PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES DE PIELES DE RANAS.

JUAN PABLO ERAZO LONDOÑO.

Figura 1. Materiales usados durante toda la extracción. Dos embudos de separación de 1000ml,
tres balones de vidrio de fondo plano de 50, 250 y 500ml, dos vasos de precipitados de 50 y de
250ml, dos pipetas de 5 y de 10ml, una propipeta, dos frascos de 250 ml. Todo debe ser
adecuadamente lavado, almacenado y evitar su contaminación. Los embudos y los balones
deberán tener sus respectivas tapas.

OTROS MATERIALES.

- Tijeras con buen filo.

- Pinzas de punta plana.
- Mezcla sulfocrómica.
- Potasa alcohólica.
- Jabón neutro.
- Frasco lavador.
- Guantes de nitrilo.
- Papel kraft.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN TOMADO DE DALY ET AL 1994.

- Pesar la piel húmeda.

 - Cortar la piel (en trozos de aproximadamente 1 cm2 dependiendo de la piel usada) y
macerar tres veces cada vez con 20 veces el peso de la piel en metanol (o etanol).
- Diluir el extracto en el mismo volumen de agua destilada.
- Extraer el metanol o etanol, cada vez con 1 volumen de cloroformo.
- Concentrar el cloroformo a un volumen más pequeño (en rotaevaporador, este volumen
dependerá de cuanto se haya obtenido inicialmente) y restaurarlo al volumen original con
n-hexano.
- Extraer tres veces, cada vez con 0,5 volúmenes de HCl 0,1 N.
- Ajustar el pH a 9 con amonio acuoso a 1 N
- Extraer tres veces, cada vez con 0,5 volúmenes de cloroformo.
- Secar con Na2SO4.
- Evaporar y dejar secar a 30°C en vacío (en rotaevaporador).
- Disolver en metanol tal que 100µl de extracto equivalen a 100mg de piel húmeda original.
- NOTA: los volumenes en la extracción pueden variar según el caso. Puede ser 1 volumen,
medio volumen y cuarto de volumen.

DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN

Para una extracción con un trozo de piel de 3,4612 g

- Se peso la piel.
- Se corto en trozos de 1 cm2 y se macero tres veces cada vez con 20 veces de ETANOL el
peso de la piel (60ml). EN ESTE PASO SE AGREGO UNA MODIFICACION PARA EVITAR
TENER UN CONTENIDO DE 180ML Y AHORRAR REACTIVOS, SE HICIERON LAS
MACERACIONES SOLO CON 60ML DE ETANOL REPATIDOS EN 30, 20 Y 10ML
RESPECTIVAMENTE EN LAS MACERACIONES.
- Se obtuvo una solución alcohólica de 60ml que se introdujo en el embudo.
- Se adicionaron 60ml de agua destilada.
- Se obtuvo una mezcla acuosa-alcoholica de 120ml.
- se adicionó el mismo volumen de cloroformo (120ml), se agitó fuertemente cinco veces
por 30 segundos cada vez y se dejó reposar 24 horas para hacer la primera extracción del
primer ciclo.
- Siempre se rescata la parte de debajo de la separación.
- Para la segunda extracción del ciclo 1 se adicionaron 80ml de cloroformo (80 con el fin de
ahorrar reactivos. Deberían ser 120) y se hizo la misma agitación.
- Para realizar la tercera extracción del ciclo 1 se adicionaron 40ml y el procedimiento fue el
mismo (nuevamente se modificó el volumen para ahorrar reactivo).
- LOS VOLUMENES PARA REALIZAR LAS EXTRACCIONES SE MODIFICARON EN CADA VEZ DE
CADA CICLO CON EL FIN DE AHORRAR LOS REACTIVOS PERO SE ACLARA QUE NO
DEBERIA SER ASI.
- Se obtuvo un extracto de cloroformo de 240ml.
 - En el rotaevaporador se concentró a un volumen de 5ml.
- Se restauró al volumen original con n-hexano (se adicionaron 120ml pero debieron ser
115ml)
- A esta mezcla de extracto-hexano se le hace el segundo ciclo de tres extracciones con HCl
0,1 N. se realizaría con 0,5 volumenes del contenido original pero se procedio de la misma
manera que el ciclo uno en cuanto a la repartición de los volumenes del HCl y las
agitaciones.
- extracción 1: 60ml, extracción 2: 40ml y extracción 3: 20ml
- SE ACLARA QUE LAS TRES VECES DEBIERON SER CON 60ML.
- Para ajustar el pH se usa amonio acuoso a 1 N pero en esta ocasión se usó a 2 N para que
el volumen de la mezcla no fuera demasiado al final.
- ATENCION: NO USAR CINTA DE pH EN LO POSIBLE USAR UN pHMETRO en la observación
de la variación del pH.
- Se obtuvo una solución de 120ml de HCl + lo que se fue en amonio (la recomendación de
usar el pHmetro es por lo sucedido con las cintas, debido a ellas al final se obtuvo una
solución de mas de 1000ml).
- A esta mezcla de pH 9 se le realiza el tercer ciclo de extracciones con cloroformo usando la
misma metodología del ahorro del reactivo y de la agitación. Estas extracciones debían
hacerse cada una con 0,5 volumenes del contenido original (60ml) y se hicieron asi.
- extracción 1: 60ml, extracción 2: 40ml y extracción 3: 20ml
- esta última extracción con cloroformo (120ml) fue filtrada en un vaso de precipitados
tapado con un papel filtro el cual contenia sulfato de sodio anhidro.
- El resultado de este filtrado fue rotaevaporado completamente.
- Finalmente se adicionó al balón que salió del rotaevaporador 3000µl de metanol para
realizar la disolución formandosen cristales en el fondo del balón (no rotar con demasiada
velocidad).
Adicione 3000 µl de metanol por que fueron 3000ml de piel húmeda que se maceraron y
según la correspondencia (100 µl de extracto equivalen a 100ml de piel húmeda) debía
ser asi.

PARA UN MUESTREO EXITOSO LIBRE DE CONTAMINACION.

Valga aclarar que todo los mateirales deben de estar debidamente lavados y estrilizados según el
protocolo de limpieza para material de vidrio especificado mas adelante.

- Para las metodologías actuales de extracción química de pieles no es mas necesario que la
piel de una sola rana.
- El espécimen debe ser capturado en campo con un método que evite que sea tocado con
las manos desnudas y evitando todo tipo de fuentes de contaminación.
- El almacenamiento del espécimen debe realizarse en un recipiente libre de
contaminaciones estéril.
 - Si es una especie invasora que deba sacrificarse inmediatamente en el campo es mejor
realizar la extracción de la piel en el punto de muestreo teniendo las siguientes
recomendaciones.
- Retirar la piel usando guantes esteriles, tijeras debidamente esterilizadas, una superficie
esterilizada (llevar un plástico esterilizado o un papel que sea esteril) y almacenar la piel
en un frasco ambar muy limpio en metanol.
- Luego proceder con la extracción en el laboratorio.
- EVITAR TODA FUENTE DE CONTAMINACION.

LOS SIGUIENTES SON LOS PASOS PARA EL LAVADO DEL MATERIAL DE VIDRIO SI SE DESCONOCE
EL USO QUE FUE APLICADO SOBRE ELLOS.

- Lavar con agua y jabon corriente.

- enjuagar con jabon neutro.
- Lavar con agua destilada.
- Lavar con potasa alcohólica.
- Lavar con agua destilada.
- Lavar con mezcla sulfocrómica (dejar 24 horas).
- Lavar muy bien con agua destilada (10 veces)
- Poner a secar en un horno.

PARA MATERIAL QUE NO SE PUEDA METER EN LA SULFOCROMICA.

Hacer el tratamiento con la potasa alcohólica y pasar a un horno seco los elementos envueltos en
papel aluminio a 250°C por 4 horas. NO AUTOCLAVE.