La privación de arginina inhibe el efecto de Warburg y aumenta

la anaplerosis de glutamina y la biosíntesis de serina en cánceres

deficientes en ASS1

RESUMEN
El objetivo de los defectos en el metabolismo es una estrategia subutilizada para el tratamiento
del cáncer. La auxotrofia de la arginina que resulta del silenciamiento de la argininosuccinato
sintetasa 1 (ASS1) es una alteración metabólica común que se informa en una amplia gama de
cánceres agresivos. Para evaluar los efectos metabólicos que surgen de la inanición de arginina
aguda y crónica en líneas celulares deficientes en ASS1, se realizó un perfil de metabolitos.
Encontramos que la depleción de arginina inducida farmacológicamente causa una mayor
biosíntesis de serina, anaplerosis de glutamina, fosforilación oxidativa y disminución de la
glucólisis aeróbica, inhibiendo de manera efectiva el efecto de Warburg. La reducción de la
glucólisis en células que de otro modo dependería de la glucólisis aeróbica se correlaciona con
la expresión de PKM2 reducida y la fosforilación y la regulación positiva de PHGDH. Se
encontró que la privación concurrente de arginina y la inhibición de glutaminasa son letales
sintéticas a través de un espectro de líneas celulares tumorales deficientes en ASS1 y es
suficiente para causar la regresión tumoral in vivo en ratones. Estos resultados identifican dos
estrategias terapéuticas letales sintéticas que explotan las vulnerabilidades metabólicas de los
cánceres ASS1-negativos.
INTRODUCCIÓN
La reprogramación metabólica es un sello distintivo bien establecido del cáncer que aún no se
ha explotado por completo terapéuticamente (DeBerardinis et al., 2008; Hanahan y Weinberg,
2011). Las alteraciones metabólicas comunes en tumores malignos incluyen la pérdida de la
expresión de argininosuccinato sintetasa 1 (ASS1) y el fenotipo energético conocido como el
efecto Warburg (Dillon et al., 2004; Warburg, 1956). El efecto de Warburg se refiere a la
generación preferencial de ATP a través de la glucólisis aeróbica en oposición a la fosforilación
oxidativa mitocondrial (OxPhos) a pesar de los niveles adecuados de oxígeno (Warburg, 1956).
El efecto Warburg da como resultado una mayor generación de biomasa derivada de la glucosa
necesaria para la proliferación celular desenfrenada y el crecimiento tumoral (DeBerardinis et
al., 2008; Icard y Lincet, 2012; Lunt y Vander Heiden, 2011). Estudios recientes también han
demostrado que el efecto Warburg es importante para proporcionar células que proliferan
rápidamente con un aceptor de electrones en forma de piruvato, necesario en la biosíntesis
oxidativa del aspartato (Birsoy et al., 2015). El aspartato se utiliza para la biosíntesis de
proteínas, purinas y pirimidinas, y los niveles insuficientes de aspartato inhiben la proliferación
(Birsoy et al., 2015; Sullivan et al., 2015). Satisfacer las necesidades energéticas específicas de las
células cancerosas a menudo requiere una regulación diferencial de una o más enzimas
metabólicas. Las isozimas del músculo piruvato cinasa (PKM), especialmente la isoforma de
empalme embrionaria PKM2, son críticas para las células que se dividen rápidamente y se
expresan exclusivamente en células que experimentan altos niveles de proliferación, como las
células embrionarias y tumorales (Chaneton y Gottlieb, 2012). Aunque la isoforma empalmada
alternativamente PKM1 se expresa en células sanas, la formación del tumor coincide con
aumentos dramáticos en la expresión de PKM2 (Chen et al., 2010; Christofk y col., 2008;
Guminska et al., 1997; Hitosugi et al., 2009; Macintard y Rathmell, 2011). Además de resaltar
las consecuencias tumorigénicas de la expresión alterada de la isoforma PKM, se ha
demostrado que la expresión de PKM2 es suficiente, pero no necesaria, para la inducción del
efecto Warburg, mientras que la sobreexpresión de PKM1 da como resultado la inhibición del
crecimiento y la proliferación de células tumorales (Chen et al. , 2010; Gruning et al., 2011;
Icard y Lincet, 2012 €; Marín Herna'ndez et al., 2009). Se ha demostrado que PKM2 se degrada
a través de la acetilación y la posterior autofagia chaperonemediada en ciertos contextos
celulares, lo que provocó un enfoque terapéutico del metabolismo del cáncer mediante la
manipulación de la actividad PKM2 y los niveles de proteína (Cheong et al., 2012; Lv et al.,
2011; Macintyre y Rathmell, 2011). La fosforilación de PKM2 disminuye la actividad
enzimática, dando como resultado una menor tasa de conversión de fosfoenolpiruvato (PEP)
en piruvato y cinética glicolítica alterada (Christofk et al., 2008; Hitosugi et al., 2009). Un nivel
