EVALUACIÓN DE EXTRACTOS DE Gracilaria blodgettii PARA LA INHIBICIÓN DE

QUÓRUM SENSING (QS) Y LA FORMACIÓN DE BIO-PELÍCULAS EN Escherichia

coli ENTEROTOXIGÉNICA (ETEC) SEROTIPO O: H CAUSANTE DE LA
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA)

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de las especies de macroalgas rojas

De acuerdo con estudios realizados por Saeki (1994), Manefield et al (2001), Ofek et al (2003),
Defoirdt et al (2011), Salta et al (2013), y Jha et al (2013), entre otros, las algas rojas producen
diferentes compuestos como carbohidratos (galactofuranosa, ácido glucorónico), furanonas
halogenadas, polisacáridos sulfatados, etc., con actividad disruptora del quórum sensing (anti-QS)
y, o de la formación de bio-películas (anti-biofilm) en bacterias gram negativas. Algunas especies del
género Gracilaria producen compuestos que inhiben la formación de biopelículas (Rajan et al.,
2016). Por otro lado, en el Caribe colombiano, en la zona costera de Santa Marta, la diversidad y
abundancia de algas rojas es elevada (Díaz-Pulido y Díaz-Ruíz, 2003), siendo Gracilaria blodgettii una
de las más abundantes. Con base en esta información, se seleccionó esta especie de alga roja para
los análisis de disrupción de QS y actividad anti-biofilm en bacterias gram negativas y en E. coli ETEC
serotipo O: H

Preparación de los extractos del alga

Los tallos algales secos de la especie Gracilaria blodgettii serán molidos en mortero hasta obtener
un polvo fino antes de la extracción con el solvente orgánico. Se tomarán 20 g de cada macerado y
se mezclarán en una proporción 1g/10ml de alcohol y metanol en erlenmeyers de 250 ml. Luego,
las mezclas se agitarán durante 24 h y se filtrarán dos veces en papel filtro whatman noº 1, y serán
concentrados usando vaporador rotatorio a baja temperatura (35 ºC) para evitar la evaporación de
compuestos volátiles. Los extractos concentrados se almacenarán a – 20 ºC para posteriores análisis
(Genovese et al., 2009; Jha et al., 2013).

Bioensayo de inhibición de QS
En Chromobacterium violaceum, la producción del pigmento violaceina (de color violeta) está
regulado positivamente por el sistema de QS CviI/R de N-acilhomoserina lactona (AHL) (MacClean
et al., 1997; Devescovi et al., 2017). Los extractos del alga roja se probarán para la inhibición de QS
utilizando a C. violaceum CV026 como la cepa informadora (Tan et al., 2012). Se inocularán 500 uL
de cultivo fresco de C. violaceum CV026 en 20 ml de caldo nutritivo y se incubarán a 30 °C con
agitación continua (170 rpm durante 2 – 3 h) hasta que la densidad óptica (OD) a 600 nm alcance
0.7. Luego, el medio agar nutritivo-suave (0.8 % agar nutritivo + 150 ml) se mantendrá a 45 ºC, y se
mezclará con 10 ml del cultivo (OD600=0.7) de C. violaceum y 10 uL de hexanoil homoserina lactona
(Sigma-Aldrich) para servirse en placas de petri. Una vez solidificado el medio, se adicionarán, en la
parte superior del agar, 5 uL de cada extracto. Se incubará overnight a 30 ºC y se determinarán las
zonas en donde no se produjo el pigmento violeta. Se usará cinnamaldehído como control positivo
y se determinará la concentración del extracto con máxima inhibición. Como control negativo se
usará 5 uL de metanol/etanol, y los ensayos se realizarán por triplicado (Jha et al., 2013).

ENSAYO DE ADHESIÓN

Los serotipos O: H de E. coli enterotoxigénica son los patotipos más comunes en casos clínicos en
Colombia (Guerra et al., 2014), por esta razón se escogerán dos cepas comunes aisladas de heces
humanas: E. coli O128: H45 y O157: H7 (ATCC 43888), marcadas con el gen gfp de la proteína verde
fluorescente (plásmido GFP introducido por CaCl2/choque térmico) (Ma et al., 2011). Las cepas
provenientes de stocks congelados (a – 80 ºC) serán reactivadas y crecidas overnight en caldo Luria-
Bertani (LB) suplementado con 100 ug/ml de ampicilina. Luego, se preparará una suspensión de
cada cepa en PBS (solución salina fosfatada pH 7.4) a una concentración de 1 x 106 bacterias/ml y
se mantendrán a – 4 ºC hasta su uso.

