Operaciones

del
laboratorio
Cuaderno del laboratorio 1
curso de laboratorio
biomédico y clínico.

FATIMA BENTAHRA.
 CROMATOGRAFIA.
Introducción.

La cromatografía es una técnica para la separación de componente de una mezcla en base a la

distribución relativa de estos productos entre una corriente fluida en movimiento, llamada fase
móvil, y una fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la fase estacionaria un
sólido o un líquido.

La cromatografía es una de las técnicas más usadas para separar los distintos componentes de una
mezcla para su posterior estudio. Esta forma de separar componentes de una mezcla se llama
separación cromatográfica.

La cromatografía se aprovecha del movimiento de una mezcla por un soporte, por ejemplo, papel o
tela. Los elementos de la mezcla se mueven por el soporte a diferentes velocidades separándose.
Unos componentes se mueven por el soporte más fácilmente y otros se detienen, esto hace que la
mezcla se separe en bandas de diferentes componentes.

Realización practica.

Se corta una tira rectangular de papel de filtro de una longitud casi igual a la altura del vaso de
precipitados y de una anchura inferior al diámetro de éste (para un vaso de 250 mL las dimensiones
de la tira serían de 6 x 9 cm). A un centímetro, aproximadamente, de uno de los bordes se dibujan
puntos gruesos con rotuladores o bolígrafos de colores, uno por cada color que queramos investigar
(fig. 1). A continuación, se pega el otro extremo de la tira a la varilla o alambre de forma que éste
haga de “percha” del papel (fig. 2). Seguidamente, se introduce la tira en el vaso de precipitados al
que previamente se habrá añadido una mezcla de metanol que contiene un 20 % de agua,en
cantidad suficiente para que pueda tocar y humedecer la tira, pero procurando que quede por
debajo de los puntos de colores dibujados en el papel. Poco a poco la mezcla de metanol y agua
ascenderá en la tira por capilaridad y al llegar a los puntos de colores arrastrará los componentes de
las tintas. Se verá como, por cada uno de los puntos originales, van apareciendo en el papel unas
bandas de diversos colores.

Material necesario.

· agua destilada

· alcohol metílico o etílico

· un vaso de 250 mL

· papel de filtro

· bolígrafos de diferentes colores

· varilla de vidrio o alambre de cobre de uno 10 cm de longitud

Observaciones y conclusiones.
En este tipo de cromatografía las moléculas de los distintos componentes de la muestra y la propia
fase móvil quedan retenidas en las posiciones de adsorción en función de la polaridad de los
compuestos.
La mezcla de metanol y agua disuelve las tintas y a medida que asciende por el papel las arrastra
hacia arriba, pero no todos los componentes se mueven a igual velocidad, llegando a separarse unos
de otros.

El líquido sube por el papel por capilaridad, a su paso va arrastrando las moléculas de los pigmentos
que tenía la tinta.

Como las moléculas no son iguales en tamaño ni en composición, no viajarán a la misma velocidad y
de ahí que se separen.

Los resultados cromáticos son distintos según la composición de las tintas, de suerte que se pueden
esperar resultados distintos a partir de diferentes marcas de rotulador.

FROTIS SANGUÍNEO.
INTRODUCCIÓN.

Podemos definir el frotis sanguíneo, o extensión sanguínea, como una fina película de sangre
extendida sobre un portaobjetos, de modo que las células sanguíneas estén dispuestas en una capa.
La finalidad de la extensión sanguínea es la observación al microscopio óptico de las células
presentes en la muestra.

El frotis sanguíneo se utiliza para el estudio de las características citológicas de las células de la
sangre, lo cual permite valorar el funcionamiento general de la médula ósea a través de sus
componentes celulares, lo cual implica la evaluación de las líneas eritrocíticas, leucocitaria y
megacariocítica, determinando anormalidades en forma, tamaño, color e inclusiones citoplasmáticas,
dando una medida cuantitativa y cualitativa de los elementos que lo conforman.

Las extensiones sanguíneas se pueden realizar de forma manual o de forma automática. En esta
práctica se utiliza la técnica manual del portaobjetos, también llamada técnica de los dos
portaobjetos.

La importancia de un buen extendido y su correcta tinción son fundamentales a la hora de la

observación al microscopio, ya que un frotis mal hecho entrega muy poca información acerca de la
morfología celular, y en algunos casos es esta observación la que entrega al Clínico la información
que requiere para realizar su diagnóstico

Características de la realización de un frotis sanguíneo correcto

Un frotis sanguíneo ideal debe cumplir una serie de requisitos:

- No debe cubrir toda la superficie del portaobjetos.

 - Su espesor debe ir disminuyendo desde el inicio hasta el final.
- La sangre debe ir dispuesta en una sola capa de tal modo que no queden huecos a lo largo de
la extensión sanguínea.
- Las bandas laterales deben ser lisas.
- Los bordes laterales de la extensión deben estar separados de los bordes del porta 1-2 mm.

El inicio y el final de la extensión sanguínea deben estar a un centímetro de los extremos del
portaobjetos. Los bordes laterales deben estar a uno o dos milímetros de los bordes del frotis.

Pueden darse extensiones defectuosas debido a la utilización de una gota demasiado grande, al uso
de portaobjetos mellados o con grasa, a la variación del ángulo y la velocidad de la técnica, o al
levantar antes de tiempo el portaobjetos esmerilado.

Realización práctica.

FROTIS SANGUINEO

 Se pipetea una pequeña cantidad de sangre, utilizando una pipeta Pasteur, procedente del
tubo con la muestra.
 Colocamos una gota, de pequeña cantidad de sangre, en un extremo del portaobjetos.
 Se coloca encima el portaobjetos esmerilado con un ángulo de 30-45º. Lo deslizamos hasta
que el extremo que contacta con el porta, tome contacto, a su vez, con la gota de sangre.
 Movemos ligeramente, de un lado a otro, el portaobjetos esmerilado para que la gota de
sangre se extienda bien en su extremo.
 Arrastramos el extremo del portaobjetos esmerilado por la superficie del portaobjetos
horizontal para extender la sangre en una fina capa que conformará el frotis sanguíneo.
Debemos levantarlo antes de llegar al final del extremo del portaobjetos que se haya en
posición horizontal.
 Damos por concluída la realización del frotis sanguíneo. Retiramos el portaobjetos esmerilado
y lo introducimos en la cubeta con agua y lejía al 10%.

Tras realizar la extensión, se obtienen tres partes de la muestra:

- Cabeza (con demasiados eritrocitos).

- Cuerpo (zona óptima para la observación, existe un reparto equilibrado de

células).

- Cola (eritrocitos en escaso número)

TINCIÓN

Introducción.

La tinción es un método que se utiliza para distinguir los distintos componentes celulares,
atendiendo a la distinta afinidad hacia unos colorantes u otros.

Esta tinción es de tipo Romanowsky, es decir, que utiliza azul de metileno y sus productos de
oxidación (azur A, B y C) como colorante básico y se combina con eosina, como colorante ácido.

Dependiendo de la proporción en la que aparezcan los dos componentes en el colorante, tendremos

Giemsa, Wright, Leishman y panóptico de Pappenheim

Realización práctica.

Hay varios tipos de tinciones que se utilizan para teñir frotis de sangre para la evaluación. Un tipo
común de tinción, como se muestra a continuación, consta de tres soluciones:

- Un fijador de alcohol
- Una tinción roja (eosinófilos)
- Una tinción azul (basófilos)

El procedimiento para la tinción consiste en sumergir el frotis de sangre dentro de en cada una de
estas soluciones 5 a 10 veces, y luego enjuagar el portaobjetos con agua. Asegúrese de sumergir
primero en el alcohol fijador, luego en la tinción roja y finalmente en la tinción azul!

Material necesario. (frotis sanguíneo y la tinción)

 Portaobjetos.
 Portaobjetos esmerilado.
 Tubo de ensayo.
 Gradilla.
 Pipeta pasteur.
 Cubeta con agua y lejía al 10%.
 Muestra de sangre anticoagulada con EDTA.
 Tinción con colorante Giemsa (formado por una mezcla de eosina, azul metileno y azures en
solución acuosa).
Observaciones y conclusiones.

Esta práctica nos ayudó a aprender cómo realizar un estudio de laboratorio muy básico pero muy
importan, también nos ayudó a conocer la morfología microscópica de los componentes celulares de
la sangre.

El frotis sanguíneo es un estudio muy fácil de realizar pero muy importante ya que ayuda a la
diagnosticación de diversos trastornos que pueden afectar a las células sanguíneas y por
consecuencia al organismo, estas enfermedades pueden incluir anemias, leucemias, trastornos
plaquetarios, trastornos inmunes, etc.

Observaciones tras realizar el frotis sanguíneo

 Nos encontramos muchos portaobjetos sucios y con grasa, por lo que algunas extensiones
tuvieron que ser desechadas por ese motivo.
 Las primeras extensiones salieron muy largas y con mucha celularidad debido a que
poníamos una gota de sangre demasiado grande. Es decir, con mucha cantidad de sangre.
  Una vez que nos acostumbramos a colocar la cantidad justa de sangre, nos encontramos con
el problema de usar una angulación muy grande con el portaobjetos esmerilado. El resultado
era un frotis sanguíneo corto y grueso.
 La colocación de los dedos es fundamental para que no nos molesten durante la realización
de la técnica y para que el portaobjetos no se mueva.
 La limpieza de los portaobjetos es muy importante para evitar encontrarnos grasa y suciedad
en futuros usos. Para ello se meten en una cubeta con agua y lejía al 10% durante diez
minutos para desinfectar. Además, en la misma cubeta, se echan unas gotas de fairy para
desengrasar y limpiar bien los portaobjetos. Después se aclaran y se colocan en gradillas de
portaobjetos, teniendo como último destino la estufa para secarlos.
Causas de error en la tinción del frotis sanguíneo

- Coloración excesivamente azul: Frotis muy grueso, lavado insuficiente,

- Tinción muy prolongada, colorante demasiado alcalino.
- Coloración muy rosada: El agua del lavado, el colorante o el tampón demasiado
ácidos.
- Aparición de artefactos debido a suciedad, deterioro o presencia de grasa en
portaobjetos.
- Hidratación de los hematíes: Fijación inadecuada por uso de alcohol metílico no
absoluto.
EXTRACCIÓN SANGUÍNEA
Introducción.

Los métodos de extracción nos permiten recoger muestras sanguíneas para el análisis de sangre en el
laboratorio. Es decir, nos permite obtener una muestra de sangre adecuada para efectuar su análisis
hematológico, bioquímico o microbiológico.

Dentro de los métodos de extracción sanguínea encontramos la punción venosa. Se define como el
arte de introducir una aguja en una vena para así poder acceder al torrente sanguíneo. Mediante
esta vía se logra extraer sangre, y administrar vacunas o medicamentos, entre otros fines.

De la extracción de sangre se realizan análisis, los cuales pueden ser de rutina para apoyar el
diagnóstico de enfermedades o como control de salud.

Se precisan unos requisitos para efectuar las extracciones sanguíneas:

- Cada petición de análisis de sangre debe ir acompañada de un volante.

- El volante es expedido por el médico a nombre del paciente.
- El paciente entregará el volante el día de la extracción, donde se le asignará un código.

En el libro de registro del laboratorio quedará registrado:

- Nombre del paciente y su código.

- Fecha y hora de obtención de la muestra.
- Número de laboratorio.
- Nombre del médico que pide la prueba.
- Servicio médico desde donde se solicita la prueba.

Realización práctica.

Para efectuar la punción venosa se escogerá una vena por palpación, colocando el compresor venoso
a unos 10 centímetros de la zona donde se efectuará dicha punción, con la consecuente extracción
de sangre venosa.
El área antecubital es la zona escogida, ya que la piel es más fina y pasan tres venas de considerable
calibre (cubital, cefálica y basílica). Se deberá evitar punzar en zonas con lesiones en la piel,
hematomas, quemaduras o cicatrices.

Para esta técnica utilizaremos una aguja acoplada a una jeringa con medición. Nos servirá para
extraer la sangre al vacío para luego dispensarla en tubos con anticoagulante. Otra opción es utilizar
el sistema Vacutainer, que consta de una aguja, y un acople para tubos con anticoagulante, que
permitirá la extracción de sangre venosa por presión positiva directamente al tubo acoplado.

En cuanto a los tubos con anticoagulante, los más usados son el tubo con tapón lila, que contiene
EDTA, el tubo con tapón verde, que contiene heparina de litio, y el tubo con tapón negro, que
contiene citrato. En cualquier caso, la coloración de los tapones y el uso de los anticoagulantes
vendrán determinados según el fabricante.

Procedimiento.

1. En primer lugar reuniremos el material necesario para la extracción de sangre venosa.

2. Colocaremos el compresor venoso en el brazo donde se va a realizar la extracción.
3. Palparemos la vena donde realizaremos la punción.
4. Desinfectaremos la zona de la punción con un guatis empapado en alcohol de 70º.
5. Realizaremos la punción teniendo cuidado de usar la aguja con el bisel hacia arriba y con la
jeringa con los números hacia arriba también. De este modo podremos controlar la cantidad
de sangre extraída.
6. Extraeremos 10 mililitros de sangre venosa.
7. Retiraremos el compresor antes de extraer la aguja.
8. Extraeremos la aguja.
9. Presionaremos la zona de la punción con un guatis limpio.
10. La aguja la desecharemos adecuadamente en el contenedor de residuos biológicos.
11. Dispensaremos la sangre venosa en tubos anticoagulados con EDTA.
Observaciones y conclusión.

Antes de retirar la aguja es muy importante, en primer lugar, retirar el compresor venoso. Si no se
hiciese de este modo, una vez retirada la aguja, con el compresor puesto, saldría abundante sangre
del lugar de venopunción.

En plena extracción de sangre venosa, al tirar del émbolo de la jeringa, es muy importante no hacerlo
deprisa, ya que podríamos hemolizar la sangre. Es aconsejable realizar la operación despacio y con
ritmo constante.