reducido de piruvato reduce el flujo de metabolitos glucolíticos en el ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA). Sin embargo, la generación de lactato o acetil coenzima A (CoA) del
piruvato depende en última instancia de la regulación de lactato deshidrogenasas (LDH) y
piruvato deshidrogenasas (PDH), respectivamente (Fan et al., 2011; Rardin et al., 2009). ) La
inhibición del paso terminal de la glucólisis por fosforilación de PKM2 conduce a la
acumulación de intermediarios glucolíticos que se derivan a la vía de la pentosa fosfato (PPP) y
otras rutas biosintéticas para facilitar la síntesis de ácidos nucleicos, aminoácidos, lípidos y
otras construcciones celulares bloques necesarios para el crecimiento y la división celular
(Gruning et al., 2011; Gumi € n ska et al., 1997; Hitosugi et al., 2009; Icard y Lincet, 2012;
Locasale et al., 2011; Macintyre y Rathmell, 2011). El aminoácido serina actúa como un
activador alostérico natural de PKM2 en un circuito de retroalimentación regulatorio
(Chaneton et al., 2012; Kung et al., 2012). PKM2 funciona como un reostato biosintético de
serina al aumentar la tasa de biosíntesis de serina cuando es enzimáticamente inactiva hasta que
los niveles de serina alcanzan un umbral mínimo y activan alostéricamente la actividad
enzimática de PKM2 (Ye et al., 2012). Este aumento en la actividad de PKM2 conduce a
concentraciones reducidas de metabolitos glucolíticos y disminuciones posteriores en el flujo
de carbono derivada de glucosa en biosíntesis de serina. Por lo tanto, PKM2 desempeña un
papel importante en el mantenimiento de los niveles de serina suficientes para el crecimiento y
la proliferación celular (Chaneton et al., 2012; Kung et al., 2012; Locasale et al., 2011; Ye et al.,
2012). Otra alteración metabólica común observada en muchos cánceres es el silenciamiento
del gen ASS1 que codifica la enzima liberadora en el ciclo de la urea, la vía metabólica
responsable del aclaramiento de los desechos nitrogenados y la biosíntesis de la arginina
(Delage et al., 2010). Debido a que ASS1 cataliza la formación de argininosuccinato a partir de
citrulina y aspartato, estudios recientes han encontrado que la pérdida de expresión de proteína
ASS1 da como resultado una mayor abundancia celular de aspartato y la posterior utilización
de aspartato en la biosíntesis de nucleótidos y proteínas (Rabinovich et al., 2015). Estudios
adicionales han demostrado que la pérdida de expresión de ASS1 es un biomarcador
pronóstico de supervivencia libre de metástasis reducida en una variedad de cánceres (Allen et
al., 2014; Changou et al., 2014; Kobayashi et al., 2010; Mok et al. , 2007; Nicholson et al., 2009;
Szlosarek et al., 2006). La pérdida de expresión de ASS1 conduce a la dependencia de la
arginina extracelular para el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celulares
continuados, conocida como auxotrofia de arginina. La explotación de esta auxotrofía a través
de la privación de arginina induce la autofagia para mantener la supervivencia celular (Bean et
al., 2016; Kim et al., 2009; Nicholson et al., 2009; Syed et al., 2013). Los estudios preliminares,
incluidos los ensayos clínicos, se han dirigido a la pérdida de ASS1 con la forma pegilada
arginina deiminasa (ADIPEG20), una enzima que degrada la arginina a citrulina, causando una
inhibición significativa del crecimiento tumoral. Estos estudios han investigado ciertos tipos de
sarcoma, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, leucemia, linfoma y cáncer
de páncreas (Bean et al., 2016; Delage et al., 2010, 2012; MirakiMoud et al., 2015). Se ha
demostrado que el tratamiento prolongado con ADI-PEG20 induce la reexpresión de ASS1 y
la resistencia posterior a la inanición de arginina (Feun et al., 2012; Shen et al., 2003). La
resistencia adquirida a ADI-PEG20 ha sido un obstáculo en la eficacia a largo plazo de esta
terapia dirigida por biomarcadores (Izzo et al., 2004; Ott et al., 2013). Presumimos que la
comprensión de la respuesta metabólica a la inanición de arginina permitiría la identificación de
vulnerabilidades emergentes que, cuando se dirigen, convierten un fenotipo de detención del
crecimiento en una letalidad sintética. Por lo tanto, realizamos espectrometría de masas de
electroforesis capilar (CE-MS) en extracciones de metabolitos de líneas celulares tratadas de
forma aguda y crónica con ADI-PEG20. El tratamiento causó alteraciones dramáticas en el
metabolismo celular, incluidos el metabolismo de la glucosa, la glutamina y la serina.