La evaluación de la adhesión de estas cepas se realizará en muestras de biopsias de mucosa del

duodeno de adultos voluntarios mantenidas en hielo en buffer N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-ácido-
etanosulfónico (HEPES). Para ello, se aislarán los enterocitos de cinco muestras de biopsias
utilizando el procedimiento de quelación con EDTA y se resuspendarán en 18 ml de medio Eagle
modificado (MEM) (Knutton et al., 1985). Para cada ensayo de adhesión, se mezclarán 5 ml de la
suspensión bacteriana de cada cepa y 3 ml de la suspensión de enterocitos (1 x 105 células/ml). La
mezcla será incubada a 37 ºC por 3 h con agitación continua. Luego, los enterocitos se sedimentarán
a 100 rpm por 1 minuto y las bacterias no adheridas se removerán descartando el sobrenadante y
lavando repetidamente. La adhesión de las bacterias a los bordes de los enterocitos se observará
mediante microscopia de fluorescencia y se contarán mediante microscopía de contraste de fase o
campo oscuro. Para esto, se examinarán 100 enterocitos seleccionados aleatoriamente en
diferentes campos, y se determinará el porcentaje (%) bacterias adheridas a las microvellosidades
de los enterocitos (Talley et al., 2009).

Ensayo de inhibición de la adhesión en tejido

Se seleccionarán las líneas celulares de tejido Hep-2 (CCL-23) y Caco-2 (HTB37) y se cultivarán en
medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10 % y 20 % de suero fetal bovino
respectivamente. Para los ensayos de inhibición de la adhesión y formación de las bio-películas, las
monocapas sub-confluentes de células Hep-2 y Caco-2 fueron recolectadas con 0.25 % (v/v) de
tripsina en buffer FC (NaCl 0.14 M, KCl 5.0 mM, Tris-HCl 20.0 mM, Tris-base 5.0, EDTA 0.5 mM, pH
7.2) y se sembrarán en cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro dispuestos en placas de cultivo
de tejidos de 24 pocillos a ~ 5 x 104 células HEp- 2/pocillo y 3.6 x 105 células Caco-2/pocillo. Las placas
se incubarán a 37 ° C para su uso en experimentos al día siguiente. El medio de crecimiento se
reemplazará cada dos días hasta su uso en ensayos. Para la inhibición, del extracto será
adicionado a concentraciones finales de 0.1, 5, 10, 20, 50, 100 y 200 ppm. Como control
negativo, no se adicionará extracto. Luego de lavar las monocapas del cultivo tisular de 24 h
de crecimiento con PBS, se añadirá a cada pocillo 0.9 ml de la suspensión de cada cepa
bacteriana (1 x 106 bacterias/ml). Las placas de cultivo tisular se incubarán a 37 ºC por 30
minutos para observar adhesión inicial por formación de micro-colonias (Giron et al., 1993),
3 h para observar adherencia en los bordes de las microvellosidades y 24 h para observar la
formación de bio-películas (Valle et al., 2006). Luego de la incubación, los pocillos se
lavarán cinco veces con PBS para eliminar las bacterias no adheridas, y los cubreobjetos se
fijarán con metanol durante 10 minutos, y se dejarán secar para observarse por fluorescencia.
Luego, se contarán mediante microscopía de contraste de fase examinando 100 células
seleccionadas aleatoriamente en diferentes campos, y se determinará el porcentaje (%) de
bacterias adheridas a los bordes celulares, de micro-colonias por célula de tejido y la
cobertura total de la bio-película. Los experimentos se llevarán a cabo por triplicado para
cada tratamiento (extractos), concentración del extracto y se replicarán al menos tres veces
(Shoaf et al., 2006).

Análisis estadístico
Las diferencias entre las concentraciones del extracto serán determinadas por un modelo lineal de
la comparación por diferencia-significativa-menor de los promedios a una confianza del 95 % usando
R-Sofware versión 3.4.3 También, las diferencias entre los tratamientos y los controles se analizarán
mediante un ANOVA- a una vía. Las diferencias se considerarán estadísticamente significativas para
un valor p < 0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A continuación, se muestran los resultados esperados para cada uno de los procedimientos y
métodos establecidos para cumplir el objetivo general de evaluar el extracto de Gracilaria blodgettii
contra quórum sensing (QS) y la formación de bio-películas en Escherichia coli enterotoxigénica
serotipos O: H; y la discusión pertinente a la luz de dichos resultados esperados.

Actividad disruptora del QS de extracto de Gracilaria blodgettii

De acuerdo a los estudios realizados por Jha et al (2013), en donde evaluaron 30 especies de algas
marinas, entre ellas varias especies de algas rojas, se espera que los extractos metanólicos de G.
blodgettii y G. acerosa exhiban actividad inhibitoria del QS tras evitar la producción del pigmento
violeta violaceina en C. violaceum por la formación de zonas claras en donde no hay presencia del
pigmento (figura X).
Figura X. a) Z: Cinnamaldehído como control positivo de la disrupción de QS y M: metanol como control negativo. b)
Actividad anti-QS de extractos de algas rojas. En la parte central se observa la inhibición del crecimiento (GI), y en la parte
periférica se observa la inhibición del QS, indicando que no se produjo el pigmento violeta (zona clara). Tomado y
modificado de Jha et al (2013).

