FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPTO. CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Biología Celular

BIO-133
Informe Laboratorio N° 9
PCR

Fecha de entrega:
Jueves 19 de junio, 2014
Introducción
El ADN es una macromolécula compleja la cual está compuesta por azucares, grupos
fosfato y bases nitrogenadas y almacena nuestro material genético, el cual entrega la
herencia a las generaciones posteriores de diversas poblaciones, cada célula del cuerpo
posee la misma información genética, por lo tanto seremos capaces de encontrar nuestra
información genética a partir de cualquier célula somática de nuestro cuerpo. Mediante la
siguiente experiencia del laboratorio tomaremos conciencia de lo esencial que es la técnica
del PCR para el estudio genético tanto poblacional como molecular. En esta ocasión
obtendremos DNA a partir de células humanas las cuales contienen por supuesto, material
genético de la persona de la cual fueron extraídas, en este caso nosotros los alumnos del
laboratorio de biología BIO 133 y con ayuda de la técnica de PCR y de diversos
procedimientos que serán llevados a cabo en el laboratorio, lograremos determinar si se
encuentra presente en el genotipo de los alumnos el inserto Alu en el cromosoma 16 para
luego con esos datos calcular las frecuencias genotípicas y alélicas y posteriormente
compararlas con los resultados obtenidos en un estudio realizado a un grupo de individuos
de EE.UU y luego determinar si ambas poblaciones se encuentran en el equilibrio de
Hardy-Weingberg
Objetivos del práctico

Reconocer porque la técnica de PCR es importante para el estudio poblacional y molecular.

Obtener ADN de células humanas.
Amplificar por PCR el inserto Alu presente en el cromosoma 16.
Reconocer las muestras amplificadas en el gel de agarosa.
Analizar e interpretar las frecuencias genotípicas y alélicas presentes en la población.
Determinar si la población se encuentra en equilibro de Hardy-Weingberg.
Metodología.
1. Recolectamos un poco de nuestra saliva en un vaso de precipitado, la pusimos en
solución salina, lo transferimos a un tubo eppendorf, etiquetamos con nuestras
iniciales y luego mezclamos.
2. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos.
3. Retiramos el sobrenadante por inversión del tubo y luego con una micropipeta
agregamos 10 microlitros de nuestra solución a un tubo con Insta Gene matrix.
4. Colocamos los tubos en un flotador y los dejamos en un baño a 56°C durante 10
minutos. En el punto medio (5min) volvemos a mezclar el contenido del tubo
agitando y luego los devolvimos al baño de agua por otros 5 minutos.
5. Retiramos los tubos del baño de agua, mezclamos de nuevo agitando y luego los
volvimos a poner en un baño de agua por 6 minutos a 100°C.
6. Después retiramos los tubos, los agitamos y centrifugamos durante 5 minutos a
6000g.
7. Agregamos 10ul del sobrenadante de nuestros tubos con ADN al tubo con PCR y
etiquetamos.
8. Luego colocamos los tubos en el termociclador por 6 horas.
9. Les dimos un pulso de 3 segundos a 2000xg a nuestros tubos para que la
condensación dentro de la taba caiga al fondo del tubo.
10. Agregamos 5 ul de tampón de carga PV92 XC a nuestros tubos.
11. Cargamos 15 ul de cada muestra en los pocillos del gel de agarosa previamente
preparado y listo con el tampón TAE1x. los cargamos en el siguiente orden: pocillo
1 = MMR, 2 = control homocigoto (+/+), 3 = control homocigoto (-/-), 4 = control
homocigoto (+/-), 5 = estudiante 1, 6 = estudiante 2 y así sucesivamente hasta el
estudiante 16.
12. Colocamos la tapa en la caja de gel, conectamos los cables a la fuente de poder y
realizamos la electroforesis de nuestras muestras a 100V durante 35 minutos.
13. Retiramos el gel y lo colocamos en el transiluminador y observamos.
Resultados

MMR (+/+) (-/-) (+/-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Estudiantes

Homocigoto dominante (+/+): Estudiantes 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10 y 11

Homocigoto recesivo (-/-): Estudiantes 4 y 12
Heterocigoto (+/-): Estudiantes 13, 14, 15 y 16

1. ¿Cuáles son los genotipos del inserto Alu encontrados en el curso de BIO 133?
En el curso BIO 133 pudimos encontrar 3 genotipos diferentes, homocigotos dominantes
(+/+), homocigotos recesivos (-/-) y heterocigotos (+/-). Del total de 16 individuos
obtuvimos 8 homocigotos dominantes, 2 homocigotos recesivos, 4 heterocigotos y 2 que
fueron inconclusos ya que posiblemente no se logró obtener ADN de la muestra, por lo
tanto, no pudimos observar sus bandas en el gel de agarosa.

2. ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas (+/+), (+/-) y (-/-) en la población del curso BIO
133? Rellenar el siguiente cuadro con los datos obtenidos en el práctico.

3.

8 0.57
4 0.29
2 0.14
14

4. ¿Cuáles son las frecuencias de cada alelo en su clase?

20 0.715
8 0.285
28
p= frecuencia de (+/+) + ½ frecuencia (+/-) o p = numero alelos (+) / total de alelos (+ y -)
p= 0.57 + ½ 0.29 p = 20 / 28
p= 0.715 p = 0.714

q= frecuencia de (-/-) + ½ frecuencia (+/-) o q = numero alelos (-) / total de alelos (+ y -)

q= 0.14 + ½ 0.29 q = 8 / 28
q= 0.285 q = 0.286

5. A continuación se presenta una tabla con las frecuencias genotípicas de una población
De EE.UU.

Con los datos anteriores calcule las frecuencias alélicas de esta población, rellenando la
siguiente tabla:

10,372 0.515
9,628 0.485
20,000

p= frecuencia de (+/+) + ½ frecuencia (+/-) o p = numero alelos (+) / total de alelos (+ y -)

p= 0.24 + ½ 0.55 p = 10,372 / 20,000
p= 0.515 p = 0.525

q= frecuencia de (-/-) + ½ frecuencia (+/-) o q = numero alelos (-) / total de alelos (+ y -)

q= 0.21 + ½ 0.55 q = 9,628 / 20,000
q= 0.485 q = 0.485
¿Se parecen las frecuencias genotípicas y alélicas obtenidos en la clase BIO 133 con las de
la muestra aleatoria de la población EEUU?
No, no se parecen las frecuencias genotípicas ni las alélicas.
BIO 133 EE.UU
Genotípicas: (+/+) = 0.57 0.24
(+/-) = 0.29 0.55
(-/-) = 0.14 0.21

Alélicas: p = 0.714 0.515

q = 0.285 0.485

¿Es de esperar que coincidan? ¿Qué razones podrían explicar las diferencias o similitudes?
obtenidas?
No, porque se están analizando dos poblaciones distintas, son de diferentes países y
también se encuentran distantes geográficamente, también son diferente porque la cantidad
de individuos estudiados no es la misma, hay una gran diferencia (10,000 vs 14) entre la
población de EE.UU y la del curso BIO- 133.

6. Determine, a partir de los datos obtenidos del curso BIO 133 y de los datos de la
población de EEUU de la tabla anterior, si estas poblaciones se encuentran en equilibrio
de Hardy-Weinberg. (G.L.= 2 con un nivel de significancia de 0,05). Discuta sus
Resultados.
Equilibro de Hardy-Weingberg p2 + 2pq + q2 = 1
EE.UU = 0.515 + 2*0.515*0.485 + 0.485
= 0.265 + 0.500 + 0.235
=1

BIO 133 = 0.715 + 2*0.715*0.285 + 0.285

= 0.511 + 0.408 + 0.081
=1
Estas poblaciones se encuentran en equilibro de Hardy-Weingberg
Conclusión
De acuerdo a los resultados obtenidos en la experiencia anterior podemos
concluir que la técnica de PCR es realmente de suma importancia para el
estudio genético en poblaciones y para determinar si ciertas secuencias
específicas de nucleótidos se encuentran presente en el ADN de un individuo,
es decir, nos permite identificar el genotipo que posee este individuo, como en
el caso de este practico realizado, que determinamos los genotipos presentes
en los alumnos del curso BIO 133. Esta técnica también es muy importante en
medicina ya que nos permite identificar si un individuo posee o es portador de
alguna enfermedad o patología que se ve manifestada en su secuencia de ADN
y que de no ser por esta técnica probablemente, no sería posible determinar.
Al comparar nuestros datos obtenidos con el análisis de la población de
EE.UU pudimos concluir que a pesar de estar analizando la presencia o
ausencia de la misma secuencia genética obtuvimos resultados diferentes ya
que hubo muchos factores que no coincidían entre ambas poblaciones como
por ejemplo la localización geográfica, la cantidad de individuos analizados,
entre otras, sin embargo, a pesar de los diferentes resultados, en ambas
poblaciones hay un equilibrio en los genotipos, demostrado gracias a la
ecuación de equilibrio de Hardy-Weingberg.
Bibliografía
1- Mullis KB et al., Enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain
reaction, Cold Spring

2- Saiki RK et al., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable

DNA polymerase, Science 239, 487–491 (1988)

3- Deininger PL, SINEs, short interspersed repeated DNA elements in higher eukaryotes.
In Berg DE and How MM (eds), Mobile DNA. Washington DC, ASM Press, 619–636
(1989)

4- Batzer MA et al., Amplification dynamics of human-specific (HS) Alu family members,

Nucleic Acids Res 19, 3619–3623 (1991)