Modelado de los efectos del contenido inicial de nitrógeno y la temperatura en la cinética de fermentación de la sidra

dura

Abstracto

La sidra de manzana dura fabricada como un producto de valor agregado aumentará el consumo del exceso de
manzanas estadounidenses y dará ímpetu a la industria local. Para producciones a mayor escala, un modelo mecanicista
que podría predecir la cinética de fermentación sería una herramienta útil para comprender y diseñar procesos. Por lo
tanto, el objetivo de este estudio fue aplicar un modelo mecanicista simple para predecir la cinética de fermentación de
la sidra dura de las manzanas de Michigan y estudiar el efecto combinado del nitrógeno y la temperatura iniciales en la
fermentación. Los parámetros cinéticos del modelo mecanístico primario basado en la cinética de Monod se estimaron
de forma no lineal mediante el método de Runge-Kutta. Se usaron cuatro ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas
para cada una de las cuatro variables dependientes, concentración de células de levadura, concentración de nitrógeno,
azúcar y etanol. Para el modelo secundario, se propuso modelar el efecto de la temperatura y el contenido inicial de
nitrógeno en los parámetros cinéticos del modelo primario con una relación de Arrhenius. El presente estudio es la
primera aplicación conocida de un modelo matemático para el proceso de fermentación de sidra dura.

Palabras clave

Sidra, fermentación, cinética, modelado

Nomenclatura

E, concentración de etanol, g / L
ET, energía de activación para efecto de temperatura, J / g mol
EN, energía de activación para efecto nitrógeno, J / g mol
KN, Monod constante para nitrógeno, mg / L
KS, Monod constante para azúcar, g / L
kd, constante de velocidad de muerte, h-1
k, cualquier parámetro estimado no linealmente
kr, valor del mismo parámetro a temperatura de referencia y nitrógeno inicial
Ni, concentración de nitrógeno en t = 0, ppm
N, concentración de nitrógeno, en ppm
NO, concentración de nitrógeno, en ppm
R, constante de gas universal, J / g mol K
S, concentración de azúcar, g / L
SO, concentración de azúcar, g / L
t, tiempo, hora
T, temperatura, ° C
Tk, temperatura, K
Tr, temperatura de referencia, K
XV, concentración viable de células de levadura, células / L
y, variable dependiente genérica
Y, variable dependiente genérica
YX / N, coeficiente de rendimiento estequiométrico de la biomasa en nitrógeno, no. de células / g N
YE / S, coeficiente de rendimiento estequiométrico de etanol en el azúcar, g de etanol / g de azúcar
Símbolos griegos
β, producción específica de etanol por gramo de azúcar consumido, g etanol g azúcar-1 h-1
βm, tasa máxima de producción específica de etanol, g etanol g azúcar-1 h-1
μ, tasa de crecimiento específica h-1
μm, tasa de crecimiento específica máxima, h-1
1. Introducción

La sidra dura es una bebida alcohólica de manzana elaborada a partir de la fermentación del jugo de manzana. La
sidra dura es popular en Europa y se consumió ampliamente en los Estados Unidos en los siglos XVIII y XIX. Las leyes
de prohibición y la fácil disponibilidad de cerveza después de la guerra civil estadounidense propinaron un golpe al
consumo de sidra. Después de su reintroducción en la década de 1990 en América del Norte, la sidra dura ha crecido
exponencialmente en popularidad. Al mismo tiempo, una combinación de factores ha llevado a un exceso de
producción de manzanas en los EE. UU. (US Apple Association, 2008). Por lo tanto, los productores de manzanas de
Michigan están buscando fabricar productos de valor agregado a partir de su exceso de productos de manzana.

La sidra dura está hecha de manzanas de sidra, que son amargas, picantes y agrias. Sin embargo, América del Norte
solo produce manzanas de postre. En la actualidad, estados como Michigan experimentan un exceso de producción
de manzanas. Las manzanas de postre carecen de los niveles de azúcar, acidez y tanino que se encuentran en las
manzanas de sidra y se consideran inadecuadas para hacer sidra dura. Sin embargo, la economía dicta la fabricación
de sidra dura a partir de manzanas de postre en los Estados Unidos. A medida que aumentan las escalas de
producción de las microcervecerías a escalas más grandes, será necesario estudiar y predecir el rendimiento de la
fermentación. Para este propósito, un modelo que podría predecir los resultados de producción de sidra dura sería
una herramienta útil.

Varios modelos de crecimiento microbiano se han desarrollado en los últimos 40 años (Marin, 1999). Muchos de
estos modelos pueden clasificarse como empíricos. Describen las funciones sigmoidales que se aproximan a las
curvas de crecimiento bacteriano (concentración de células en comparación con el tiempo). Los modelos empíricos
son útiles para correlacionar y predecir una amplia gama de datos de crecimiento de lotes, pero no proporcionan
información sobre los mecanismos subyacentes que controlan el crecimiento celular (Del Nobile et al., 2003). Por el
contrario, los modelos mecanicistas, que pueden ser más complejos desde el punto de vista matemático, ofrecen
una descripción de los fenómenos que intervienen en el crecimiento celular y proporcionan también información
cuantitativa valiosa.

