocidad máxima. Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es
característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). En la práctica se
obtuvieron Km bastante similares entre sí, excepto cuando la dilución de tripsina es de 1ml en
25 ml. (Observar GRAFICA2).

4. El Km obtenido con todos los datos es 6,599.10 -4M y la velocidad máxima

es 9,1328x10-6(min/M)

1/S (1/M) 1/V (min/M) En la siguiente tabla y gráfico, basados en la TABLA 3,se puede obtener
3623.976 el valor de Km de la tripsina
23 3.69E+05
2717.982
17 3.01E+05 f(x) = 72.26x + 109494.61
2174.385 R² = 0.9
74 2.72E+05
1812.020
95 2.35E+05
1553.156
79 2.64E+05
1359.009
55 1.89E+05
1208.006
67 1.81E+05

-4 -4
Según trabajos anteriores, el Km para la tripsina con respecto al BAPNA es 1.4x10 o 8.7 x10
en tripsina de sardina y bovina respectivamente.

No se sabe en la práctica con que tripsina se trabajó pero el valor obtenido es muy cercano a
los mencionados. Además el promedio de los Km obtenidos con las diferentes diluciones de
enzima es 8.3x10-4

La mayor parte de los errores que se tienen se deben a errores humanos, al haber quizás
incubado más del tiempo requerido o no haber calculado bien las diluciones. Sin embargo se
observan alta correlación en la mayoría de los gráficos lineales obtenidos lo que indica que la
cantidad de valores atípicos es mínima.

Conclusiones

1. En la práctica se obtiene que el Km obtenido con todos los datos es 6,599.10-4M y la

velocidad máxima es 9,1328x10-6 M/min
2. El Km y la velocidad máxima varían conforme varía la concentración de enzima. Se
puede observar que las velocidades iniciales aumentan conforme aumenta la
concentración de la enzima sin embargo también se obtienen valores (como las
velocidades máximas en las que no se observa dicha tendencia

BIBLIOGRAFÍA

Eisenthal R. y Danson M. (2002). Enzyme Assays. 2da edición. Oxford. Pag. 2