I-CONGRESO BINACIONAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA (Argentina-Chile) - V-ENCUENTRO

DE JÓVENES INVESTIGADORES SAN JUAN 2017

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE AISLAMIENTOS DE UNA FERMENTACION

ANAEROBIA DE ALPERUJO

Línea temática: Bioprocesos

Gil, Rocio Mariel

Rodríguez, Laura Ayelen

Universidad Nacional de San Juan, Facultad de Ingeniería, Instituto de Biotecnología.

Palabras Claves: Caracterización, Biogás, Alperujo

1. Introducción

La industria del aceite de oliva genera un residuo semisólido altamente contaminante llamado “alperujo”. En
San Juan se generan alrededor de 60.000 toneladas /año de este residuo, y en la actualidad es dificultoso su
tratamiento y disposición final. La digestión anaerobia es un tratamiento biológico que
permite la estabilización de desechos orgánicos y la producción de biocombustibles
gaseosos, como el metano. Se propuso utilizar este residuo para la generación de biogás, a
concentraciones de alperujo altas, mezclándolo con estiércol de caballo. De este preparado se obtuvieron 13
aislamientos bacterianos, de los cuales se seleccionaron aquellos capaces de producir biogás a altas
concentraciones de alperujo. Para avanzar en el conocimiento y diseño del bioproceso, resulta necesario
caracterizar morfológica y fisiológicamente aislamientos productores de biogás.

2. Objetivo general

Caracterizar la microbiota bacteriana de los aislados de estiércol y alperujo que presentaron mayor
rendimiento en la producción de biogás, en preparados con elevadas concentraciones de alperujo.

3. Materiales y métodos

3.1 Identificación de géneros y especies bacterianas

3.1.1 Lámina y tinción

Con el fin de reconocer la morfología y distinguir los distintos aislamientos, se realizó un montaje en lámina
con tinción convencional. Los aislamientos se identificaron como PL14, PL15, PL13 PL11, PL8, PL3.

3.1.2 Prueba Bioquímicas

Los microorganismos han de nutrirse a expensa del medio en que se encuentren. En el interior de éstos
ocurren una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales reciben el
nombre de metabolismo. En estas reacciones se basan las pruebas bioquímicas. A partir de estas
características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación de microorganismos y
productos obtenidos de la relación microorganismo-medio.

3.1.3 Medio TIS

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El medio TIS está constituido por tres azucares: lactosa, glucosa y sacarosa, de las cuales la lactosa y la
sacarosa se fermentan en medio aerobio y la glucosa en medio anaerobio.
Este es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de
H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias. El agar se prepara en forma de pico de flauta.
Esto determina que existan 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico)
expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. La porción inclinada del tubo que está expuesta al oxígeno atmosférico tiende a
tornarse alcalina (roja por el rojo fenol) por la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo, donde
no hay oxígeno, la degradación proteica es mínima y se pueden detectar pequeñas cantidades de ácido por la
aparición de un color amarillo (indicador: rojo fenol). En ausencia de fermentación de carbohidratos, no se
formarán ácidos y por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo. Esto se da en
organismos no fermentadores. El medio está diseñado de tal forma que la glucosa se encuentra en una
proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TIS es inoculado con una bacteria fermentadora
de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación a partir de la
glucosa será baja porque la concentración de glucosa es baja. Al principio se producirá viraje del indicador al
amarillo en tubo, pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la degradación aerobia
de las peptonas antes descripta.
Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares es 10
veces mayor, se producirá mayor cantidad de ácido que no puede ser revirado por la producción de aminas en
la superficie por metabolismo aerobio. La producción de H 2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por
precipitar el Fe +2 del sulfato ferroso. Como esta reacción se da sólo en medio ácido, un ennegrecimiento del
fondo del tubo se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la
producción de gas, como burbujas en el fondo del tubo.

3.1.4 Medio Citrato

Medio Simmons Citrato Agar. La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la
identificación de enterobacterias. La utilización de éste se detecta mediante el crecimiento y la alcalinización
del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

3.1.5 Medio MIO

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina

decarboxilasa y producción de indol. Es un medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la
presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de
triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el
hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina
decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y
en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
 La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá
de la línea de inoculación.
 La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación
de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH
púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la
actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Esto alcaliniza
el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
 El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias
que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de
indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la
identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba, está basada en la formación de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este
es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser
rico en triptófano. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s,

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 indica un resultado positivo. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa,
pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

3.1.6 Medio LIA-Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp, basado en la
decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. En el medio de cultivo, la
peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato
de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la
producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo
a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se
produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La
decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, siendo necesario que la glucosa sea previamente
fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se
observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación
de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,
desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia
del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

3.1.7 Medio Christensen (Urea Agar Base).

Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.

Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp, otras enterobacterias y
estafilococos. En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono.
Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la
fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos
organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

4. Resultados

Los seis aislamientos presentaron una tinción característica de Gram (-). Las células exhibieron
morfología de bacilos rectos (PL3, PL8, PL13). La morfología de las células en PL15 son bacilos largos
sigmoides. Mientas que las células de los preparados de PL11 y PL14 son cocos (Fig.1).

Fig1. Observación microscópica de las células de los distintos aislamientos, 100X.

Test TIS

En la prueba TIS al inocular el microorganismo (PL8) se observó una

coloración café-amarillo en el pico de flauta lo cual indica la producción de
ácido por la fermentación de los tres azucares, un color negro en el medio
demuestra la formación de H2S, característico de Pseudomona. Además se

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observó una ruptura del medio lo que indica el desprendimiento de gas (CO 2 y H2). La misma coloración se
observa en el medio inoculado con PL13 y PL15, pero sin formación de gas. La coloración de pico rojo y
fondo rojo sin presencia de sulfuro demuestra que no hay fermentación de azúcares, característica de bacterias
no fermentadoras (PL11) y en menor medida, color menos intenso en el tubo inoculado con PL3. El medio
inoculado con PL14 ha fermentado Glucosa y lactosa y/o sacarosa, sin producción de sulfuro, característico
de Escherichia coli.

Test Citrato

El medio Simmons citrato no reveló cambio de color, de verde a azul en el pico

de flauta y verde en la profundidad, por lo tanto no hubo proliferación de
microorganismos, exponiendo un resultado negativo. Resultados Negativos son
característicos de microorganismos como Shigella, Escherichia, S. paratyphi.

Test MIO

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen

movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los
bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles. Entre las
enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de
las restantes que suelen ser movilidad (+). Todas presentaron movilidad, ya que
se difundieron a través del canal.

Test LIA

Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un

aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina, con la consiguiente
alcalinidad. Cuando todo el medio se torna violeta, se habla de una
descarboxilacion, dando productos alcalinos, ejemplo de esto es la PL11 y
PL3. Cuando la descarboxilacion es negativa parte del medio queda color
amarillo producto de la acidificación, esto sucedió en PL8, PL13, PL15.
La coloración rojiza del medio inoculado con PL14 significa una
desanimación oxidativa. Las manchas de color negro en el medio son
resultado de la producción de sulfuro.

Test Urea

La urea es degradada por aquellos microorganismos capaces de producir

el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que varia el color
del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad
ureasa, caso de esto es PL14,y PL13, PL8 en menor grado, la coloración
se percibió después de las 48hr. La bacteria Proteus vuelve alcalino el
medio poco después de la inoculación y sus resultados son positivos en
las primeras 2 a 6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella
pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de

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incubación. Un negativo lo reportan las especies Shigella, Salmonella, Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter, Serratia, Providencia.

5. Conclusión

Muchas de las pruebas realizadas resultaron consecuentes con los géneros: Klebsiella, Shigella, Escherichia,
Enterobacter. Si bien estas pruebas metabólicas nos indican los posibles géneros intervinientes, no son
concluyentes. Debido a los resultados encontrados resulta necesario incorporar medios selectivos para cada
género y técnicas moleculares de identificación.

Referencias

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