UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ZONA XALAPA

PROGRAMA EDUCATIVO:

INGENIERÍA AMBIENTAL

“Pre tratamiento químico e hidrólisis enzimática de pulpa de café

para obtención de azúcares reductores totales.”

TESIS

Que para acreditar la Experiencia educativa:

Experiencia Recepcional

P r e s e n t a:

“Edgar Arturo Camacho Villanueva”

Asesor:

Dr. Enrique Alarcón Gutiérrez.

Xalapa, Ver. Septiembre de 2015.

I
 AGRADECIMIENTOS

A mis padres por el apoyo dado a través de la duración de mis estudios.

Al Dr. Enrique Alarcón, por su apoyo en la dirección de mi tesis.

A la Dra. Beatriz Gutiérrez, del Instituto Tecnológico de Tierra Blanca, por su

apoyo brindado en la realización de algunos análisis.

Al Dr. Epifanio Morales Zarate y la Dra. Yolanda Cocotle por los consejos
brindados a lo largo de mi tesis.

A mis compañeros Gaby, Gerardo, Anahí, Evelyn por el apoyo en el laboratorio y

hacer el trabajo mas divertido.

Al instituto de biotecnología y ecología aplicada (INBIOTECA) por permitirme

realizar mi trabajo de tesis en sus instalaciones.

Se agradece el apoyo otorgado mediante el proyecto M13A02 Pretratamiento

biológico de material lignocelulósico (bagazo de caña de azúcar) y fermentación-
sacarificación simultánea para una producción óptima de bioetanol, en el marco
del Acuerdo México-Francia SEP-CONACYT-ANUIES-ECOS, convocatoria
2013.

II
ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................V

ÍNDICE DE TABLAS .............................................................................................VI

RESUMEN ................................................................................................................ 1

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 2

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................... 2

3. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 3

4. MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 4

4.1 ESTRUCTURA QUÍMICA DE LA BIOMASA LIGNOCELULÓSICA ..................................... 4
4.2. PRODUCCIÓN DE CAFÉ EN MÉXICO. .................................................................... 4
4.3 COMPOSICIÓN ESTRUCTURAL DEL CAFÉ .............................................................. 6
4.4 PULPA DE CAFÉ .................................................................................................. 7
4.5 PRE TRATAMIENTO DE MATERIA LIGNOCELULÓSICA ............................................... 8
4.5.1 PRE TRATAMIENTO FÍSICO .............................................................................. 10
4.5.2 PRE TRATAMIENTO QUÍMICO........................................................................... 10
4.5.2.1 PRE TRATAMIENTO ALCALINO ...................................................................... 10
4.5.2.2 PRE TRATAMIENTO ÁCIDO............................................................................ 11
4.4.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE MATERIA LIGNOCELULÓSICA ................................... 13

5. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 15

6. OBJETIVOS ........................................................................................................ 16
6.1 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 16
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 16

7. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 16

7.1 RECOLECCIÓN Y TRATAMIENTO PREVIO DE LA PULPA DE CAFÉ .............................. 17
7.2 PRE TRATAMIENTO DE PULPA ............................................................................ 18
7.2.1 FÍSICO .......................................................................................................... 18

III
7.2.2 QUÍMICO ....................................................................................................... 18
7.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA .................................................................................... 18
7.4 DETERMINACIÓN DE RENDIMIENTOS ................................................................... 19
7.5 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES ..................................................... 19
7.6 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ........................................................... 20
7.7 ACTIVIDAD DE CELULASAS TOTALES ................................................................... 20
7.8 ACTIVIDAD ESPECÍFICA ...................................................................................... 21
7.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS .................................................................................... 21

8. RESULTADOS ..................................................................................................... 21
8.1 PRE TRATAMIENTO ALCALINO ............................................................................. 21
8.2 PRE TRATAMIENTO ÁCIDO .................................................................................. 24
8.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA .................................................................................... 27
8.3.1 A PARTIR DEL PRE TRATAMIENTO ALCALINO ..................................................... 27
8.3.2 A PARTIR DEL PRE TRATAMIENTO ÁCIDO .......................................................... 30
8.4 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS Y CELULASAS ............................................................... 32

9. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 33

10. CONCLUSIONES ................................................................................................ 36

11. RECOMENDACIONES ......................................................................................... 37

12. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 38

ANEXO.1 CURVA PATRÓN DE AZÚCAR ...................................................................... 42

ANEXO.2 TAMPÓN CITRATO ................................................................................. 43

 

IV
ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. PRODUCCIÓN DE CAFÉ EN MÉXICO. ........................................................... 5

FIGURA 2. MAYORES PRODUCTORES DE CAFÉ EN VERACRUZ. .................................... 5
FIGURA 3. COMPOSICIÓN DEL FRUTO DE CAFÉ . .......................................................... 7
FIGURA. 4 DIAGRAMA DE LA METODOLOGÍA. ............................................................. 17
FIGURA 5. CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES DESPUÉS DEL
PRE TRATAMIENTO ALCALINO. .................................................................. 22
FIGURA 6. CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES DESPUÉS DEL
PRE TRATAMIENTO ÁCIDO. ...................................................................... 25

FIGURA 7. GENERACIÓN DE ART DURANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA, POSTERIOR

AL PRE TRATAMIENTO ALCALINO.............................................................. 28

FIGURA 8. RESULTADOS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA POSTERIOR AL

TRATAMIENTO CON ÁCIDO. ..................................................................... 30
FIGURA 9. A) PROTEÍNAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ALCALINO,
B) CELULASAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ALCALINO,

C) PROTEÍNAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ÁCIDO Y

D) CELULASAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ÁCIDO........................ 32

V
ÍNDICE DE TABLAS

TABLA 1. CONSTITUYENTES DE PAREDES CELULARES Y POLISACÁRIDOS

ESTRUCTURALES EN LA PULPA DE CAFÉ.. ....................................................... 8

TABLA 2. CONTENIDO DE OTROS COMPUESTOS EN LA PULPA DE CAFÉ.. .......................... 8

TABLA 3. TIPOS DE PRE TRATAMIENTO ......................................................................... 9

TABLA 4. PARÁMETROS DE PRE TRATAMIENTOS USADOS PARA DIVERSOS SUSTRATOS ... 12

TABLA 5. EJEMPLOS DE ENZIMAS USADAS PARA HIDRÓLISIS. ....................................... 13

TABLA 6. ANÁLISIS DE VARIANZA DE DOS VÍAS DEL PRE TRATAMIENTO NaOH. ............... 22

TABLA 7. RENDIMIENTOS DE CONVERSIÓN DEL PRE TRATAMIENTO ALCALINO. ................ 23

TABLA 8. ANÁLISIS DE VARIANZA DE DOS VÍAS DEL PRE TRATAMIENTO H2SO4. .............. 26

TABLA 9. RENDIMIENTOS DE CONVERSIÓN DEL PRE TRATAMIENTO ÁCIDO. ..................... 27

TABLA 10. ANÁLISIS DE VARIANZA DE UNA VÍA DE LA HIDRÓLISIS ALCALINA. ................... 29

TABLA 11. RENDIMIENTOS DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DESPUÉS DEL

PRE TRATAMIENTO CON NaOH. .................................................................. 29

TABLA 12. ANÁLISIS DE VARIANZA DE UNA VÍA DE LA HIDRÓLISIS POSTERIOR AL

PRE TRATAMIENTO ÁCIDO. .......................................................................... 31

TABLA 13. RENDIMIENTOS DE CONVERSIÓN DURANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL

PRE TRATAMIENTO CON H2SO4. ................................................................. 31

VI
Resumen

La lignocelulosa es el principal componente de la pared celular de las plantas, se