Los modelos mecanísticos generalmente usan expresiones de crecimiento cinético que se han establecido
previamente. Los parámetros cinéticos en estos modelos pueden ser simultáneamente dependientes de las
diferentes prácticas de fermentación de la levadura. Dos de los modelos mecanísticos más recientes en enología han
sido propuestos por Cramer et al. (2002) y Del Nobile et al. (2003). Ambos son modelos mecánicos no estructurados
para la cinética de fermentación del vino y asumen el nitrógeno como el único nutriente limitante del crecimiento.
Sin embargo, Cramer et al. usa la relación de Monod para describir la tasa de crecimiento específica, mientras que
Del Nobile et al. utiliza la "función de inhibición" derivada de Baranyi y Roberts (1993) para describir la tasa de
crecimiento específica. Esta tasa de crecimiento específica explica la dependencia de la tasa de crecimiento de
células de levadura de la concentración de nitrógeno en el mosto.

La mayoría de los modelos mecánicos propuestos para describir la cinética de fermentación de la bebida alcohólica
tienen las siguientes características comunes:

1. El nitrógeno es el nutriente limitante del crecimiento primario para el crecimiento de células de levadura (Bailey y
Ollis, 1986; Cramer et al., 2002; Del Nobile et al., 2003).

2. El consumo de azúcar y la producción de etanol son proporcionales a la concentración viable de células de

levadura (Bailey y Ollis, 1986).

3. La tasa de mortalidad de las células es proporcional solo al contenido de alcohol (Ansaney-Galeote et al., 2001;
D'Amore et al., 1990).

La fermentación de sidra dura es un proceso muy similar a la fermentación del vino. Las fermentaciones lentas e
incompletas son un problema crónico para las industrias del vino y la cerveza (Bisson, 1999; Cramer et al., 2002; Del
Nobile et al., 2003). Los compuestos de nitrógeno pueden ser el factor limitante para el crecimiento y la actividad de
la levadura (Bisson y Butzke, 2000; Cramer et al., 2002; Del Nobile et al., 2003; Malherbe et al., 2004). Se ha
demostrado que la temperatura puede afectar la asimilación y la absorción de nitrógeno y azúcar y, en
consecuencia, alterar la tasa de fermentación (Malherbe et al., 2004; Sablayrolles et al., 1996). Se ha establecido una
relación de Arrhenius entre la temperatura y la tasa de fermentación de etanol (Phisalaphong et al., 2006).

Hasta la fecha, muy pocos investigadores han estudiado la producción de sidra dura a partir de las manzanas de
postre (Wilson et al., 2003). Ninguno de estos estudios ha intentado estudiar la cinética de fermentación del
proceso. La popularidad de la sidra dura continúa creciendo en los EE. UU. Y la producción a gran escala aumentará
la necesidad de pronosticar los resultados de la fermentación. Un modelo mecanicista simple que podría predecir la
cinética de fermentación de la producción de sidra dura, especialmente de manzanas de postre, será útil para
comprender y diseñar procesos.

Por lo tanto, los objetivos de este trabajo son mostrar que un modelo mecanístico basado en la cinética de Monod
puede describir adecuadamente la fermentación de sidra dura de las manzanas de postre y validar la hipótesis de
que los parámetros cinéticos del modelo primario dependen tanto de la temperatura como del contenido inicial de
nitrógeno. descrito por una relación de tipo Arrhenius.

Los parámetros cinéticos de un modelo mecánico (primario) basado en la cinética de Monod se estimaron de forma
no lineal mediante el método de Runge-Kutta para un mejor ajuste a un conjunto de datos experimentales. Estos
parámetros cinéticos se ajustaron a un modelo secundario que proponía una relación log-lineal con el contenido
inicial de nitrógeno y la temperatura. Finalmente, las predicciones del modelo se validaron utilizando un segundo
conjunto de datos experimentales y ecuaciones modelo.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

2.1.1. jugo de manzana

El jugo de manzana Michigan Jonathan se obtuvo en Uncle John's Cider Mill (St. Johns, MI, EE. UU.) Y se almacenó a -
18 ° C en recipientes de plástico de un galón. La concentración aproximada de azúcar del jugo de manzana fue de
120 g / L y la concentración de nitrógeno fue de 45 mg / L. El pH promedio se midió (medidor de pH Corning 5376)
para ser 3,26.

2.1.2. Levadura

Se seleccionó la levadura DV10 Saccharomyces cerevisiae (bayanus) de Lalvin (Lallemand Inc., Rexdale, ON). El jugo
fue inoculado con 0.3 g de peso seco / L de DV10. De acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes, la
levadura no se rehidrató antes de la inoculación. DV10 es una de las cepas más utilizadas para la producción de
champán y es la cepa más recomendada para la producción de sidra y aguamiel. DV10 tiene una fuerte cinética de
fermentación en un amplio rango de temperatura (10-35 ° C) con demandas relativamente menores de oxígeno y
nitrógeno.

2.1.3. Suplementos de nitrógeno

El jugo de manzana contiene considerablemente menos nitrógeno amino libre que el mosto de uva o la cerveza y
esta falta de nitrógeno puede poner un límite severo al crecimiento de la levadura. Por lo tanto, la práctica común es
elevar el nivel a aproximadamente 100 mg de nitrógeno por litro (Lea y Drilleu, 2004), lo que se puede lograr
mediante la adición de 250 ppm de sulfato de amonio o fosfato. 100 ppm de fosfato diamónico (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO), de ahora en adelante referido como DAP, proporciona 21.1 mg / L de nitrógeno atómico, totalmente
asimilable (Malherbe et al., 2004). El límite permisible para la suplementación de nitrógeno en forma de DAP en los
EE. UU. Es de 960 mg / L de DAP, que corresponde a 203 mg de nitrógeno / L (203 ppm).
2.1.4. Experimentación

El procedimiento experimental se describe en la figura 1. El jugo de manzana Jonathan congelado almacenado en

envases de 1 galón se descongeló. El jugo se esterilizó mediante la adición de 50 ppm de metabisulfito de potasio
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se dejó reposar durante 24 h. El metabisulfito de potasio inhibe el crecimiento
de levaduras y bacterias en descomposición, lo que permite que el inóculo de levaduras de fermentación deseables
(como S. cerevisiae o uvarum) se multiplique y domine la conversión de azúcar en alcohol. Para el jugo de manzana
con un pH de 3.0 a 3.3, se recomienda la adición de 50-75 ppm de metabisulfito de potasio (Lea y Drilleu, 2004).
Después de 24 h, el jugo sulfitado se transfirió a matraces de 500 ml llenos hasta el nivel de 400 ml y se inocularon
con la levadura DV10. Todos los matraces estaban equipados con cerraduras de fermentación (Michigan Brewing
Company, Webberville, MI). Las muestras de control contenían jugo de manzana sulfitado pero no inóculo de
levadura agregado o DAP. Los matraces de fermentación se almacenaron en incubadoras con control de
temperatura durante la experimentación. Los matraces también se agitaron mínimamente a 60 rpm usando tablas
de agitador de matraz para la uniformidad de las muestras y su temperatura.

Se seleccionaron cuatro niveles de nitrógeno inicial y tres niveles de temperatura como condiciones de tratamiento.
Los cuatro niveles de nitrógeno se seleccionaron para representar el rango de nitrógeno inicial total entre la
concentración residual de jugo de manzana de 45 ppm hasta el límite legalmente permisible de 200 ppm (Lea y
Drilleu, 2004; Malherbe et al., 2004). Las fermentaciones tradicionales de sidra dura se llevan a cabo a temperaturas
frescas de> 10 ° C y se prefiere un rango de 10-25 ° C (Lea y Drilleu, 2004). Por lo tanto, se seleccionaron las tres
temperaturas, 11 ° C, 17 ° C y temperatura ambiente de 22 ° C.

El nitrógeno en forma de fosfato diamónico (0, 100, 300, 600 ppm) se añadió al jugo. Este zumo de manzana
inoculado, suplementado con nitrógeno se dejó fermentar a 11, 17 y 22 ° C. Cada combinación de nitrógeno inicial
de temperatura representaba un "tratamiento". Por lo tanto, hubo 12 tratamientos de muestra. Cada tratamiento
se ejecutó por triplicado. Las muestras se tomaron a diversos intervalos durante 30 días, se filtraron, se extrajeron y
se almacenaron a 0 ° C para su posterior análisis.

2.2. Ensayos de concentración celular, azúcar, etanol y nitrógeno

Las concentraciones de las cuatro variables dependientes se analizaron de la siguiente manera:

2.2.1. Concentración celular

Los números de células viables se estimaron microscópicamente usando una cámara de recuento de líneas brillantes
de tipo Neubauer (Hausser Scientific, Horsham, PA). Seis réplicas de cada muestra (50 μL) se extrajeron en pocillos
de una placa de 96 pocillos. A cada pocillo, se añadieron 50 μl de azul tripán al 0,4% (p / v) para teñir las células no
viables y asegurar que solo se enumeraran las células viables (Nielsen et al., 1991).
2.2.2. Nitrógeno

El nitrógeno que pueden utilizar las células de levadura para su crecimiento o mantenimiento se conoce como
nitrógeno "asimilable". El nitrógeno asimilable en la sidra está en forma de iones de amonio y compuestos de
nitrógeno α-amino libres. Es necesario estimar la concentración de estas dos formas ya que representan todos los
compuestos nitrogenados totales que son utilizados directamente por la levadura para el crecimiento.

La concentración de iones amonio se determinó usando un electrodo selectivo de iones amonio (Cole-Parmer
Instrument Co., Vernon Hills, IL). El nitrógeno α-amino se determinó usando el método enzimático de Dukes y
Butzke (1998). El método utiliza un procedimiento espectrofotométrico para medir la fracción de nitrógeno amino
primario y así cuantificar los niveles de compuestos nitrogenados asimilables de levadura en la sidra. El ensayo se
basa en la derivatización de grupos amino primarios con un reactivo O-ftaldialdehído / N-acetil-N-cisteína (OPA /
NAC). Los derivados de isoindol resultantes se forman rápidamente y son estables (absorbancia) a 335 nm.

2.2.3. Azúcar

Los azúcares individuales se midieron usando un sistema de HPLC Waters 6100 con columna de exclusión de iones
Hamilton PRP-X300. El aparato de HPLC consistió en 717 Autosampler, un detector de índice de refracción 996 y el
sistema de administrador Breeze 32. El método usó una fase móvil que contenía ácido sulfúrico 1 mM. El volumen
de inyección de muestra fue de 20 ml, mientras que las condiciones de elución incluyeron un gradiente isocrático y
un caudal de 2 ml / min. La columna y el detector estaban ambos a temperatura ambiente (~25 ° C). Se controlaron
los picos estándar de glucosa, fructosa y sacarosa (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) a temperatura
ambiente de la columna. Las muestras se cargaron en la HPLC en un vial de vidrio Waters de 1 ml con tapa a presión
de polietileno durante un tiempo de ejecución de 5 minutos. Las muestras de jugo de manzana y sidra dura se
enriquecieron con glucosa para validar el proceso anterior.

2.2.4. Etanol

El método para medir la concentración de etanol utilizó una fase móvil que contenía ácido sulfúrico 1 mM. El
volumen de inyección de muestra fue de 10 ml mientras que las condiciones de elución fueron las siguientes:
gradiente isocrático, velocidad de flujo de 1 ml / min. La columna y el detector estaban ambos a temperatura
ambiente (~25 ° C). Se midieron los picos estándar de etanol puro al 99,9% (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis,
MO) a temperatura ambiente de la columna para desarrollar una curva estándar. Las muestras de jugo de manzana
y sidra dura fueron enriquecidas con etanol para validar el proceso anterior.

Por lo tanto, para cada uno de los 12 tratamientos, el cambio en las cuatro variables dependientes se midió a lo
largo del tiempo para las muestras de fermentación. Una ejecución exitosa del proceso anterior arrojó un conjunto
de datos y se repitió hasta que se obtuvieron múltiples conjuntos de datos experimentales. Uno de estos conjuntos
de datos se etiquetó como 'Conjunto de datos de estimación de parámetros' y se utilizó para el proceso de
estimación de parámetros no lineales. Otro conjunto de datos más grande fue etiquetado como el "conjunto de
datos de validación del modelo" utilizado para validar las predicciones del modelo.

2.3. Modelo de desarrollo

Un modelo mecanicista simple que describe la cinética de las concentraciones de células de levadura, nitrógeno
total, azúcar y etanol en términos de cuatro ecuaciones diferenciales ordinarias se aplicó al proceso de fermentación
de sidra dura (Bailey y Ollis, 1986; Cramer et al., 2002). La tasa de crecimiento de los microorganismos está dada
por:

(1) donde Xv = concentración de células de levadura viable, células / L, μ =

velocidad de crecimiento específica (h-1), kd = índice de mortalidad (h-1).
Como el nitrógeno es el nutriente limitante de la velocidad, el crecimiento celular fue proporcional a la
concentración total de nitrógeno y se describió mediante la ecuación de Monod. De la misma forma que la isoterma
de adsorción de Langmuir y la ecuación de velocidad estándar para reacciones catalizadas por enzimas con un solo
sustrato (Henri, 1902; Michaelis y Menten, 1913) la ecuación de Monod establece que

(2) donde μm = tasa de crecimiento específico máximo (h-1), N = concentración de nitrógeno (ppm),
KN = constante de Monod para nitrógeno (ppm)

La tasa de consumo o agotamiento de nitrógeno viene dada por:

(3) donde YX / N = Rendimiento co-eficiente de la biomasa en el nitrógeno.