Identificamos que la privación de arginina desvía la glucosa hacia la ruta biosintética de la
serina y hace que las células deficientes en ASS1 sean más sensibles a la inhibición de la
biosíntesis de serina y las enzimas dependientes de folato, reforzando la importancia
previamente documentada de la biosíntesis de serina en el cáncer (Cantor y Sabatini, 2012;
Locasale et al., 2011; Mattaini et al., 2015). Finalmente, el tratamiento también provocó un
cambio de la dependencia de la glucólisis aeróbica (el efecto Warburg) a la anaplerosis de
glutamina y OxPhos, identificando así la inhibición del metabolismo de la glutamina como un
objetivo letal sintético en las células muertas de arginina. Tomados en conjunto, numerosas
alteraciones metabólicas inducidas por la inanición de arginina pueden explotarse
terapéuticamente para inducir letalidad sintética en cánceres deficientes en ASS1.
RESULTADOS
Determinación de los efectos de la privación de arginina aguda y crónica sobre el metabolismo
La respuesta inmediata a la inanición de arginina en tumores deficientes en ASS1 es la
inhibición de la proliferación celular y la inducción de la autofagia (Figuras S1A y S1B, 2016;
Delage et al., 2012). ; Kim et al., 2009; Syed et al., 2013). Durante el período de detención del
crecimiento, ASS1 se reexpresa de una manera dependiente de c-Myc, lo que permite a las
células escapar de los efectos de la privación de arginina, superar la autofagia y reanudar la
proliferación (Figura 1A; Figura S1A; Long et al. 2013; Tsai et al., 2012). Para identificar las
interacciones sintéticas letales con la inanición de arginina, determinamos las alteraciones
metabólicas que ocurren cuando las células se adaptan a la privación de arginina aguda y
crónica. Para modelar los efectos a largo plazo de la privación de arginina e identificar posibles
interacciones letales sintéticas, cultivamos continuamente tres líneas celulares que carecen de
expresión funcional de ASS1 en presencia de ADI-PEG20 durante al menos 3 meses. Esto
incluyó dos líneas celulares de leiomiosarcoma (SKLMS1 y SKUT1) y una línea celular de
melanoma (SKMEL2) (Figura 1A). Se incluyó una línea de melanoma para investigar si las
alteraciones metabólicas identificadas eran un fenómeno específico del sarcoma o una
característica general del metabolismo celular en las células cancerosas deficientes en ASS1. Las
líneas celulares tratadas con ADI-PEG20 a largo plazo (LTAT) son resistentes a los efectos
inhibidores del crecimiento de la privación de arginina debido a la reexpresión de ASS1 y
capacidades de biosíntesis de nuevo de arginina readquiridas (Figuras 1A y 1B). Aunque la
privación de arginina inducida por ADI-PEG20 dio como resultado la inhibición de la
proliferación celular en células silvestres (WT), las velocidades de proliferación de las líneas
celulares LTAT difirieron en comparación con sus líneas parentales pero no siguieron un
patrón constante (Figura 1B). Para investigar los cambios metabólicos resultantes de la
privación de arginina tanto a corto como a largo plazo, perfilamos el metaboloma de la línea
celular de tipo salvaje SKLMS1 con y sin tratamiento ADI-PEG20, así como la línea celular
SKLMS1 LTAT usando CE-MS. Perfilar los principales metabolitos del metabolismo de la
purina y el glutatión, la glucólisis, el TCA y el ciclo de la urea y otras vías (Tabla S1)
identificaron alteraciones metabólicas globales tras la privación de arginina y confirmaron el
agotamiento de la arginina intracelular y el aumento de citrulina esperado con el tratamiento
ADI-PEG20 ( Figura S2A). Un mapa de calor de abundancias relativas de metabolitos mostró
los tres perfiles metabólicos únicos de las células WT, WT + ADI-PEG20 y LTL SKLMS1 no
tratadas (Figura S2B). Debido a cambios metabólicos insignificantes entre las células SKLMS1
LTAT y SKLMS1 LTAT + ADI-PEG20 no tratadas, la línea SKLMS1 LTAT no tratada se
eliminó de estudios posteriores, y todas las muestras denominadas '' LTAT '' se llevaron a cabo
con tratamiento continuo con ADI-PEG20 (Figura S2B ) El análisis de componentes
principales (PCA) confirma los tres perfiles únicos de metabolitos identificados en el mapa de
calor (figura S2C). Estos resultados demuestran que tanto la privación de arginina aguda como
la crónica modifican significativamente el metabolismo celular de la línea celular SKLMS1. El
tratamiento de las células SKLMS1 con ADI-PEG20 alteró la glucólisis superior e inferior, la
glutamina y el metabolismo de la serina (Figura 1C). Además, la línea SKLMS1 LTAT
demostró una acumulación de piruvato y un agotamiento de la glutamina (Figura 1C).