han desarrollado diversos métodos que mejoran la hidrólisis de la lignocelulosa,
como los pre tratamientos fisicoquímicos y biológicos, con la finalidad de remover
la lignina, hidrolizar la hemicelulosa a azúcares fermentables, y reducir la
cristalinidad de la celulosa para liberar la glucosa. Los azúcares reductores (ART),
como la glucosa, el gliceraldehido, la galactosa, la xilosala y la celobiosa, se
pueden obtener de prácticamente cualquier residuo lignocelulósico como la pulpa
de café. La pulpa de café representa el 56% del volumen del fruto y el 40% del
peso seco del grano. Para la generación de ART a partir de pulpa de café, es
necesario un tratamiento físico, químico, biológico o una combinación de ellos; lo
cual permite un rompimiento de los polímeros orgánicos para una posterior
generación de azúcares mediante una hidrólisis enzimática. El objetivo de este
trabajo fue obtener al menos 50% de rendimiento de producción de azúcares
reductores totales, mediante un pre tratamiento de tres etapas: físico, químico y
enzimático de la pulpa de café. La pulpa fue sometida a procesos de
pretratamiento con hidroxido de sodio y ácido sulfúrico (0, 0.5,1,1.5 y 2%) a
tiempos de 5,15,30 y 60 minutos y a hidrólisis enzimatica con celulasas de
Trichoderma reseei. Se realizaron experimentos bifactoriales para el
pretratamiento y monofactoriales para la hidrólisis con la finalidad de determinar
las condiciones adecuadas para la mejor generación de ART. Los resultados
indican que con el pre tratamiento alcalino seguido de la hidrólisis se liberaron
6.32 g/L de ART con un rendimiento de conversión del 284.65%; y con el pre
tratamiento ácido, seguido de la hidrólisis enzimática, se liberó mayor cantidad de
azúcares reductores obteniendose 8.91 g/L, con un rendimiento de conversión del
135.7%; siendo ambos tratamientos superiores al 50% de rendimiento de
conversión que se esperaba obtener.  
 

1
1. Introducción

Todos los monosacáridos y algunos disacáridos, con un aldehído o grupo

cetónico libre, pueden ser oxidados, causando la posterior reducción de otras
sustancias; por lo que son llamados azúcares reductores. Dentro de ellos están la
glucosa, el gliceraldehido, la galactosa, la xilosa, la maltosa, la lactosa y la
celobiosa, entre otros. Los azúcares reductores se pueden obtener de diferentes
sustratos orgánicos como el bagazo de caña de azúcar, la paja de trigo, el lirio
acuático, la pulpa de café, y prácticamente cualquier residuo lignocelulósico.
Durante el proceso de beneficiado de café se generan diferentes residuos; por lo
que se estima que menos del 5% de la biomasa generada se aprovecha en la
elaboración de la bebida (Gualtieri et al., 2007), el resto queda en forma residual
representado en materiales lignocelulósicos como hojas, ramas, tallos, pulpa o
exocarpio del fruto, que representa aproximadamente el 44% del fruto fresco
(Pandey et al., 2000) y mucílago, que representa cerca del 15% del peso del fruto
fresco (Rodríguez y Zambrano, 2010). Se ha calculado que la pulpa de café tiene
un contenido de azúcares cercano al 17%, en base seca (Rodríguez y Zambrano,
2010) por lo que representa una fuente potencial para generar azúcares
reductores totales que puedan ser aprovechados en procesos posteriores.

El objetivo de este trabajo es la obtención de esos azucares a partir de la pulpa de

café por medio de dos tratamientos químicos (NaOH y H2SO4) para después
someterla a una hidrólisis enzimática esperando obtener un rendimiento de
conversión mayor al 50%.

2. Planteamiento del problema

Durante el beneficiado de café se generan grandes cantidad de subproductos,

que se acumulan, lo que en la mayoría de los casos ha ocasionado problemas en
los beneficios de café. En los últimos años en países como Guatemala se ha
obtenido más de 1x109 toneladas de pulpa de café lo que lo hace una fuente
potencial de contaminación para el ambiente (León, García, & Palomo, 1999).

2
Sin embargo, dichos residuos pueden ser reincorporados al medio ambiente al
someterse a un proceso de compostaje o vermicompostaje, o estos subproductos
pueden servir como una materia prima para otros procesos fuera de la industria
cafetalera, como la producción de etanol a partir de azúcares reductores totales,
llegando a tener un valor agregado, contribuyendo en la reducción del impacto
ambiental negativo por contaminación de suelo, agua y aire. La pulpa de café, es
el residuo de mayor volumen dentro del beneficio, representando el 56% del
volumen del fruto y el 40% del peso seco del grano (Anacafé, 1999). Sin
embargo, existen pocos estudios realizados en el campo de generación de ART,
particularmente para uso en biocombustibles, a partir de la pulpa de café (Braham
y Bressani, 1978). Este trabajo se basa en encontrar, entre un tratamiento ácido y
otro alcalino; el mejor para después de una hidrólisis enzimática obtener la mayor
concentración de azúcares reductores totales, proceso del cual no se encontraron
referencias.