Al pasar la sangre extraída a los tubos anticoagulados (dispensación), hay que hacerlo con cuidado
para no hemolizar los hematíes de la muestra. Si dispensamos soltando la sangre con mucha presión,
los hematíes se lisarán al golpearse contra las paredes del tubo.

Una vez dispensada la sangre en los tubos, los moveremos para homogeneizar la mezcla de
anticoagulante con la sangre. Se debe hacer de manera suave y con un ritmo constante, ni rápido ni
fuerte. Si realizamos esta operación de manera brusca conseguiremos hemolizar la muestra,
rompiendo los hematíes y dejándola inservible.

UROANÁLISIS.
Introducción.

Los términos “uroanálisis”, “análisis de la orina” “citoquímico de orina”, “parcial de orina” describen
un perfil o grupo de pruebas tamiz con capacidad para detectar enfermedad renal, del tracto urinario
o sistémica. Desde el punto de vista de los procedimientos médicos, la orina se ha descrito como una
biopsia líquida, obtenida de forma indolora, y para muchos, la mejor herramienta de diagnóstico no
invasiva de las que dispone el médico. El cuadro hemático y el parcial de orina son dos de los
exámenes de laboratorio más comunes que se realizan para el enfoque diagnóstico de algunas
enfermedades, el análisis adecuado de estos, puede ayudar a identificar muchas de las patologías
que frecuentemente se presentan en las personas que asisten la consulta médica.

A través del análisis directo al microscopio, se identifican elementos formados o insolubles en la

orina, y que pueden provenir de la sangre, el riñón, las vías urinarias más bajas y de la contaminación
externa. Se realiza con el sedimento urinario obtenido por centrifugación. Informa las células por
campo, cilindros por preparación, bacterias, levaduras, cristales y moco por cruces (+: leve, ++:
moderado, +++: aumentado,++++: muy aumentado). No solo evidencia una enfermedad renal, sino
también indica la clase de lesión presente.

Realización práctica.

La realización del análisis de orina completa tiene como primer paso la obtención de una muestra de
orina, para esto durante la micción se desprecia la primera parte de ella, a continuación sin detener
el chorro, debe recogerse la orina en la segunda parte de la micción en un frasco estéril. El
procedimiento del análisis consta de tres partes:

- Examen macroscópico y físico de la orina: Observamos la orina contenida en el frasco de

plástico transparente donde fue recogida la muestra. Apreciamos el color, el aspecto y la
densidad de la orina sin agitar el frasco.
- Examen químico: Sumergimos por completo una tira reactiva durante un corto periodo de
tiempo en la muestra bien mezclada de orina contenida en el frasco. A continuación
 extraemos la tira del recipiente apoyando el borde de la tira sobre la boca del frasco para
eliminar el exceso de orina. Apenas se deja reposar la tira para que se lleven a cabo las
reacciones, y finalmente se comparan los colores que aparecen con la escala cromática
provista por el fabricante de la tira reactiva.
- Sedimento urinario: Vertimos parte de la orina contenida en el frasco inicial en un tubo de
ensayo. Lo dejamos reposar. Pasado cierto tiempo, vaciamos el contenido del tubo de
ensayo cuidando que sólo quede la parte de la orina que por su mayor densidad se ha
acentuado en la base. Después, colocamos el sedimento urinario en una lámina porta-
objetos y tras cubrirlo con una laminilla lo llevamos al microscopio. La observación se realiza
con objetivo de 40x y se buscan cristales, leucocitos, hematíes, células epiteliales, bacterias,
espermatozoides, etc. en los campos observados.

Resultados.

Observaciones y conclusión.

El personal que manipula las muestras debe estar familiarizado con las medidas de
Bioseguridad del Laboratorio y considerar todas las muestras como potencialmente
infecciosas.
El personal debe disponer de los elementos de protección necesarios para evitar infecciones
por inhalación, ingestión e inoculación directa por contacto en la piel y mucosas (pechera,
guantes, mascarilla, protección ocular).
Para evitar la generación de aerosoles, las muestras deberían centrifugarse tapadas o
centrífugas con tapa, en un recinto solo destinado a esta actividad y con acceso restringido. El
material a emplear será preferentemente plástico y desechable, para evitar accidentes corto pun-
zantes.
La eliminación de desechos se realizará de acuerdo a los procedimientos establecidos
por el propio laboratorio en consideración de la normativa vigente (ver referencias
bibliográficas).
El aseo del laboratorio es fundamental, y se debe realizar limpieza de mesones con: solución
alcohol al 70%, o solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, preparadas diariamente o un
descontaminante comercial que neutralice el riesgo biológico. Se debe llevar un registro del aseo
realizado.