La producción de este pigmento está bajo la regulación positiva del operón Cvi conformado por los
genes regulatorios cviR, cviI, y los genes estructurales vioa, b, c, d y e, que participan en la biosíntesis
del pigmento (figura X). La proteína CviR se produce constitutivamente e interactúa de forma muy
afín con las moléculas señalizadoras N-decanoil-L-homoserina lactona (C-10-HSL) (figura X). Esta
unión CviR-HSL se da cuando las concentraciones de HSLs aumentan en el interior de la célula debido
al incremento de la densidad poblacional de la bacteria, así, el gen cviI, que está bajo el control
positivo de CviR-HSL, se expresa y actúa como una AHL Sintetasa que sintetiza más moléculas
señalizadoras HSLs, permitiendo la transcripción de los genes estructurales adyacentes que
intervienen en la síntesis de la violaceina, la cual a su vez está involucrada en la virulencia de C.
violaceum. Las moléculas HSLs actúan como señales que activan la expresión de estos genes, por
tanto, se dice que el operón está bajo detección por quórum o QS (Kothari et al., 2017).

Figura X. Esquema de la biosíntesis del pigmento violeta violaceina. El complejo CviR-AHL se une al promotor del operón
adyacente a vioa y promueve la expresión de los genes estructurales y la síntesis del pigmento. Tomado de Kothari et al
(2017).
La posible actividad del extracto del alga roja para inhibir el QS en bacterias gram-negativas como
C. violaceum está dada porque muchos metabolitos secundarios de estas algas tienen una
estructura análoga a la de las AHLs y por consiguiente, compiten por los sitios de unión con las
proteínas reguladoras (en este caso la proteína CviR). Entre más afín sea la molécula anti-QS con las
proteínas reguladoras, mayor va a ser la competencia por el sitio de unión. Así, cuándo estas
moléculas anti-QS interactúan con las proteínas reguladoras, evitan que las AHLs formen el
complejo activador, y sin este complejo, el promotor de los operones que regulan los genes, en su
mayoría involucrados en la virulencia de las bacterias gram-negativas, no pueden ser estimulados y
la ARN polimerasa no transcribe los genes del operón (Kho et al., 2013). Por ejemplo, se sabe que
las furanonas halogenadas y los polisacáridos sulfatados de algunas algas rojas como Delisea
pulchra, Gloiopeltis furcata y Gigartina teldi, entre otras, inhiben el QS mediante la unión covalente
a los sitios de unión de las proteínas R de los openores (ej. LuxR en el operón lux), lo cual, además
de evitar su interacción con las AHLs (Ofek et al., 2003; Defoirdt et al., 2011), promueve su
degradación proteolítica (Mannefield et al., 1999).

Actividad inhibitoria de la formación de bio-películas

Una vez observada la capacidad de adhesión de las cepas de E. coli eterotoxigénicas serotipos O128:
H45 y O157: H7, a las microvellosidades de los enterocitos de biopsias de mucosa del duodeno de
algún voluntario, y de acuerdo con los estudios de Knutton et al (1987); se espera que después de
30 minutos de incubación, las bacterias sean capaces de formar micro-colonias como mecanismo
de adhesión inicial, luego, a las 3 h de incubación, formen agregados en los bordes celulares y por
último, transcurridas las 24 h, formen bio-películas con una alta cobertura en las microvellosidades
de los enterocitos. Esto logrará observarse a través micrografías obtenidas por microscopia de
contraste de fases y microscopia de fluorescencia en objetivo de 100 y 1000X.

Además, se espera que la actividad inhibitoria sea mayor a medida que aumenta la concentración
del extracto, debido a que aumenta la concentración del compuesto con actividad inhibitoria de la
formación de bio-películas. Esta inhibición es posible gracias a la acción de diferentes mecanismos,
algunos relacionados con el QS mientras que otros se relacionan con el proceso de adhesión
(características físicas y biológicas de la superficie) de las células bacterianas a las superficies de las
células vivas.

El primer tipo de relación es el de interés para el presente estudio, pues se sabe que las cepas de E.
coli ETEC serotipos O: H exhiben diferentes mecanismos de adherencia y formación de bio-películas
dependientes de QS como lo son: a) la expresión vía QS de plásmidos con genes codificantes para
antígenos de colonización de superficie (CSs o colonization surface antigens), que son estructuras
pili y no-pili de superficie que permiten la colonización de las células del intestino. b) La síntesis de
ahesinas/invasinas no-fimbriales como la proteína Tia (25 kD) que interactúan con los proteo-
glicanos de la superficie de las células del hospedero y promueven la adherencia bacteriana y la
invasión en las células del epitelio intestinal (Fleckenstein et al., 1996). c) La expresión regulada vía
QS del gen tibA que codifica una proteína auto-transportadora glicosilada que medía la adhesión a
la superficie de las células epiteliales, la auto-agregación y la formación de la bio-película (Lindenthal
et al., 1999). Y finalmente, d) la presencia del locus etpBAC que codifica para tres proteínas: EtpA
(glico-proteína secretada), EtpB (un poro transportador) y EtpC (una glicosil-transferasa requerida
para glicosilar a EtpA). EtpA actúa como puente molecular entre la proteína FliC en el flagelo y las
estructuras en la superficie de las células del hospedero, y su expresión está regulada por QS (Guerra
et al., 2014).