Procedimiento:

Determinación de proteínas:
Las proteínas pueden cuantificarse mediante diferentes métodos: Reacción de Biuret, con
el rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml. Método de Lowry, rango es de 0,1 – 1 mg/ml.
Método de Bradford, rango de determinación es de 1 – 10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 –
1,4 mg/ml (ensayo estándar). Método del ácido Bicincónico, rango de concentración de
proteínas es de 0,5 – 30 mg/ml. Absorbancia en el ultravioleta (480 nm), rango oscila entre
0,05 y 2 mg/ml.

A. Determinación de Proteínas (Bradford)

Se basa en la unión de un colorante, Comassic Blue G-250 (también Seva Blue) a las
proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra
naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-
colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método
es sensible (1-15 ug), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación. Ente las sustancias que interfieren están los detergentes y la
soluciones básicas.

A.1. Procedimiento:
1. Agregar 0.1 mL de muestra conteniendo 10 a 100 ug de proteínas, en tubos 13 X
100.
2. All tubo anterior agregar 2 ml de reactivo de coloración de proteína. Mezclar con
inversión o por agitación suave.
3. Leer la absorbancia a 595 nm después de 5 minutos (las lecturas pueden
realizarse hasta 20 minutos) contra un blanco reactivo.

A.2. Preparación del reactivo de coloración de proteína

1. Disolver 5 mg de Coomasie Brilliant Blue G 250 en 2.5 mL. de etanol al 95%.
2. A la solución anterior agregar 5 mL. De ácido fosfórico al 85% (p/v).
3. Aforar la solución anterior agregar 50 mL. Con agua destilada.
4. Dejar en reposo 24 horas en oscuridad y filtrar dos veces con papel de filtro y
guardar en botellas oscuras, no más de 15 días. El color es estable 1 hora.

A.3. Solución estándar de proteínas

Seroalbúmina bovina (BSA) 0,1 mg/mL.

A.4. Preparación de curva de calibración de proteína

1. Pesar 1000 ug de seroalbúmina bovina, disolver en 10 ml con agua destilada.
2. Colocar alícuotas de la solución anterior de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ul en
tubos. Luego completar a 100 uL con agua destilada.
 3. Agregar reactivo 1000 ul de Bradford. Agitar bien, esperar 5 min.
4. Realizar lecturas de absorbancia a595 nm contra un blanco reactivo.

Resultados:

H2O (ul/ml) Ovoalbúmina (ul) Bradford (ml) Absorbancia (595

nm)
300 0 1 0
290 10 1 0.063
280 20 1 0.001
270 30 1 0.070
260 40 1 0.075
250 50 1 0.030
240 60 1 0.183
230 70 1 0.377
220 80 1

DNS
0.2
0.18
0.16 f(x) = 0x - 0.08
Absorbancia (595 nm)

0.14 R² = 0.95
Absrobancia 595 nm
0.12 Linear (Absrobancia 595
0.1 nm)
0.08 Linear (Absrobancia 595
0.06 nm)
0.04
0.02
0
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Concentración (ug/ml)