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ANEXO I

1. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

Desde el punto de vista estructural, las enzimas son proteínas y desde el punto
de vista cinético catalizadores. La catálisis enzimático implica la formación de de
un complejo enzima substrato y enzima libre o a enzima y producto de reacción,
según el mecanismo general:

k1 k2
E+S ES E+P
k −1

Donde E representa la molécula de enzima, S es el sustrato, ES el complejo


enzima-sustrato, y P las moléculas de producto. Este mecanismo dice que la
enzima libre y el substrato libre se unen reversiblemente para formar el complejo
enzima sustrato, que conduce irreversiblemente a la obtención de producto.

El sustrato se une a una región especifica de la enzima, denominada centro


activo y la catálisis ocurre solo en dicho sitio como consecuencia de la
especificidad que se representa en la siguiente figura.

Este modelo plantea que el centro activo es el complemento geométrico del


sustrato y únicamente pueden formar el complejo de Michaelis aquellos
substratos que posean la forma complementaria adecuada.

Las principales diferencias entre los catalizadores químicos y los enzimáticos las
podemos resumir en los siguientes puntos:

• Especificidad: en algunas enzimas la especificidad puede ser absoluta


catalizando solo una reacción a partir de un único substrato. Otras como las
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proteasas hidrolizan enlaces peptídico actuando sobre un amplio rango de


proteínas.
• Estereoespecificidad: muchas enzimas son estereoespecificas reconocen solo
una configuración molecular.
• Regioespecificidad: reconocen un grupo entre otros de la misma molécula.
• Con frecuencia necesitan cofactores: un cofactor es una sustancia química
que necesitan algunas enzimas (apoenzimas) para poder actuar como
catalizadores. El enzima unido al cofactor se denomina holoenzima. Los
cofactores pueden ser cationes metálicos (Fe2+, Fe3+, Mn2+, Zn2+, etc.) o bien
moléculas orgánicas denominadas coenzimas (NAD o FAD). Cuando el
cofactor se encuentra unido irreversiblemente a la enzima se denomina grupo
prostético.

La expresión de la ley de velocidad para el mecanismo propuesto, corresponde a


la ecuación (1) donde V representa la velocidad a la que aparece el producto.

V = K2 [ES] (1)

Buscamos una expresión para la concentración del complejo enzima-sustrato. En


el estado estacionario las velocidades de formación y de destrucción de ES se
igualan y podemos escribir:

K 1 [E ][
. S ]= (K −1 + K 2 ).[ES ] (2)

En esta ecuación podríamos despejar [ES ] pero la concentración del enzima libre
[E ]es desconocida, para evitar esta dificultad podemos escribir la ecuación de
balance de materia de la enzima como:

[E0 ]= [E ] + [ES ] (3)

Donde [E0 ] es la concentración total del mineral enzimático, despejando [E ] en


esta ecuación y sustituyendo el resultado en la ecuación (2) obtenemos:

K 1 [S ][
. E 0 ] − [ES ]= (K −1 + K 2 ).[ES ]

K 1 [E 0 ][
. S]
[ES ]=
K −1 + K 2 + K 1 [S ]

Sustituyendo este valor en la ecuación (1) la velocidad de la reacción viene dada


por:

K 1 K 2 [E 0 ][
. S]
V=
K −1 + K 2 + K 1 [S ]

Dividiendo el numerador y el denominador entre [K 1 ] y definiendo [K m ] como


constante de Michaelis:
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K −1 + K 2
Km =
K1

El resultado es:

K 2 [E 0 ][
. S]
V=
K m + [S ]

Esta expresión es la ecuación de Michaelis-Menten que suele escribirse


agrupando el término, K 2 .[E 0 ]= Vmax queda de la forma:

Vmax .[S ]
V=
K m + [S ]

La ecuación de Michaelis Menten predice un comportamiento cinético de primer


orden para concentraciones bajas de substrato y de orden cero para
concentraciones elevadas, como se observa en la figura.

Significado y determinación de los parámetros cinéticos de la ecuación de


Michaelis.

Donde K m : la constante de Michaelis representa la concentración de substrato a


la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, es una
concentración y sus unidades son unidades de concentración.

K 2 .[E0 ]= Vmax : Velocidad de reacción máxima por molécula de enzima, es una


constante de velocidad aparente de primer orden, es una velocidad y sus
unidades de velocidad de reacción.