Presumimos que estas alteraciones metabólicas son necesarias para la adaptación y eventual
escape al paro de crecimiento inducido por la inanición de arginina y, por lo tanto, pueden ser
objetivos clínicamente utilizables.
Pérdida de PKM2 y cambios en la biología de glucosa tras la privación de arginina
Debido a que PKM2 es una enzima reguladora importante en la glucólisis del cáncer, se
determinaron los cambios en los niveles totales de PKM2 y el estado de fosforilación en las
líneas celulares WT no tratadas, tratadas con ADI-PEG20 y LTAT. Se observó una
disminución sustancial en los niveles de PKM2 tras el tratamiento con ADI-PEG20 (Figura
2A). Los niveles de fosfo-PKM2 también disminuyeron con el tratamiento agudo de
ADI-PEG20, lo que demuestra que los niveles alterados de PKM2 y los cambios de fosfo-
drenina en la cinética enzimática ocurren con el tratamiento con ADI-PEG20. La relación de
fosfo-PKM2 a PKM2 con tratamiento agudo de ADI-PEG20 demuestra que tanto los niveles
de proteína como los estados de fosforilación se alteran simultáneamente (Figura 2A). La
proporción en las líneas celulares LTAT no sigue ningún patrón discernible (Figura 2A). El
nivel de PKM1 se mantuvo constante (Figura 2A). En conjunto, estos datos sugieren que las
alteraciones en la cinética de PKM2 pueden jugar un papel en los cambios en la glucólisis
observados en la inanición de arginina. A continuación, tratamos de determinar si la adaptación
a la inanición de arginina alteró la dependencia de glucosa celular. Por lo tanto, las líneas
celulares WT y LTAT se cultivaron en medio con bajo contenido de glucosa (Figura 2B).
Cuando se normalizó la velocidad de proliferación de muestras cultivadas en medio normal, no
hubo diferencias significativas en la velocidad de proliferación de las muestras WT y LTAT en
concentraciones bajas de glucosa (Figura 2B). Para determinar más cambios en la biología de la
glucosa tras la privación de arginina, se midió la captación de glucosa extracelular en líneas
celulares tratadas con ADI-PEG20 así como líneas celulares LTAT y se demostró menor
captación de glucosa tras privación de arginina a corto y largo plazo (Figura 2C). Tomados en
conjunto, esto sugiere que la biología subyacente de la glucosa difiere entre las líneas celulares
WT y LTAT. Por lo tanto, examinamos las mediciones de ATP a partir de los datos de CE-MS
y encontramos una disminución aguda y un aumento a largo plazo en los niveles de ATP en las
líneas celulares tratadas con ADI-PEG20 a corto plazo y LTAT, respectivamente (Figura S3A).
Por lo tanto, tratamos de determinar si la privación de arginina alteró la dependencia celular de
la generación mitocondrial de ATP a través de OxPhos. Para probar la dependencia de
OxPhos de cada línea celular, las muestras se trataron con oligomicina, un inhibidor del
complejo V en la cadena de transporte de electrones. Las líneas LTAT fueron
significativamente más sensibles a la muerte celular por la oligomicina, lo que indica una mayor
dependencia de la generación mitocondrial de OxPhos ATP después del tratamiento a largo
plazo con ADI-PEG20 (Figura 2D). Aunque algunas de las líneas celulares de tipo salvaje
experimentaron una menor inhibición del crecimiento en presencia de oligomicina (datos no
mostrados), las líneas celulares LTAT mostraron invariablemente niveles más altos de muerte
celular. Las líneas celulares de tipo salvaje, por lo tanto, parecen seguir más de cerca el fenotipo
descrito como el efecto Warburg, mediante el cual las células tumorales fermentan
preferentemente la glucosa en lactato, independientemente de la abundancia de oxígeno
disponible para la oxidación de la glucosa. Las líneas celulares LTAT no siguieron la definición
clásica del efecto Warburg tan estrechamente como sus respectivas líneas celulares WT, como
se ilustra por la mayor sensibilidad a la muerte celular por la disrupción de OxPhos
mitocondrial (Figura 2D). Tomados en conjunto, los datos indican que las líneas celulares
LTAT se adaptan al tratamiento a largo plazo con ADI-PEG20 por alteraciones en el
metabolismo de glucosa y adicionalmente sugieren que la respuesta a la inanición de arginina
en líneas celulares con deficiencia de ASS1 es una mayor dependencia de OxPhos sobre
aeróbica glucólisis.
