Tecnica de Cromatografia PDF

© Javier Señoráns
Tema 2.
La preparación de la muestra
F. Javier Señoráns Rodríguez
Sección Departamental de Ciencias de la Alimentación
M - 08 – despacho 502
E-mail: javier.senorans@uam.es
Página web: www.uam.es/javier.senorans
Asignatura de Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutrición Humana y Dietética
Tema 2. La preparación de la muestra

Aislamiento y concentración de compuestos en
alimentos.
Técnicas de muestreo de la fase vapor: el análisis del
espacio de cabeza (método estático y método dinámico).
Técnicas actuales de concentración del espacio de
cabeza.
La microextracción en fase sólida (SPME).
La extracción en fase sólida (SPE).
La extracción supercrítica analítica (SFE).
La extracción acelerada con disolventes (ASE).
La extracción asistida por microondas (MAE).
Aplicaciones al análisis del aroma de alimentos y al
análisis de residuos.
Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutrición Humana y Dietética 1
Nuevas técnicas de preparación de la muestra
La mayoría de las muestras de alimentos que se

analizan por métodos instrumentales de separación
son demasiado complejas, están demasiado diluidas
o son incompatibles con el sistema cromatográfico,
lo que impide su introducción directa
Consecuencia: se necesita preparar la muestra antes

de su introducción en el sistema,
mediante fraccionamiento, extracción
o pre-separación.
Nuevas técnicas de preparación de la muestra
CROMATOGRAFÍA DE GASES ALTA

CON COLUMNAS CAPILARES RESOLUCIÓN
PROBLEMA PREPARACIÓN
DE MUESTRA
MUESTRA GC
PREPARACIÓN
MUESTRA GC
DE MUESTRA

Necesidad de nuevas técnicas de preparación de

muestras de alimentos
• lentitud y laboriosidad
Problemas actuales de
• empleo de grandes cantidades
métodos oficiales y de disolventes tóxicos
tradicionales: • poca selectividad
• poco rendimiento
Métodos tradicionales de preparación de la muestra:

-más de 2/3 del tiempo del analista
-responsable de al menos 1/3 del error en el análisis
-enorme volumen de disolventes
Necesidad de nuevas técnicas de preparación de

muestras de alimentos
Creciente demanda de :
mayor productividad en los laboratorios

análisis más rápidos
métodos más automatizados
posibilidad de automatización
técnicas limpias y selectivas
Metas
mayor rapidez y eficacia
fiabilidad
Idealmente, además, baratas, sencillas, sin

disolventes tóxicos

Técnicas instrumentales de preparación de muestras

de alimentos
Posibilidades clásicas:
Cristalización
Destilación
Precipitación
Extracción con disolventes
LLE, Soxhlet, etc.
Otras:
Diálisis y microdiálisis
Filtración
Ultrafiltración
Separaciones con membranas

de alimentos
Técnicas basadas en la cromatografía:
Cromatografía en capa fina (TLC)

Cromatografía en columnas abiertas (flash)
LC prep. cromatografía preparativa
Acoplamiento LC-GC
SFC preparativa


de alimentos
Técnicas basadas en la extracción
Extracción Sólido-liquido
Extracción Líquido-líquido
Extracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)
SPE, SPME, etc.
Fundamentos de la Cromatografía en capa fina

(TLC, Thin Layer Chromatography)
Fundamento
La cromatografía en capa fina al igual que otras técnicas

cromatográficas se basa en la retención y elución debido
a la diferente interacción del analito entre una fase sólida
y otra líquida.
La placa se introduce en un recipiente que contiene la

fase móvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El
disolvente asciende por capilaridad y la separación se
basa en la diferente velocidad a la que los distintos
analitos presentes en la muestra ascienden por la placa.

Fundamentos de la Cromatografía en capa fina
Cálculo de los Factores de Retención (RF) DA

RF =
Para ello se emplea la siguiente formula DS
Frente del disolvente

Posición del analito
tras la cromatografía
origen
siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia

recorrida por el disolvente o frente del disolvente.
Cromatografía en columna
Fundamento
La cromatografía en columna al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la

retención y elución debido a la diferente interacción del analito entre una fase sólida que
rellena una columna abierta y otra líquida (normalmente un disolvente orgánico o una mezcla
de disolventes).