La determinación de los parámetros cinéticos puede hacerse a partir de las


linealizaciones que se obtienen de la ecuación de Michaelis:
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1 1 Km
= + Lineweaver-Burk
V K 2 [E 0 ] K 2 [E 0 ]. [S ]

V
V = Vmax − K m . Eadie-Hofstee
[S ]
De esta forma la inversa de la velocidad de la reacción es una función lineal de la
inversa de la concentración del substrato, cuando la cantidad total de enzima se
mantiene constante.

La representación grafica de los datos experimentales correspondientes a ambas


linealizaciones se representa en la figura siguiente:

La inhibición en las reacciones enzimáticas:

Los inhibidores son sustancias que hacen que una reacción enzimática transcurra
mas lentamente, este efecto puede producirse de diversas maneras:
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• Inhibición irreversible: el inhibidor se combina con el enzima dando un


complejo estable, pero inactivo.

• Inhibición reversible: se pueden distinguir tres tipos de inhibición reversible

• Inhibición competitiva: el inhibidor e combina reversiblemente con el


enzima en el mismo sitio activo que el substrato, su influencia
desaparece a altas con concentraciones de sustrato. este tipo de
inhibición produce un aumento de K m mientras que la
Vmax permanece inalterada.
• Inhibición no competitiva: el inhibidor se combina con el enzima en
otra zona distinta del centro activo, es decir no compite con el
sustrato por lo que su influencia no se modifica con la concentración
de sustrato. Este tipo de inhibición produce una disminución de Vmax
mientras que el valor de K m no se modifica.
• Inhibición anticompetitiva: el inhibidor en este caso se une
reversiblemente al complejo enzima substrato produciendo cambios
en K m y en Vmax este tipo de inhibición es poco frecuente.

El método para distinguir estos tres tipos de inhibiciones reversibles consiste en


determinar la velocidad de reacción para varias concentraciones de sustrato en
presencia de un valor constante de inhibidor.

La representación grafica de los datos utilizando la linealización de Lineweaver


Burk permite asignar el tipo de inhibición por comparación con la recta obtenida
sin inhibidor.
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2. ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD ENZIMATICA

Actividad enzimática se expresa en términos de unidades de actividad. Una


unidad se define como la cantidad de enzima que produce una cantidad de
producto (por ejemplo 1 mmol/ minuto), en una reacción y condiciones
determinadas que se utilizan como patrón para el ensayo de actividad. La
actividad específica se define entonces como:

Actividad especifica = unidades de actividad /mg de proteína = mmol de


producto / (mg de proteína). (ml.min)

La estabilidad enzimática se mide mediante el efecto de la temperatura


(inactivación termina) y del pH sobre la actividad enzimática.

Inactivacion térmica:

En cinética química, el efecto de la temperatura sobre la constante de velocidad


e describe, mediante la ecuación de Arrhenius.

− EA

K = A.e RT

Donde K es la constante de velocidad de reacción EA la energía de activación y A


el factor frecuencia.

En el caso de la catálisis enzimática, hay que tener en cuenta que las enzimas
solo son activas en un rango limitado de temperaturas. A temperaturas elevadas
e producen modificaciones de su estructura terciaria, produciéndose la
desnaturalización del biocatalizador. El rango de temperaturas en que las
enzimas mantienen actividad es bastante estrecho.

La desnaturalización térmica de enzimas limita su utilización en condiciones


prolongadas de operación, y es un factor importante en el diseño de reactores
enzimáticos. La desactivación puede ser reversible o irreversible y depende de la
temperatura y del tiempo de exposición a dicha temperatura.

El mecanismo implica una etapa inicial reversible, seguida de una etapa de


desnaturalización irreversible de primer orden. La velocidad de desactivación es
proporcional a la concentración de enzima activa.

Los estudios de estabilidad de una enzima a una determinada temperatura, se


realizan en experimentos separados incubando la enzima a una temperatura y
midiendo su actividad a distintos tiempos en la figura se representa la
desactivación térmica de la invertasa a diversas temperaturas.
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Efecto del pH sobre la actividad enzimática:

Los aminoácidos contienen grupos inonizables que pueden estar cargados


positiva o negativamente a un pH determinado, cuando estos grupos forman
parte del centro activo del enzima y solo resulta activa una forma ionizada, la
actividad enzimática queda determinada por el valor del pH de medio.