El rastreo de glucosa U13C muestra la biosíntesis de serina dependiente de glucosa no regulada
A continuación, tratamos de identificar los cambios en la utilización de la glucosa en el
tratamiento a corto y largo plazo con ADI-PEG20 utilizando los trazados de glucosa U13C y
la posterior espectrometría de masas. Se determinó la abundancia celular de 54 metabolitos así
como también todos los isótopos 13C posibles después del tratamiento con ADIPEG20 a
corto y largo plazo. células tratadas con ADI-PEG20 mostraron una marcada disminución en
los metabolitos marcados con 13C en el PPP y aguas abajo ATP / ADP / AMP, lactato, así
como intermedios del ciclo del TCA (6-fosfogluconolactona [6PG] y citrato, respectivamente,
en la Figura 3A y ATP / ADP / AMP en la figura S3B). La disminución del lactato marcado
con 13C tras el tratamiento con ADI-PEG20 indica un alejamiento de la glucólisis aeróbica y
es probable que se deba a las disminuciones concomitantes observadas tanto en los niveles de
lactato deshidrogenasa A (LDHA) como en la fosforilación activada de Tyr10 (Figura 2A; Fan
et al. ., 2011). La disminución del marcaje de carbono de los metabolitos de lactato y PPP
después de la privación de arginina es consistente con la inhibición del efecto de Warburg. El
análisis de inmunotransferencia muestra una disminución significativa de la subunidad E1a de
piruvato deshidrogenasa después de la privación de arginina, así como un aumento simultáneo
en la fosforilación inactivante de Ser300 en E1a (Figura 2A; Rardin et al., 2009). Estas
alteraciones disminuirían la contribución de los carbones derivados de glucosa a los
intermediarios del ciclo acetil-CoA y TCA y aumentarían la necesidad de anaplerosis del ciclo
de TCA a través de otras fuentes de carbono. Tras el tratamiento con ADI-PEG20, los átomos
de carbono derivados de la glucosa se derivan a la ruta de biosíntesis de la serina, como se
demostró mediante el trazado de glucosa en U13C (Figura 3A). La inmunotransferencia para la
fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), la primera y la enzima limitante de la velocidad en la
biosíntesis de serina, mostró una regulación al alza significativa en la privación de arginina
aguda, con niveles estables o aumentos adicionales en las líneas celulares LTAT (Figura 2A). Se
descubrió que la inhibición directa de PHGDH con el inhibidor de molécula pequeña
CBR-5884 causa niveles significativamente mayores de muerte celular cuando se combina con
el tratamiento con ADIPEG20 (Figura 3B; Mullarky et al., 2016). Aunque el marcaje 13C de
serina a partir de glucosa en líneas celulares LTAT volvió a niveles similares a líneas celulares
de tipo salvaje, las líneas LTAT demostraron una mayor sensibilidad a la inhibición de
PHGHD con CBR-5884 en comparación con las líneas WT, así como un aumento del
etiquetado 13C en glicina. dependencia de la vía de biosíntesis de serina (Figura 3C). La serina
se convierte en glicina mediante la eliminación de un solo carbono en una reacción
dependiente de folato, donde tanto la glicina como el único carbono transferido al cofactor de
folato son necesarios para la biosíntesis de purinas y pirimidinas (Lane y Fan, 2015; Locasale,
2013) . Por lo tanto, evaluamos la susceptibilidad celular al metotrexato (MTX), un análogo de
folato que inhibe la dihidrofolato reductasa y detiene el metabolismo de un solo carbono
dependiente del ciclo de folato. Tras el tratamiento con metotrexato, las líneas celulares LTAT
mostraron un nivel significativamente más alto de muerte celular que las líneas celulares WT
(Figura 3D). El aumento significativo en la muerte celular con metotrexato y CBR-5884 en
líneas LTAT es consistente con la regulación positiva en la biosíntesis de serina y glicina
observada en los datos de rastreo 13C por el aumento de etiqueta observado en glicina, lo que
indica la regulación al alza continua del flujo de glucosa a través de la biosíntesis de serina vía
en el tratamiento a corto y largo plazo con ADI-PEG20.