Esquema Tema 2. La preparación de la muestra
• Introducción a las técnicas de preparación de muestra

• Extracción sólido-líquido
• Extracción líquido-líquido
• Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna
Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase

Micro-Extraction)
• Extracción Asistida por Microondas (MAE, Microwave

Assisted Extraction)
• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated

Solvent Extraction)
Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)
Diferentes técnicas para problemas distintos
Aroma y compuestos volátiles Espacio de cabeza

de alimentos y bebidas cuyo
aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc SPME
Componentes naturales o Extracción en

contaminantes de alimentos
líquidos: fase sólida
zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Muestras sólidas de alimentos: MAE

Componentes mayoritarios y minoritarios ASE
de todo tipo de alimentos
(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
SFE
Residuos y contaminantes en alimentos

Determinación de compuestos
volátiles en muestras de
alimentos
Cromatografía de gases
Problemas:
• trazas
Técnicas de aislamiento y • aislamiento compuestos volátiles del
concentración de compuestos alimento o del producto a analizar
volátiles de la matriz
• se requieren grandes cantidades de
producto para obtener la adecuada
cantidad para análisis por CG o CG-EM
Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos

volátiles de la matriz
Nuevas técnicas basadas en el

análisis del espacio de cabeza
- se basan en la preconcentración, para

posterior análisis y determinación, de los
compuestos volátiles que se desprenden del
alimento sólido o líquido
Objetivos:
• extraer analitos de interés lo más concentrados posible

• elevada recuperación cuantitativa
• mínimas interferencias

Micro-extracción en fase sólida (SPME)
Principios de la Técnica
Se basa en la adsorción de los compuestos orgánicos del
alimento por una fase sólida inmovilizada sobre una fibra de
sílice fundida.
Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se

desorben térmicamente en el inyector de un cromatógrafo de
gases
La matriz puede ser aire, agua, muestras líquidas, etc.
Alternativamente, también se puede disolver el extracto en un

disolvente orgánico para analizarlo por HPLC.
Microextracción en fase sólida (SPME)
SPME es una nueva técnica de extracción para compuestos
orgánicos, que se basa en la adsorción de los analitos de la matriz
(aire, agua, muestras líquidas, etc.) por una fase sólida inmovilizada
sobre una fibra de sílice fundida.
Si se emplea un recubrimiento polimérico, la cantidad de analito

adsorbida por el recubrimiento en equilibrio está relacionada
directamente con la concentración en la muestra.

Esquema del sistema

para SPME y detalle de
la fibra adsorbente.
La fibra es de sílice fundida

recubierta de un polímero
adsorbente selectivo.

Principio Teórico
KfhVfVsCo
n=
KfhVf+Vs
n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento
Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra
K: coeficiente de reparto del analito entre el
recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]
Co: concentración inicial del analito en la muestra

En relación al reparto de los analitos.......
Principales variables que influyen en el proceso de reparto:
• constante de distribución
• temperatura de la muestra y tipo de calentamiento
25 °C
130 °C
200 °C
Ventajas y desventajas de la Microextracción en fase

sólida
Es una técnica rápida y relativamente sencilla
Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el

mercado que permiten cierta selectividad
Se puede acoplar fácilmente a otras técnicas de separación

(GC y HPLC)
No requiere ningún disolvente
SPME es una técnica económica (reutilizable)
Está limitada a muestras líquidas o compuestos volátiles

(espacio de cabeza)
No permite conservar el extracto para otros análisis

Aplicaciones:
• Detección de enranciamiento de aceites por SPME de
aldehídos y otros subproductos de la oxidación
• Análisis de aromas naturales y extraños de alimentos
• Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras

bebidas
• Diferenciación de tipos de café, origen, tueste, etc.
• Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas

alcohólicas
• Caracterización y control de calidad de alimentos de alto

valor: jamones, trufas, patés, etc.
Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME)
Ejemplo de análisis de compuestos volátiles en un zumo de fruta

sin usar ningún disolvente tóxico




SFE
Técnicas de Purga y Trampa y Desorción Térmica
Procedimiento
• arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas
inerte (He o N2)
• captura o adsorción de los compuestos volátiles en una trampa
adsorbente
• desorción, mediante calentamiento, de los compuestos
retenidos

Técnica de Purga y Trampa
Arrastre y captura:
• Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra

• Temperatura ambiente
2 5
P&T MS GC
Técnica de Purga y Trampa
Ventajas y desventajas P&T:
Realiza, de forma automática, las etapas de arrastre, captura y

desorción
Elevada reproducibilidad
Evita manipulación de muestra
No requiere ningún disolvente
Elevada sensibilidad
No existen interferencias de compuestos no volátiles de la matriz
Optimización de todas las variables en conjunto




SFE
Esquema Tema 2. AISA


Micro-Extraction)


Solvent Extraction)


SFE


Extracción sólido-líquido: Extracción de alimentos

sólidos con disolventes
Método tradicional de extracción

Disolvente
+ extracto
disolvente orgánico (líquido) caliente,
en ebullición, en contacto con
muestra de alimento (sólido)
(ej. Soxhlet)
Temperatura máxima del Disolvente=

= Punto de ebullición (60-80ºC)
Disolvente

Necesidad de nuevas técnicas de extracción de

alimentos sólidos
Métodos tradicionales de extracción sólido-líquido :

líquido en ebullición en contacto con muestra sólida
difusividad del disolvente lenta

intercambio de energía poco eficaz
procesos estáticos o semi-estáticos
Extracción lenta y poco eficaz
disolventes convencionales
calor como única energía
Extracción lenta y poco selectiva

de alimentos
Pasos previos:
Homogeneizar la muestra
Reducir su tamaño
Evitar cambios en la muestra:
Inactivación enzimática
Protección de lípidos
Inhibición del crecimiento microbiano
Cambios físicos, agua, estructura, etc.
Congelación, secado, tratamiento térmico, conservantes

químicos (o una combinación de varios de ellos)

Extractor Soxhlet
• Método tradicional, muy aceptado y

extendido
• Lento
Esquema Tema 2. La preparación de la muestra


Micro-Extraction)


Solvent Extraction)

Técnicas instrumentales de extracción de muestras

sólidas de alimentos
Principios comunes a las nuevas técnicas de
extracción:
Extracción asistida por microondas (MAE).
Extracción acelerada con disolventes (ASE).
Extracción supercrítica analítica (SFE).
Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperatura

y controlando la presión
Debido a los mayores coeficientes de difusión, las extracciones se

aceleran considerablemente
Técnicas avanzadas de preparación de muestras

de alimentos sólidos
Extracciones de sólidos
con mayor rapidez y eficacia
selectividad rendimiento
Líquidos a alta Tª
Fluidos
Supercríticos Energía Presión
localizada elevada
SFE MAE ASE

Principios de la Extracción Asistida por

Microondas (MAE)
Se extrae la muestra aplicando energía de microondas en un

disolvente adecuado.
Energía de microondas:
calienta selectivamente unas especies químicas frente a otras
produce extracciones rápidas y con cierta selectividad.
El calentamiento producido depende de la naturaleza química de la

matriz y del disolvente
Cuanto mayor es la constante dieléctrica, mayor es la absorción de

energía.
Extracción Asistida por Microondas (MAE)

Procedimiento habitual
Cuando el disolvente absorbe energía microondas:
La muestra se coloca en un recipiente cerrado

se calienta a temperaturas mayores que su punto de
ebullición durante un tiempo muy corto (aumenta la presión)
después se enfría y se despresuriza
se separa o filtra el extracto

Equipo necesario:
• Microondas
• Celdas apropiadas
Características de las celdas

no absorber microondas,
ser inertes,
fáciles de abrir y cerrar
reutilizables
resistentes a altas P y temperaturas
Esquema de una celda comercial

con control de presión y de
temperatura para MAE
Principales variables:
Relativas a la muestra
Disolvente:
composición y propiedades
constante dieléctrica
Potencia de irradiación
Caudal de disolvente (en procesos continuos)
Tiempo de irradiación y extracción

Ventajas
MAE es más rápida (30 seg.-10 min) y emplea menos
disolvente (1-15 mL) que la extracción líquida tradicional
La energía esta localizada y se aprovecha mejor (menor
consumo)
El tamaño de muestra puede ser muy variado
MAE es una técnica robusta y fácil de usar
Se pueden extraer varias muestras a la vez
No hace falta deshidratar o procesar la muestra