La actividad enzimática en la mayoría de los casos pasa por un pH optimo. La


figura siguiente presenta la variación de la actividad enzimática de la invertasa
con el pH.

La fuerte dependencia de la actividad enzimática con el pH y la temperatura,


hacen necesario trabajar en las condiciones adecuadas para asegurar la actividad
óptima del biocatalizador.
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3. CAMPOS DE APLICACIÓN DE LAS ENZIMAS

En los últimos años la aplicación industrial de enzimas se ha desarrollado


rápidamente, y sigue creciendo. Nuevas enzimas abren nuevas posibilidades. En
algunos sectores la aplicación de las enzimas todavía se encuentra en su
infancia.

• Industria de detergentes

El uso de enzimas en detergentes data de los años 60. Las proteasas son las
enzimas mas ampliamente utilizadas en la industria de detergentes, eliminan
manchas de origen proteico, hierba, sangre, huevo, sudor…. Las proteasas
hidrolizan las proteínas y las descomponen en polipéptidos más solubles o en
aminoácidos libres, eliminándose fácilmente este tipo de manchas de los
tejidos. También son utilizadas en detergentes las lipasas que eliminan
manchas de aceite, las amilasas eliminan residuos de comida con contenido
en almidón, las celulosas modifican la estructura de las fibras celulosicas del
algodón produciendo los siguientes efectos: Intensificación del color,
ablandamiento de la tela, eliminación de partículas de suciedad.

• Industria de alimentación

En la industria alimentaria es donde se encuentran numerosas aplicaciones


de enzimas en procesos industriales, teniendo en cuenta que se ha dedicado
un capitulo de este curso a este sector solo mencionaremos algún ejemplo

Almidón:

La conversión enzimática del almidón proporciona jarabes con diferentes


composiciones y propiedades físicas que se emplean en una gran variedad de
alimentos: bebidas refrescantes, confitería, carne, panadería, helado, salsas,
alimentos infantiles, fruta enlatada, conservas, etc.

En la conversión enzimática del almidón existen tres fases y en cada una de


ellas un tipo de enzima implicada.

En la fase de licuefacción se utilizan alfa-amilasas bacterianas, en la fase de


sacarificación se hidroliza completamente el almidón a glucosa mediante una
amiloglucosidasa también llamada glucoamilasa, por último en la fase de
isomerización es posible isomerizar una proporción de glucosa en fructuosa
que tiene casi el doble del dulzor de la glucosa utilizando una glucosa
isomerasa.

Productos lácteos y derivados

En la elaboración de quesos la Renina mejora el proceso de coagulación de la


leche, otras enzimas como las proteasas y lipasas juegan un papel
fundamental durante el proceso de maduración de acortando el tiempo de
maduración.
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El preparado de alimentos con lactosa hidrolizada enzimaticamente permite


el consumo de productos lácteos a la población que presenta intolerancia a
dicho carbohidratos.

Cervecería:

Tradicionalmente la cerveza se produce mezclando malta triturada y agua


caliente en un gran tanque llamada cuba de maceración. El líquido de esta
maceración denominado mosto se vierte en otro tanque donde se hierve y se
añade líquido. Luego el mosto con lúpulo se enfría y se transfiere a los
tanques de fermentación donde se añade la levadura.

Durante la maceración las enzimas presentes en la malta degradan el


almidón y las proteínas en azucares sencillos, aminoácidos y peptidos
pequeños que pueden ser utilizados por la levadura para la producción de
alcohol, dióxido de carbono y componentes de sabor. La sustitución de parte
de la malta por enzimas industriales proporciona un ahorro económico en el
proceso y permite un control más exacto del mismo como consecuencia de la
calidad y actividad uniforme de las enzimas industriales.

• Industria farmacéutica, algunos ejemplos

La penicilina fue el primer antibiótico producido industrialmente mediante


fermentación, químicamente se clasifica como β - lactama. Las únicas
penicilinas que se producen a rendimientos altos mediante fermentación son
la penicilina V y la penicilina G. sin embargo en la naturaleza existen
microorganismos resistentes se eliminan las cadenas laterales V y G y se
acoplan otras cadenas laterales. Las penicilinas semisintéticas son eficaces a
estas cepas resistentes.