3. Justificación

Los residuos de manejo especial son aquellos generados en los procesos

productivos, que no reúnen las características para ser considerados como
peligrosos o como residuos sólidos urbanos. Los residuos generados por las
actividades pesqueras, agrícolas, silvícolas, forestales, avícolas, ganaderas,
incluyendo los residuos de los insumos utilizados en esas actividades, se
consideran residuos de manejo especial (SEMARNAT, LGPGIR, 2003). De tal
manera que, la pulpa de café entra en esta clasificación; por lo que debe de tener
un manejo como tal, pero al no ser considerado un residuo peligroso o un residuo
urbano, no se le da la importancia debida y no se busca un lugar adecuado para
su confinamiento, disposición final o un tratamiento, siendo solamente acumulado
en los terrenos de los beneficios de café, expuesta a la degradación microbiana,
generando lixiviaciones perjudiciales al suelo y agua, olores desagradables y mala
imagen al paisaje. La pulpa de café, al ser un material lignocelulósico, contiene
tres partes importantes como la celulosa, la hemicelulosa y en menor medida la

3
lignina, estos, al ser tratados de forma física, química, biológica o una
combinación entre ellos y posteriormente ser sometida a una hidrólisis enzimática,
se podrían obtener azúcares reductores; que son la base para la obtención, por
ejemplo, de biocombustibles de segunda generación y de prebioticos. En este
trabajo se busca estudiar a la pulpa de café, pre tratada por medios químicos y
biológicos, como posible residuo con potencial para la generación de azúcares
reductores totales.

4. Marco teórico

4.1 Estructura química de la biomasa lignocelulósica

Los materiales lignocelulósicos están formados principalmente por tres
componentes como son la celulosa, la lignina y la hemicelulosa, cada una de ellas
tiene una función dentro de la estructura de las paredes vegetales, constituyen en
general más del 75% del material vegetal, y están constituidos por polímeros
orgánicos de alto peso molecular (Abril y Navarro, 2012). La estructura de la
celulosa no es el único factor que limita su accesibilidad, otros componentes como
el contenido de lignina y de hemicelulosas, juegan un rol importante en los
procesos para romper o penetrar esta estructura, por lo que se requieren
tratamientos físico-químicos y enzimáticos (Cowling, 1975).

4.2. Producción de café en México.

En México, las zonas cafetaleras se encuentran principalmente en la zona

montañosa sur que integra a los estados de Chiapas, Oaxaca, Puebla y Veracruz,
solo en estos estados se concentra cerca del 90% de la producción nacional; así,
en el 2013, la producción fue de 499,105.16 Ton en Chiapas; 147,766.384 Ton
en Veracruz; 142,766.07 Ton en Oaxaca; 72,174.85 Ton en Puebla y 47,190.50
Ton en Guerrero. Particularmente, en Veracruz, los municipios con mayor
producción en el 2013 fueron Atzalan (20,252.50 Ton), Huatusco (23,220.60 Ton),
Ixhuatlán del café (19,262.10 Ton) y Coatepec (16,477.50 Ton). Según datos del
Sistema de Información agroalimentaria y pesquera (SIAP, 2013).

4
En la Fig. 1 y 2 se muestra la producción de café en el 2013 en México y los 10
mayores productores en Veracruz, respectivamente; según datos del Servicio de
Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP, 2013) de la Secretaría de
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación(SAGARPA).

 
FIGURA 1. PRODUCCIÓN DE CAFÉ EN MÉXICO, (SIAP, 2013).