Desventajas
MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se

pueden utilizar
MAE plantea problemas de seguridad
El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la
extracción y necesita una posterior filtración o separación
MAE es difícil de automatizar o acoplar a técnicas de
análisis
Degradación de compuestos térmicamente lábiles
Poca selectividad en la extracción

Ejemplos de Aplicaciones:
Extracción de grasa de carne,
huevo y sólidos lácteos
Extracción de oleorresina de
pimentón
Extracción de monoterpenoles de
mostos para análisis por GC
Extracción de esencias de vainilla,

menta, ginseng, cítricos, etc.
Esquema de un extractor
asistido por microondas Extracción de contaminantes
(residuos de pesticidas, PAHs,
PCBs, etc.)
Ejemplo de Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos

Homogeneización de la muestra
La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado
Se añade el disolvente: éter de petróleo o hexano
Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos
El extracto se filtra a vacío para separar la muestra del

disolvente
Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en

rotavapor


Fluidos
localizada elevada
SFE MAE ASE
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
• nueva técnica de extracción
• disolventes habituales
• presiones y temperaturas elevadas
• extracciones rápidas y efectivas de
muestras sólidas
Temperaturas: 30 - 200 ºC
Presiones: 100 - 140 atm
Disolventes: orgánicos, agua, mezclas, etc.

Muestras: sólidas

• nueva técnica de extracción

• disolventes habituales
• presiones y temperaturas elevadas
• extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas
Efectos interesantes que se producen a temperaturas

elevadas:
• mejores solubilidades de los analitos en líquidos
• aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos
de la matriz
Procedimiento
• La muestra sólida se coloca en un recipiente que se sella
• Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor
que el punto de ebullición del disolvente, provocando un
gran aumento de la presión en la celda.
• Durante el tiempo de extracción parte del líquido es

liberado y recogido en un vial.
• Al final de la extracción, el extracto se expulsa de la celda
con nitrógeno y se transfiere automáticamente a un vial.


Principales variables:
• Relativas a la muestra
• Disolvente o mezcla de disolventes
• Tiempo de extracción
• Temperatura de extracción
• Número de ciclos
Celda de
Extracción
Válvula de
purga Válvula de Horno
presión
Bomba
Válvula Estática
Salida Vial de
Disolvente Nitrógeno aire Vial colector
desecho

Extracción de grasa de carne,
huevo y sólidos lácteos
Pesticidas en harinas, piensos,
etc.
Micotoxinas en cereales y frutos
secos
Imagen de un extractor Extracción de productos naturales

con disolventes
presurizados (ASE)
Extracción de contaminantes
(residuos de pesticidas, dioxinas,
PCBs, etc.)

de alimentos
Ventajas
ASETM es más rápida que los procedimientos de extracción
líquida tradicionales <15 min frente a 2-24 h
ASE emplea menos disolvente

<15 mL para 10 g de muestra vs. 50-500 mL
ASE es más eficaz independientemente de la matriz
ASE es automatizable y puede extraer muestras

secuencialmente
El desarrollo de métodos es mucho más sencillo


de alimentos
Desventajas
Las extracciones son más completas, pero menos

selectivas
ASE requiere el empleo de temperaturas más altas

que en SFE
El equipo tiene un precio elevado

Fluidos
localizada elevada
SFE MAE ASE

Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)
Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas
mayores que las de su punto crítico
extrae rápida y selectivamente algunos compuestos
Variando la presión (la densidad del fluido) se controla

la solubilidad de los analitos en dicho fluido.
¿Qué es un Fluido Supercrítico?
Diagrama de fases
Fluido
Supercrítico
Presión Líquido
Sólido
Punto
Crítico
Gas (Para CO2 es
31.3ºC y
72.9 atm)
Temperatura

Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)
El fluido supercrítico más utilizado es el dióxido de

carbono (CO2)
Propiedades del dióxido de carbono

• Moderadas presión (72.9 atm) y temperatura (31.3ºC)
críticas
• Gas a temperatura ambiente, no deja residuos
• No es tóxico ni inflamable
• Precio moderado y sin problemas de eliminación
• Baja polaridad, se pueden añadir modificadores en
pequeña proporción para extraer compuestos polares


flavor es importante:

SFE

Fundamentos de la Extracción Líquido-Líquido
Partición de los componentes

de una mezcla
entre dos líquidos inmiscibles
de diferente densidad
Extracción en fase sólida (SPE)
SPE es una técnica de extracción que se basa en la
retención sobre un adsorbente sólido de los compuestos
deseados disueltos en una muestra líquida.
La adición de un eluyente permite eliminar los componentes
de la matriz que interfieren, para después eluir y concentrar
los analitos de interés.
La extracción en fase sólida sustituye a la extracción
líquido-líquido clásica.