La tasa de agotamiento del azúcar en la sidra viene dada por:

(4) donde YE / S = Coeficiente de rendimiento de etanol sobre el azúcar y β = tasa de producción

específica de etanol, (g de etanol / hora-célula) que se describe por:

(5) donde βm = tasa máxima de producción de etanol específico, (g de etanol / hora-célula), S =

concentración de azúcar (g / L) y KS = constante de Monod para el azúcar (g / L). Esta ecuación supone que el
transporte de azúcar se ve facilitado por la difusión, que a su vez se rige por la concentración de azúcar y etanol
(Cramer et al., 2002).

La tasa de producción de etanol está dada por:

(6)

El modelo de fermentación se define como el conjunto de ecuaciones de (1) - (6) que se conoce como el modelo
primario. Por lo tanto, es un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias, acopladas, no lineales con siete
parámetros.

2.4. Procedimiento para evaluación de parámetros

2.4.1. Paso 1: Estimaciones iniciales para los parámetros

El procedimiento para la evaluación de parámetros se describe en la Fig. 2. El modelo primario contiene siete
parámetros: μm, kd, βm, KN, KS, YE / S e YX / N. Dos de estos parámetros kd y YE / S se fijaron como constantes. El
coeficiente de rendimiento estequiométrico de etanol sobre el azúcar, YE / S (g de etanol / g de azúcar) puede
obtenerse a partir de cálculos estequiométricos simples y experimentos. El valor de este parámetro, YE / S (g de
etanol / g de azúcar), se fijó en 0,38. La estimación inicial para la constante de la tasa de mortalidad, kd se obtuvo de
la literatura (Cramer et al., 2002). Su valor fue fijado en 0.005. Este valor no puede calcularse fácilmente a partir de
datos experimentales y hay poca literatura previa disponible sobre el tema. kd se observó que tiene un efecto
menor en la predicción de otras variables dependientes. Las estimaciones iniciales de los cinco parámetros restantes
se tomaron de la literatura previa y los datos experimentales.
2.4.2. Paso 2: Modelo primario y estimación no lineal de parámetros

Las estimaciones iniciales de los parámetros se sustituyeron en el modelo primario. Se escribió un programa en
MATLAB © (Mathworks Inc, Natick, MA) para resolver el conjunto de modelos de cuatro ecuaciones diferenciales
utilizando simultáneamente la fórmula de Runge-Kutta de cuarto orden utilizando el solucionador ode45. ode45 usa
un método adaptativo de Runge-Kutta de cuarto y quinto orden que requiere que el error entre los métodos de 5to
y 4to orden sea inferior a un cierto límite.

Otro programa escrito usando MATLAB © utilizó regresión no lineal para iterar y estimar los parámetros para el
mejor ajuste (minimización de mínimos cuadrados) a los datos experimentales del 'conjunto de datos de estimación
de parámetros'. Para cada iteración, Runge-Kutta se usó para resolver con los nuevos parámetros. Por lo tanto, se
obtuvieron los parámetros del modelo primario estimados no lineales. Para cada condición inicial de temperatura-
nitrógeno, las variables dependientes se representaron frente al tiempo. Esta gráfica incluye los datos
experimentales, las predicciones del modelo y las bandas asintóticas de confianza y predicción del 95%.

El proceso de estimación de parámetros no lineales arrojó 12 conjuntos de estimaciones de parámetros. Además del
problema de la gran cantidad de parámetros, el uso del modelo estaría restringido solo a las tres temperaturas y los
cuatro niveles de nitrógeno utilizados en los experimentos actuales. Para superar estas limitaciones y disminuir el
número total de parámetros, se propuso un modelo secundario.

2.4.3. Modelo secundario y estimación lineal de los parámetros de Arrhenius

Muchos estudios muestran el efecto Arrhenius de la temperatura en fermentaciones (Carvalheiro et al, 2008;.
Dalsenter et al, 2005;.. Phisalaphong et al, 2006). Al igual que otros investigadores, hemos observado que la tasa de
crecimiento específico no solo depende de la temperatura sino también del nivel de nitrógeno (Cramer et al., 2002;
Dalsenter et al., 2005). Por lo tanto, aunque el contenido de nitrógeno inicial es un valor inicial de eq. (2), es
necesario estudiar el efecto combinado de estas variables en el proceso de fermentación (Dragone et al., 2004). Se
hipotetiza que los parámetros del modelo primario tienen una relación de Arrhenius con la temperatura de
fermentación y el contenido de nitrógeno inicial. Esta relación se puede describir en términos de un modelo
secundario de la siguiente manera: k = f (T, Ni) o

(7) donde k = cualquier parámetro del modelo primario no

estimado linealmente obtenido del paso (2), T = temperatura a la que se evaluó el parámetro (K), Ni = nivel de
nitrógeno inicial de referencia arbitraria en el que se evaluó el parámetro (ppm), Tr = temperatura de referencia
arbitraria (K), ET = energía de activación para efecto de temperatura (J / g mol) , EN = energía de activación para
efecto nitrógeno (J / g mol), kr = valor del mismo parámetro a temperatura de referencia y nitrógeno inicial de
referencia, R = constante de gas universal, 8,31 JK-1 mol-1.