FIGURA 2. MAYORES PRODUCTORES DE CAFÉ EN VERACRUZ, (SIAP, 2013)

5
En el proceso del café poco menos del 5% de la biomasa generada es
aprovechada para la elaboración de la bebida, el resto queda en forma de
residuos. En el proceso del café existen dos etapas donde se generan los
residuos, la primera es en la recolección del fruto donde se generan tallos, hojas,
ramas y frutos verdes que se caen y la segunda es en el proceso de extracción
del grano de café conocido como beneficio de café. Este proceso incluye todas
aquellas operaciones que eliminan la pulpa, mucílago y pergamino, dejando los
granos de café listos para ser tostados y es donde se produce la mayor cantidad
de subproductos residuales como el mucilago, pulpa, borra, cisco y aguas del
remojo de la pulpa; siendo la pulpa el de mayor volumen consistiendo cerca del
44% del volumen total del grano (Rodríguez y Zambrano, 2010).

4.3 Composición estructural del café

El fruto del café está compuesto por 5 partes (Fig. 3, Coste, 1968):

• Epicarpio: Es la materia azucarada, rica en hidratos de carbono cuando los

frutos son maduros, se le llama comúnmente pulpa y compone el 43% del
fruto.
• Mesocarpio: Formada por substancias pectícas, proteínas y ácidos
pectínicos, llamado también mucilago y forma pate del 23% del fruto.
• Endocarpio: Pergamino o cascabillo, integrante del fruto en un 12.6%, está
formado por material celulósico que envuelve a los granos, es muy
resistente al desgarramiento cuando está seco.
• Espermodermo: Película plateada compone el 0.95% del fruto y es un
tejido sumamente delgado, es una especie de cutícula del grano.
• Endospermo: Es el grano de café, constituye el 18% del fruto, de color
verde olivo cuando contiene el 12% de humedad y está listo para ser
tostado.

6
 FIGURA 3. COMPOSICIÓN DEL FRUTO DE CAFÉ (TOMADO DE COSTE, 1968).

Siendo la pulpa su principal componente (43%), por lo que puede representar un

material viable para la generación de ART.

4.4 Pulpa de café

La pulpa de café es el principal residuo sólido del beneficio húmedo del grano de
café, constituyendo entre el 42 y el 44% del peso del grano de café. Según datos
de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
(FAO, por sus siglas en inglés), en 1996 la producción mundial de residuos de
café se estimó cerca de 22 millones de toneladas métricas (TM) de pulpa, 2.4
millones TM de mucílago y 8.6 de pergamino (FAO, 2000) Por lo que la pulpa de
café representa una materia prima lignocelulósica de interés. La pulpa posee
sustancias químicas útiles para la alimentación (azúcares libres, proteínas,
hemicelulosas, celulosa) como se muestra en la Tabla 1; pero a su vez contiene
sustancias con un posible efecto anti fisiológico (cafeína, ácido caféico, fenoles
libres, polifenoles), es decir, sustancias que han mostrado efectos nocivos o
toxicos en animales (Bressani & Braham, 1978); además contiene taninos
hidrolizables y condensados (Tabla. 2).

7
 Tabla 1. Constituyentes de paredes celulares y polisacáridos estructurales en la pulpa de café.
Tomado de (Elias, 1978).
Constituyente %
Contenido celular 63.2
Fibra detergente neutra 36.8
Fibra ácida detergente 34.5
Hemicelulosa 2.3
Celulosa 17.7
Lignina 17.5
Proteína lignificada 3
Proteína cruda 10.1
Cenizas insolubles 0.4

Tabla 2. Contenido de otros compuestos en la pulpa de café. Tomado de (Elias, 1978).

Compuesto Base seca (%)

Taninos 1.8-8.56
Sustancias pectidas totales 6.5
Azúcares reductores 12.4
Azúcares no reductores 2
Cafeína 1.3
Ácido clorogénico 2.6
Ácido cafeico total 1.6

4.5 Pre tratamiento de materia lignocelulósica

Un pre tratamiento debe cumplir ciertos requisitos para ser considerado

adecuado, a continuación se citan algunos puntos que debe cumplir (Lynd et al.,
2002):

• Producir fibras reactivas

• Realizar una separación de las pentosas sin degradarlas
• No generar compuestos inhibidores de la fermentación
• No requerir una reducción drástica del tamaño de partículas
• Emplear reactores de tamaño razonable y a bajo costo
• No generar residuos sólidos
• El proceso debe ser simple
• Efectivo a bajos contenidos de humedad

8
Por su naturaleza, los pre tratamientos se pueden dividir en cuatro grupos: físicos,
físico-químicos, químicos y biológicos (Sun y Cheng, 2002), como se muestra a
continuación (Tabla 3).