Procedimiento de la Extracción en Fase Sólida (SPE)
Muestra Acondicio- Adición de Lavado Elución del

namiento muestra analito
Extracción en Fase Sólida (SPE)
• Eliminación de pigmentos de
vegetales y hortalizas
• Retención de antocianinas y otras
interferencias en análisis de
pesticidas en vinos
• Vitaminas en zumos
• Residuos de antibióticos en leches

Extracción en Fase Sólida (SPE)
Imagen de un colector
múltiple para SPE con
aspiración a vacío.
Permite la extracción
simultánea de 20 tubos con
muestra.
Equipo automático para SPE con

microplacas de 96 / 384
Ventajas y desventajas de SPE
Es una técnica muy sencilla y rápida

Existen numerosos adsorbentes disponibles en el
mercado para SPE
Se puede acoplar a otras técnicas de separación
Emplea poco o ningún disolvente
SPE es muy efectiva para extraer compuestos
polares o apolares de muestras líquidas
Se puede automatizar
Está limitada a muestras líquidas

Sumario de propiedades de nuevas técnicas de

extracción
Eficaces y selectivas
Rápidas: tiempos de extracción de 1 - 30 minutos
Posibilidad de automatización
Ninguna técnica es ideal para todos los analitos
de todas las matrices
Las nuevas técnicas son cada vez más comunes y
van a continuar su expansión debido a sus
numerosas ventajas
Bibliografía recomendada
• Libros sobre Análisis Instrumental incluyendo

preparación de muestra:
Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Análisis Instrumental.
Prentice Hall-Pearson. Madrid.
Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Análisis de los

Alimentos. Fundamentos, Métodos, Aplicaciones. Acribia.
Zaragoza.
Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de Análisis

Instrumental. [Quinta Edición] McGraw-Hill. Madrid.


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Asignatura de Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Tema 2. La preparación de la muestra

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Nuevas técnicas de preparación de la muestra

La mayoría de las muestras de alimentos que se

Consecuencia: se necesita preparar la muestra antes

Nuevas técnicas de preparación de la muestra

CROMATOGRAFÍA DE GASES ALTA

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Necesidad de nuevas técnicas de preparación de

Métodos tradicionales de preparación de la muestra:

Necesidad de nuevas técnicas de preparación de

mayor productividad en los laboratorios

Idealmente, además, baratas, sencillas, sin

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Técnicas instrumentales de preparación de muestras

Técnicas instrumentales de preparación de muestras

Técnicas basadas en la cromatografía:

Cromatografía en capa fina (TLC)

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Técnicas instrumentales de preparación de muestras

Técnicas basadas en la extracción

Fundamentos de la Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina al igual que otras técnicas

La placa se introduce en un recipiente que contiene la

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Fundamentos de la Cromatografía en capa fina

Cálculo de los Factores de Retención (RF) DA

Frente del disolvente

siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia

La cromatografía en columna al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Esquema Tema 2. La preparación de la muestra

• Introducción a las técnicas de preparación de muestra

Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase

• Extracción Asistida por Microondas (MAE, Microwave

• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, Accelerated

Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)

Diferentes técnicas para problemas distintos

Aroma y compuestos volátiles Espacio de cabeza

Componentes naturales o Extracción en

Muestras sólidas de alimentos: MAE

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos

Nuevas técnicas basadas en el

- se basan en la preconcentración, para

• extraer analitos de interés lo más concentrados posible

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Micro-extracción en fase sólida (SPME)

Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se

La matriz puede ser aire, agua, muestras líquidas, etc.

Alternativamente, también se puede disolver el extracto en un

Microextracción en fase sólida (SPME)

Si se emplea un recubrimiento polimérico, la cantidad de analito

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Microextracción en fase sólida (SPME)

Esquema del sistema

La fibra es de sílice fundida

Microextracción en fase sólida (SPME)

Co: concentración inicial del analito en la muestra

Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos