Protocolo detección ciclo celular

1- Levantar células con tripsina

2- Lavar 2x con PBS frío
3- Contar
4- Necesitas 2,5e5 células por cada condición del experimento.
5- Preparar 0,2% Tween 20 en PBS.
6- Añadir 2,5e5 cls/tubo citometria. Centrifugar. Quitar SN. Resuspender cada muestra
en 100ul PBS-0,2%tween20. Añadir 20ul RNAsa (45Ku/ml)/muestra.
7- Tapar con parafilm y meter a la estufa 30 min a 37ºC.
8- Añadir 5ul de 7-AAD 1x/ml PBS (oscuridad!!). Añadir 1ml por muestra.
9- Incubar 10 min a Tº ambiente en oscuridad!!
10- Pasar por el citómetro (Calibur345).
a. Gráfico FSC-H vs SSC-H; FL3-W vs FL3-H; FL3-A vs count
b. El voltaje de FL3 en escala lineal.
c. Adquirir las muestras con flujo en LOW