El bloque básico para muchas penicilinas semisinteticas es el acido 6-


aminopenicelamico (6-APA) para obtener 6-APA puede hacerse
enzimáticamente eliminando la cadena lateral V o G de la penicilina utilizando
respectivamente las enzimas penicilina-V-acilasa y penicilina-G-acilasa.

Otro bloque básico para los antibióticos β - lactamicos es el acido 7-


aminodesacetoxi cefalosporamico(7-ADCA). Intermedio para la producción de
un grupo de cefalosporinas utilizadas en el tratamiento de ciertas infecciones
graves, y ocupan un 10-20% de la venta total de antibióticos β - lactamicos.
Un método para producir 7-ADCA es la transformación química de penicilina
V en V-DCA seguida de hidrólisis enzimática hasta obtener 7-ADCA.

• Producción de combustibles

En países con alta capacidad agrícola el etanol producido a partir de biomasa


puede representar un razonable sustituto o aditivo para aumentar el octanaje
en el combustible del motor tradicional. La aplicación de enzimas para
producir alcohol combustible desde almidón es un buen ejemplo de
aprovechamiento de residuos agrícolas.
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• Enzimas como agentes biosinteticos

La aplicación industrial de enzimas en biosíntesis, es decir la construcción de


moléculas complejas basada en moléculas sencillas, esta aumentando en
importancia. Por ejemplo ya se ha aislado una lipasa que cataliza la
producción de tensoactivos glicolipidos pueden ser ingredientes importantes
en detergentes, productos cosméticos y artículos de limpieza, así que su
mercado potencial es enorme.

Otro ejemplo es la producción de aminoácidos especializados que no existen


en la naturaleza, utilizando la síntesis estereoespecifica enzimática.

• Enzimas y el medio ambiente

El deterioro del medio ambiente causado por los residuos industriales puede
reducirse mediante la acción enzimática. Algunos ejemplos son : el deterioro
que se produce a causa de la contaminación del cianuro, veneno mortal,
aplicado en grandes cantidades para extraer metales preciosos y como
materia prima en la industria química actualmente se utiliza un proceso
enzimático que descompone el cianuro en acido fórmico, sustancia menos
nociva y fácilmente biodegradable. Se están desarrollando también otros
procesos enzimáticos que puedan reducir la contaminación causada por la
industria papelera

TAREA ACADEMICA

Se propone el siguiente cuestionario de auto-control que el alumno debe


desarrollar como parte de su proceso de aprendizaje:

1) Escriba el significado correspondiente a cada uno de los cuatro símbolos


utilizados en la ecuación de Michaelis-Menten:

V =

[S ] =

Km =

Vmax =

2) En la ecuación de Michaelis-Menten pueden realizarse aproximaciones para


altas y bajas concentraciones de sustrato. Completar cada una de las
sentencias:
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a) Cuando la [S ] es menor que K m /10, la velocidad de reacción resulta


……………… proporcional a la concentración de …………….. y la cinética es
de ……………… orden.

b) Cuando la [S ] es por lo menos 10 veces mayor que la K m la ecuación de


Michaelis Menten puede escribirse de una forma aproximada como
………….. y la velocidad de reacción resulta …………… de la concentración
de sustrato. Por tanto puede decidirse que la reacción es de orden
cinético ………….. respecto a la concentración de sustrato.

3) En la tabla siguiente se indican las velocidades de una reacción enzimática a


distintas concentraciones de substrato; (a) en ausencia de inhibidor, y (b) y
(c) en presencia de una cantidad constante de dos tipos de inhibidor
determinar gráficamente para cada caso el tipo de inhibición enzimática
observada.

[S ] mM (a) (b) (c)


Vseg −1 Vseg −1 Vseg −1
1 2.5 1.17 0.77
2 4 2.10 1.25
5 6.3 4.00 2.00
10 7.6 5.7 2.50
20 9 7.2 2.86

4) Supóngase que la glucosa que puede convertirse en otra sustancia mediante


cierto enzima. Utilizando los datos de a siguiente tabla determinar
gráficamente los valores de los parámetros cinéticos
Vmax y K m para la
hipotética reacción.

a) Representando gráficamente los valores de velocidad frente a [S ]


b) Utilizando la representación de Lineweaver-Burk

[Glu cos a] V
M min −1
1.10-5 150
2.10-5 256
1.10-4 600
3.10-4 770
5.10-4 818