Cada estimación de parámetro de modelo primario no lineal del Paso (2) se ajustó a la ecuación anterior. (7) usando
regresión lineal múltiple en MS Excel ©. Esta estimación lineal arrojó los parámetros kr, ET / R y EN / R para cada
parámetro de modelo primario no estimado linealmente. Dado que cada parámetro del modelo primario, k = f (T,
Ni), los 60 parámetros se redujeron a 15 (5 parámetros por 3) y el uso del modelo ya no se restringió a las 12
condiciones de tratamiento. Por lo tanto, el modelo secundario permite la predicción de la cinética de fermentación
para cualquier temperatura y nivel de nitrógeno inicial en el rango estudiado en este documento.

2.4.4. Paso 4: validación del modelo

Los 15 parámetros linealmente estimados se sustituyeron en el modelo primario para obtener las predicciones del
modelo para las cuatro variables dependientes (Xv, N, S, E) a lo largo del tiempo para cada tratamiento. Estos
valores predichos de Xv, N, S y E se compararon con un nuevo conjunto de datos experimentales, el conjunto de
datos de validación del modelo. Se obtuvo un gráfico de los valores predichos versus observados (conjunto de datos
de validación del modelo) y los errores cuadráticos medios (RMSE) para cada una de las 4 variables dependientes Xv,
N, E y S. La precisión de las predicciones del modelo también se estudió a partir de predicho frente a los datos
observados y residuales.

3. Resultados y discusión

3.1. Paso 1: Estimaciones iniciales para los parámetros

La Tabla 1 proporciona las estimaciones iniciales para los siete parámetros. Ellos se obtuvieron a partir de la
literatura y experimentales de datos como se describe en la etapa (1) anterior en el procedimiento para la
estimación de parámetros.

Tabla 1. Estimaciones iniciales para los parámetros del modelo para T = 22 ° C y N = 65 ppm (DAP = 110 ppm.
Parámetro βm (g YE/S (fijo) (g de YX/N (Número
−1 kd(fijo)
del modelo μm(h ) etanol KN(mg N/L) KS(g azúcar/L) etanol / g de de
(h−1)
primario celular−1 h−1) azúcar) células/mg N)
Estimación 2.45 0.005 1.20E-09 200 40 0.38 2.00E+06
inicial
2. Paso 2: estimación de parámetros no lineales para el modelo primario.
La rutina de regresión no lineal se aplicó a todas las condiciones de tratamiento y se obtuvieron las estimaciones de
los parámetros no lineales. La Fig. 3 es un ejemplo del resultado de la estimación no lineal para una de las variables
dependientes, azúcar (g / L) en T = 22 ° C y Ni = 65 ppm (DAP = 100 ppm). Muestra un diagrama de datos observados
y las predicciones de mejor ajuste obtenidas del modelo. Las bandas de confianza asintóticas (95% C.B.) y las bandas
de predicción del 95% (95% P.B.) también se representan. En la Fig. 3, la banda formada por dos líneas delgadas a
cada lado de la línea de predicción del modelo representa la banda de confianza del 95% para la línea de predicción
del modelo. Las líneas gruesas forman una banda fuera de esta banda de confianza. Esta banda representa la banda
de predicción del 95%, es decir, representa la región en la que los puntos de datos predichos por el modelo se
encontrarían el 95% del tiempo.

Fig. 3. Estimación de parámetros

no lineales: nitrógeno pronosticado y observado para T = 22 ° C y N = 65 ppm (DAP = 100 ppm).

3. Paso 3: Estimación de parámetros lineales para el modelo secundario

Los parámetros predichos (Tabla 2) para todas las condiciones de temperatura e nitrógeno inicial muestran que la
tasa de crecimiento específica máxima, μm, no muestra un efecto significativo (P ⩾ 0.12) a partir del nitrógeno
inicial, sin embargo, se encontró que el efecto de la temperatura era significativo. El coeficiente de rendimiento de
la biomasa en nitrógeno, YX / N, no mostró un efecto significativo de la temperatura o el contenido inicial de
nitrógeno. La falta de puntos de datos durante la fase exponencial del crecimiento de la levadura y los errores en el
análisis de la muestra pueden haber afectado las predicciones del modelo para el crecimiento celular (Fig. 4). βm, KN
y KS mostraron un efecto significativo de la temperatura y el nitrógeno inicial.