Cambios en la dependencia y utilización de la glutamina después de la privación de arginina
Para determinar la dependencia celular de las líneas celulares de glutamina, WT y LTAT se
cultivaron en medio libre de glutamina. Las líneas de LTAT fueron significativamente más
susceptibles a la abstinencia de glutamina que sus contrapartes de WT (Figura 4A). A partir de
los datos de CE-MS, la abundancia celular de glutamina disminuye significativamente de forma
dependiente del tiempo con el tratamiento con ADI-PEG20; un tratamiento más prolongado
se asocia con reducciones más profundas en los niveles de glutamina (Figura 4B). Esta pérdida
refleja un mayor uso de glutamina en oposición a la disminución de la biosíntesis debido a que
las líneas celulares se cultivaron en exceso de glutamina. Un aumento significativo en la
captación extracelular de glutamina radiomarcada ([3 H] -Gln) después del tratamiento
ADI-PEG20 a corto plazo y aumentos adicionales en la captación tras un tratamiento a largo
plazo demuestran la utilización incrementada de glutamina en la privación de arginina (Figura
4C). La glutamina se deriva al ciclo de TCA tras la privación de arginina, con cada una de las
líneas celulares que muestran los niveles de proteína glutaminasa (GLS) y / o glutamato
deshidrogenasa (GDH) aumentados con el tratamiento con ADI-PEG20 (Figura 4D). Además,
el silenciamiento de GLS mediado por ARN de horquilla corta (shARN) disminuye la
viabilidad celular en condiciones de privación de glucosa, lo que demuestra la dependencia del
cambio metabólico a la utilización de glutamina en ausencia de glucosa (figura S4). Tomados
en conjunto, estos datos sugieren que la privación de arginina aumenta la tasa de anaplerosis y
oxidación de glutamina a través del ciclo de TCA. La disminución en los intermedios del ciclo
de TCA derivado de glucosa 13C tras el tratamiento con ADI-PEG20 (Figura 3A) sugiere un
flujo elevado de otras fuentes de carbono en el ciclo de TCA, sugiriendo los datos una
regulación positiva inducida por ADI-PEG20 de la anaplerosis de glutamina. Para demostrar
una mayor tasa de flujo de glutamina en el ciclo de TCA y alteraciones en el destino de la
glutamina en el tratamiento a corto y largo plazo con ADI-PEG20, las líneas SKLMS1 se
cultivaron con glutamina U13C y se sometieron a extracción de metabolitos y CE-MS. El
rastreo de los cinco carbones marcados con 13C de la glutamina demuestra la entrada en el
ciclo de TCA, la posterior descarboxilación oxidativa, la oxidación y la hidratación para formar
malato, con oxidación adicional a oxaloacetato y cataplerosis para la biosíntesis de aspartato y
asparagina (Figura 4E). El aumento en las cuatro etiquetas 13C observadas en malato tras el
tratamiento con ADIPEG20 informa esta direccionalidad. Además, dramática upregulation en
asparagine sintetasa (ASNS) se produjo simultáneamente con el aumento significativo en
asparagine etiquetado (Figura 4D]. La cantidad relativa total de citrato marcado con 13C
disminuyó, con pequeños aumentos en cinco marcados con 13C en citrato, lo que sugiere un
ligero aumento en la tasa de descarboxilación reductiva. Finalmente, no se observó un
aumento significativo en la acumulación de 13C en citidina trifosfato (CTP) o uridina trifosfato
(UTP) (Figura S5), y se encontró que un pequeño componente del 13C derivado de glutamina
se utilizó en la biosíntesis de glutatión (Figura 4E). Tomados en conjunto, encontramos que la
anaplerosis de la glutamina se regula positivamente con el tratamiento ADI-PEG20, siendo el
principal benefactor los aminoácidos, específicamente el aspartato y la asparagina.
Inhibición del efecto Warburg después de la privación de arginina
Debido a que la privación de arginina causó un aumento en la utilización de glutamina (Figura
4), un aumento en la susceptibilidad a la muerte celular por tratamiento con oligomicina
(Figura 2D) y una disminución en la fermentación de glucosa en ácido láctico (Figura 3A),
supusimos que los cambios en la red metabólica después del tratamiento con ADI-PEG20 dio
como resultado una inhibición del efecto de Warburg. Para probar esta hipótesis, utilizamos el
Seahorse XF96 para perfilar los fenotipos metabólicos de las células en condiciones normales y
en el contexto de la inanición de arginina. Al medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR),
un indicador de la fermentación del ácido láctico, observamos un aumento significativo de
ECAR de células no tratadas al agregar glucosa al medio. Sin embargo, cuando las células se
pretrataron con ADI-PEG20, el aumento de la acidificación extracelular con la adición de
glucosa se redujo significativamente (Figura 5A). Esto sugiere que las células no tratadas
fermentan preferentemente la glucosa en ácido láctico a una velocidad mayor que las células
tratadas con ADI-PEG20, que tienen una tasa reducida de fermentación de glucosa. La
respiración mitocondrial fue perfilada por medidas de la tasa de consumo de oxígeno (OCR)
para determinar los cambios en el nivel de generación de ATP dependiente de Oxphos después
de la privación de arginina. La capacidad respiratoria adicional, o la capacidad de las
mitocondrias para generar ATP adicional a través de la cadena de transporte de electrones en
condiciones de estrés energético, disminuyó significativamente en las células tratadas con
ADI-PEG20 (Figura 5B). Esto indica que las mitocondrias en estas células son menos capaces
de regular positivamente la generación de Oxphos ATP al aumentar la demanda de energía que