Tabla 2. Coeficientes estimados linealmente del modelo secundario Arrhenius ajustado

Std error(error
Coeficientes Menor 95% Superior 95% P-valor
estándar)
Parámetro del modelo primario: tasa de crecimiento específica máxima , μm (h−1); el rango de validez de μm es
0.233–5.977 h−1
ln kr 0.51303 0.17927 0.10749 0.91856 0.018
ET/R −19707 2777.4 −25990 −13424 5.7 × 10−05
EN/R −40.609 24.0389 −94.988 13.7712 0.12
Parámetro del modelo primario: tasa máxima de producción específica de etanol, βm (g etanol / célula-hora); el
rango de validez de βm es 3.33 × 10−10–3.54 × 10−09 g de etanol / célula-hora
ln kr −20.157 0.19019 −20.588 −19.727 3 × 10−15
ET/R −7609.7 2946.61 −14275 −944.01 0.03
EN/R −84.373 25.5035 −142.07 −26.681 0.009
 Parámetro del modelo primario: Constante Monod para Nitrógeno, KN (ppm); rango de validez de KN es 209.71–
11170.23 mg/L
ln kr 8.16322 0.17806 7.76042 8.56601 5.6 × 10−12
ET/R −12287 2758.64 −18528 −6046.7 0.0016
EN/R −146.15 23.8765 −200.17 −92.141 0.00018
Parámetro del modelo primario: Constante Monod para azúcar, KS (g/L); rango de validez de KS es 3.150–291 g/L
ln kr 4.25128 0.32425 3.51778 4.98479 3.6 × 10−07
ET/R −16989 5023.56 −28353 −5624.6 0.008
EN/R −142.03 43.4798 −240.39 −43.674 0.01
Parámetro del modelo primario: Coeficiente de rendimiento de la biomasa en nitrógeno, YX/N ; el rango de validez
de YX/N es 2.84 × 10+06–75 × 10+06 No. de células / mg N h
ln kr 15.2493 0.22498 14.7403 15.7582 1.7 × 10−13
ET/R −5362.9 3485.52 −13248 2521.9 0.16
EN/R 32.0288 30.1678 −36.215 100.273 0.16

Fig. 4. Validación del modelo para T = 22 ° C y Ni = 165 ppm (DAP = 600 ppm).

3.4. Paso 4: validación del modelo

La Fig. 4 muestra valores predichos y observados de células de levadura, nitrógeno, etanol y concentraciones de
azúcar frente al tiempo para la fermentación de la sidra a T = 22ºC y Ni = 165 ppm (DAP = 600 ppm). Las predicciones
se basaron en parámetros estimados a partir del "conjunto de datos de estimación de parámetros" (~110 puntos de
datos) mientras que los valores experimentales son del "conjunto de datos de validación del modelo" (~250 puntos
de datos).
Como se puede ver en la Fig. 4, el modelo captó la tendencia para la producción de etanol, E, consumo de nitrógeno,
N y azúcar, S, con una precisión razonable para T = 22 ° C y Ni = 165 ppm (DAP = 100 ppm). El modelo cuenta con
buenos datos de crecimiento y las tasas de crecimiento. Como se mencionó anteriormente, es fundamental
recopilar más datos en la fase de crecimiento exponencial para obtener predicciones del modelo más precisas.

La suplementación de nitrógeno y la temperatura de fermentación más alta pueden producir sidra dura con niveles
de etanol tan altos como 6.5% (> 50 g / L para un YE / S = 0.38 g de etanol / g de azúcar). Esta observación es
importante ya que una de las razones por las que las manzanas de postre se consideran inadecuadas para la
producción de sidra es el bajo contenido de alcohol (<5%) producido al final de la fermentación (Fabricant, 1997).

El nitrógeno fue el nutriente limitante clave y la suplementación del jugo de manzana con la cantidad apropiada de
nitrógeno en forma de fosfato diamónico ayudó a lograr mejores rendimientos de fermentación. Se ha
recomendado que las fermentaciones de sidra duras comiencen con un nivel de nitrógeno de 100 ppm para obtener
buenos resultados (Lea y Drilleu, 2004). Esto se demostró que era cierto en el estudio actual. Los niveles iniciales de
nitrógeno de menos de 100 ppm dieron fermentaciones incompletas o inactivas como se puede ver en la figura 4,
donde incluso a la temperatura alta (T = 22 ° C), queda algo de azúcar residual en el producto. Por lo tanto, el
modelo también se puede usar para predecir fermentaciones lentas o estancadas.

El efecto de la temperatura en la fermentación de la sidra dura también fue distinto. A T = 11 ° C, las fermentaciones
lentas eran una norma. Aunque las fermentaciones a esta temperatura pueden darnos niveles más bajos de etanol
en la sidra dura final, otros subproductos y azúcar residual pueden ayudar a mejorar los atributos sensoriales (como
aroma, perfil de sabor y efecto espumoso debido a la liberación de CO2) del producto final. De manera similar,
aunque las fermentaciones a temperaturas más altas como T = 22 ° C pueden producir una fermentación más rápida
y completa que aquellas con niveles de nitrógeno más bajos, el efecto sobre las características sensoriales de tales
condiciones de fermentación puede no ser positivo (observaciones no publicadas).