las mitocondrias de las células no tratadas. La mayor sensibilidad de las líneas celulares LTAT a
la muerte celular por oligomicina sugiere además una mayor dependencia de OxPhos en
condiciones de privación de arginina (Figura 2D). Además, el porcentaje de ATP celular total
generado a partir de la glucólisis disminuye significativamente en las líneas celulares LTAT en
comparación con las líneas celulares WT (Figura 5C). La disminución de la fermentación de
ácido láctico y el aumento de la tasa de OxPhos indican que la privación de arginina puede
inhibir el efecto de Warburg. Como se muestra por el perfil energético (Figura 5D), las líneas
de células WT glucolíticas disminuyen el ECAR y aumentan el OCR tras el tratamiento con
ADIPEG20 a corto y largo plazo, ya que regulan negativamente el efecto Warburg y regulan
positivamente OxPhos en respuesta a la inanición de arginina. Estudios previos en cáncer de
mama han mostrado una disminución en OxPhos mitocondriales tras el tratamiento con
ADI-PEG20 debido a la disminución de la expresión de Cox4, en contraste con la respuesta
celular a la privación de arginina que identificamos (Qiu et al., 2014). Cuando nuestras
muestras se examinaron para determinar la expresión de Cox4 utilizando el mismo anticuerpo,
no apareció un patrón consistente, con SKLMS1 demostrando una expresión de Cox4
aumentada (Figura S6). Esto puede reflejar una diferencia en la biología del cáncer de mama en
comparación con el melanoma y el sarcoma o una diferencia en la respuesta de la línea celular
de cáncer de mama al tratamiento con ADI-PEG20.
La regulación selectiva del metabolismo de la glutamina causa letalidad sintética
La mayor dependencia de la anaplerosis de glutamina y OxPhos tras la privación de arginina
identifica una sinergia potencial en la privación de arginina y la inhibición del metabolismo de
la glutamina. Para probar el potencial de una interacción letal sintética entre el tratamiento con
ADI-PEG20 y la inhibición del metabolismo de la glutamina, las líneas celulares se trataron
con ADI-PEG20, un inhibidor de GLS (bis-2- (5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol) -2-yl) etil
sulfuro [BPTES]), o los dos medicamentos en combinación. La combinación de ADI-PEG20
y BPTES dio como resultado una reducción significativamente mayor en el número de células
viables que cualquiera de los fármacos individualmente (Figura 6A) y un mayor aumento en la
muerte celular en el tratamiento simultáneo que cualquier fármaco individualmente (Figura 6B).
Para garantizar que estos resultados no fueran consecuencia de un efecto fuera de objetivo, la
letalidad sintética se probó en líneas celulares después de la desactivación de shRNA de GLS
(Figura 6C). En las células knock-down de GLS, el tratamiento con ADI-PEG20 redujo el
número de células viables en el mismo grado que el tratamiento con ADI-PEG20 y BPTES en
combinación, en comparación con las líneas celulares de control, donde solo la combinación
de tratamientos demostró una interacción sinérgica. indicando efectos mínimos fuera del
objetivo (Figura 6C). Luego probamos una amplia gama de líneas celulares deficientes en ASS1
identificadas a partir de la línea celular NCI-60 (incluidas líneas celulares de cáncer de mama,
colon, pulmón, glioblastoma y cabeza y cuello), una línea celular de cáncer de mama
xenoinjerto derivada del paciente, y una línea celular de osteosarcoma con ADI-PEG20 y
BPTES y encontró que la combinación daba como resultado de manera similar una mayor
reducción en el recuento de células viables que cualquier fármaco individualmente (Figura 6D).
Desafortunadamente, los experimentos in vivo usando BPTES en ratones se evitaron por
cristalización del compuesto tras la inyección. Por lo tanto, como una alternativa, shRNA
dirigidos a la secuencia de codificación para glutaminasa (shGLS) y shRNA dirigidos a la
secuencia codificante de proteína verde fluorescente (shGFP) se utilizaron xenoinjertos
SKMEL2 para recapitular la letalidad sintética in vivo. Los xenoinjertos con construcciones de
shGLS demostraron aproximadamente un retraso de 12 días en el crecimiento a 100 mm3 en
comparación con los tumores de control de shGFP; cuando se estableció, todos los tumores
crecieron aproximadamente a la misma velocidad (figura 6E). Cuando los tumores
experimentales alcanzaron aproximadamente 100 mm3, se inyectó ADI-PEG20 por vía
intramuscular una vez cada 3 días. Aunque el tratamiento con ADIPEG20 provocó que los
tumores control shGFP permanecieran estáticos durante un corto período de tiempo antes de
ganar resistencia al fármaco y reanudar el crecimiento, los tumores shGLS se redujeron
significativamente con el tratamiento con ADI-PEG20 (Figura 6E). Estos resultados indican
que el tratamiento con ADI-PEG20 y la inhibición simultánea de GLS disminuye la carga
tumoral in vivo. El análisis de xenoinjertos en el día 30 mostró reabsorción o selección de
ASS1 para una subpoblación de células con inactivación GLS menos efectiva, mecanismos
probables de resistencia adquirida a la inhibición del crecimiento ADI-PEG20 (Figura 6F),
apoyando además la letalidad sintética in vivo. Finalmente, los tumores LTAT shGFP y shGLS
tratados con ADI-PEG20 crecieron a la misma velocidad que los tumores WT shGFP no
tratados; la selección de células LTAT shGLS probablemente indujo una reprogramación
adicional del metabolismo celular para compensar la mayor dependencia de la glutamina
observada en las líneas LTAT (Figura S7).
DISCUSIÓN
Demostramos que la eliminación de la arginina de los cánceres auxotróficos de arginina,
desafiantes a ASS1, altera rápidamente el metabolismo, regula negativamente el efecto de
Warburg y regula por incremento la anaplerosis de la glutamina (Figura 7). Curiosamente,
dirigirse a un defecto en el ciclo de la urea puede conducir a la regulación positiva de OxPhos,
el metabolismo de la glutamina y la biosíntesis de la serina. Este cambio hace que las células
sean vulnerables a estrategias metabólicas letales sintéticas en las que ADI-PEG20 induce la
inanición de arginina, mientras que los inhibidores de glutaminasa suprimen la dependencia
compensatoria de la glutamina y los inhibidores de PHGDH prohiben la regulación positiva de
la biosíntesis de serina. Aunque ni la inhibición de GLS ni la privación de arginina por sí sola
son suficientes para inducir altos niveles de muerte celular debido a la rápida reprogramación
metabólica que se produce tras la exposición al agente único, juntas son terapéuticamente
eficaces para destruir células tumorales y suprimir el crecimiento tumoral. ADI-PEG20
también desvía la glucosa a la biosíntesis de serina y posterior metabolismo de folato de un
solo carbono corriente abajo, sensibilizando a las células a los metabolitos anti-folato como el
metotrexato. Se han identificado muchos defectos en el metabolismo en cáncer, incluyendo
deficiencia de ASS1, mutaciones de isocitrato deshidrogenasa (IDH), sobreexpresión de PKM2,
deficiencias de succinato deshidrogenasa y fumarato hidratasa, y mutaciones en diversas
proteínas del complejo mitocondrial (Rohle et al., 2013). Con la excepción de que las
mutaciones de IDH en la leucemia son sensibles a AG221 (un inhibidor de la IDH) en
monoterapia, la orientación metabólica de agente único generalmente conduce a una rápida
readaptación metabólica y resistencia terapéutica (Allen et al., 2014; Gaude y Frezza, 2014
Sasaki et al., 2012). Aquí demostramos que, al medir los cambios metabólicos globales en
respuesta a la privación de arginina, no solo podemos identificar las vías de adaptación sino
también desarrollar terapias para atacarlas. Es importante destacar que esta es la primera
estrategia terapéutica letal sintética dual metabólica para el cáncer que se basa exclusivamente
en rutas metabólicas en lugar de superponer una estrategia metabólica además del estándar
actual de atención, como la quimioterapia, en un intento de mejorar la eficiencia. Otra
observación clave es la constatación de que el efecto Warburg puede explotarse para beneficio
terapéutico. El tratamiento con ADI-PEG20 de líneas celulares glucolíticas, deficientes en
ASS1 dio como resultado la inhibición del efecto de Warburg. Estos cambios fueron
acompañados por una redirección simultánea de glucosa a través de la vía de biosíntesis de
serina y compromiso compensatorio de un programa de supervivencia que utiliza anaplerosis
de glutamina para aprovechar el ciclo de TCA para la generación de energía y biomasa. Al
alterar cómo las células cancerosas utilizan la glucosa, podemos alterar la capacidad de las
células tumorales para construir la biomasa necesaria para mantener la división celular rápida.
Finalmente, utilizando un enfoque metabólico global para estudiar los efectos agudos y a largo
plazo de la inanición de arginina en tumores deficientes en ASS1, desarrollamos un paradigma
en el que los cambios en las rutas metabólicas pueden usarse para desarrollar terapias contra el
cáncer impulsadas por biomarcadores y multidrogas que explotan la metabolismo único de
cánceres. La capacidad de alterar de forma aguda el metaboloma y, por lo tanto, inducir
cambios en la síntesis de nucleótidos, la composición de aminoácidos y el metabolismo de los
lípidos tiene el potencial de descubrir otras vulnerabilidades metabólicas específicas de las
células cancerosas. Es nuestra esperanza que podamos utilizar este tipo de enfoque dirigido a
los biomarcadores para matar de hambre selectivamente y luego matar las células cancerosas
con un efecto mínimo en los tejidos normales.