Figs. 5-8 muestran los datos observados versus predichos para las variables dependientes, azúcar, nitrógeno, etanol
y concentración de células de levadura a T = 22 ° C y Ni = 65 ppm (DAP = 100 ppm). De la Fig. 5, se puede ver que hay
una alta correlación (RMSE = ± 11.93 g / L, R^2 = 0.91) entre los valores predichos y observados para el consumo de
azúcar. Este valor de RMSE es inferior al 10% del rango total de concentración de azúcar de 0-120 g / L. Figs. 6 y 7
muestran que el modelo dio predicciones satisfactorias para otras dos variables dependientes, el consumo de
nitrógeno (RMSE = ± 10.98 mg / L, R^2 = 0.95) y la producción de etanol (RMSE = ± 5.4 g / L, R^2 = 0.88). Las
concentraciones de células de levadura no se predijeron con precisión (RMSE = ± 1,52 × 10 + 08, R^2 = 0,38) como se
puede ver en la Fig. 8. Esto no evita la usabilidad del modelo ya que las predicciones para otras tres variables
dependientes, que pueden ser más crucial para los fabricantes de sidra dura, fueron razonablemente precisos. Como
se mencionó anteriormente, la falta de puntos de datos durante la fase exponencial del crecimiento de la levadura
puede haber afectado las predicciones del modelo.

Fig. 5. Validación del modelo: comparación de azúcar

predicha y observada, número total de puntos observados = 672.
 Fig. 6. Validación del modelo para nitrógeno, (N)
número total de puntos de datos = 575.

Fig. 7. Validación del modelo: comparación de etanol

predicho y observado, número total de puntos de datos = 510.

Fig. 8. Validación del modelo para

la concentración de células viables (XV), células / ml. Número total de puntos de datos = 600.

Los residuos de valores observados menos pronosticados para el nitrógeno, el azúcar, el etanol y la concentración
celular se muestran en las Figs. A1-A4. La media de los residuos fue aproximadamente cero para todas las variables
dependientes. Por ejemplo, la Fig. A3 muestra que el modelo es capaz de predecir las concentraciones de azúcar al
inicio y al final de las fermentaciones con mayor precisión que en los puntos de tiempo entre ellas. Los residuos
tienen una tendencia a estar en el lado positivo (con grandes valores atípicos negativos) que muestran que el
modelo tiende a subestimar el consumo de azúcar ligeramente.
Los procesadores deberían poder estimar el estado de la fermentación usando factores bajo su control y luego
modificar o ajustar usando cantidades que pueden cambiar y permitir por ley, es decir, temperatura y nitrógeno
inicial (Malherbe et al., 2004). Conociendo el contenido inicial de nitrógeno del mosto de manzana y la temperatura
de fermentación, un elaborador puede usar el modelo para predecir los niveles finales de etanol y azúcar, así como
también si la fermentación es lenta o atascada. Este conocimiento permitirá a un procesador complementar la
fermentación con una cantidad conocida de nitrógeno amoniacal y ajustar la temperatura para lograr un producto
final con los niveles de dulzura y alcohol deseados. El modelo presentado en este documento es un primer paso
hacia el desarrollo de simuladores de fermentación más precisos y fáciles de usar.

4. Resumen

Un modelo mecánico simple basado en la cinética de Monod para predecir la cinética de fermentación se aplicó con
éxito a la sidra dura hecha de manzanas de postre. El proceso de ajuste de datos no lineales utilizó el cuarto orden
de Runge-Kutta y las funciones disponibles en MATLAB © para estimar los parámetros del modelo. El estudio actual
demostró que las manzanas de postre (en lugar de solo manzanas de sidra) pueden usarse para producir sidra dura
con concentraciones de etanol superiores al 6,5% y que se puede lograr una fermentación más completa a
temperaturas más altas y suplementando nitrógeno al inicio de la fermentación. Usando datos generados a partir de
la experimentación simple, el modelo propuesto puede usarse con éxito razonable para predecir el efecto del
cambio en el contenido inicial de nitrógeno y la temperatura en la cinética de fermentación de la producción de
sidra dura. La naturaleza mecanicista del modelo ayuda a explicar y estudiar el proceso de fermentación. Aunque el
modelo necesita mejoras, proporciona información valiosa sobre la fermentación de la sidra y un marco, del cual se
pueden establecer modelos con mejores capacidades predictivas.

Reconocimiento

Los autores agradecen al Dr. Patrick Oriel, a la Dra. Janice Harte, a la Sra. Mavis Tan, al Comité de Apple de Michigan,
al Desarrollo Rural del USDA y al Cider Mill del Tío John por su apoyo a este proyecto de investigación.