Tabla 3. Tipos de pre tratamiento (Modificado de Abril y Navarro, 2012; Cuervo et al, 2009)
Tratamiento Método Observaciones
Físico Pulverizado • Molida en molinos de bolas (0,2 a
mecánico 2,0 mm), de cuchillas o martillos
(3 a 6 mm).
• Residuos de maderas, maíz,
bagazo de caña y pajas.
Pirólisis • T>3000°C Hidrólisis con H2SO4
1N, 970°C 2,5 horas de los
residuos de maderas y residuos
de algodón.
Físico- Explosión con • Se emplea H2SO4 , SO2 y CO2
Químico vapor como catalizador.
catalizada • Es el proceso más empleado.
con ácidos • Funciona bien con astillas de
maderas duras, menos con
suaves.
Explosión con • Altos consumos de energía con
amoniaco maderas.
(AFEX) • El AFEX no genera inhibidores.
Químico Ácidos • Efectivo para residuos agrícolas.
diluidos • Menos eficiente para maderas y
(H2SO4, cultivos energéticos.
HCl,H3PO4) • Problemas de corrosión.

Ácidos
orgánicos
Organosolv • Preferido para fraccionar
biomasa.
• Extrae lignina de gran calidad.
• Es un proceso caro.
Biológico Bacterias y • Amigables con el ambiente e
Hongos incrementan la accesibilidad al
material celulósico.
• Alto rendimiento del producto, las
condiciones moderadas de la
reacción, la poca generación de
compuestos tóxicos.

9
4.5.1 Pre tratamiento Físico

Los pre tramientos físicos son todos aquellos que solo cambian la estructura física
del material (molido, picado, pulverización), es el primer proceso que se lleva a
cabo para tener mejor acceso a la celulosa para la hidrólisis. La composición de
los materiales lignocelulósicos, constituidos por celulosa, hemicelulosas y lignina,
forman una estructura compleja muy difícil de ser penetrada y atacada por
agentes químicos solamente, por ello, es necesario que se lleve a cabo un pre
tratamiento físico, esto es para “romper” la estructura y así facilitar los procesos
posteriores (McMillan, 1994;Viñals-Verde, 2012).

4.5.2 Pre tratamiento Químico

4.5.2.1 Pre tratamiento Alcalino

El pre tratamiento alcalino consiste en la remoción de la lignina de la biomasa

con álcali, esto hace que la fibra sea de mayor reactividad, el álcali
(generalmente sosa o cal) realiza una degradación de la fibra, de tal modo que la
cristalinidad de la celulosa disminuye, es decir, pierden su ordenamiento las
moléculas que forman las zonas cristalinas volviéndolas zonas amorfas mas
fáciles de degradar, mientras esto ocurre, se crea un incremento de la superficie
de contacto y también de la porosidad, se evidencia una ruptura de lignina-
carbohidrato y una fragmentación de la estructura de la lignina. La efectividad de
esta clase de pre tratamiento depende del contenido de lignina del material a
tratar (Fonseca, 2007). La hidrólisis con NaOH diluido produce un hinchamiento
de la biomasa; lo que provoca un aumento del área superficial interna y a su vez
un descenso de la cristalinidad, una separación de las uniones estructurales
entre la lignina y los carbohidratos y degradación de la lignina (Verdecia y Díaz,
2008).

10
 4.5.2.2 Pre tratamiento ácido

El pre tratamiento con ácido sulfúrico diluido ha sido ampliamente estudiado, la

National Renewable Energy Laboratory (NREL) de los Estados Unidos es la
entidad que ha desarrollado los mayores avances tecnológicos con respecto al
pre tratamiento con ácido, encontrando ventajas como la recuperación entre el
80 y el 90% de los monosacáridos que provienen de la hemicelulosa. Aunque se
ha encontrado que pequeños porcentajes de lignina son disueltos durante el
proceso, algunos estudios muestran un aumento significativo en el porcentaje de
celulosa hidrolizada (Mateus et al., 2012).

Entre las desventajas de la hidrólisis ácida:

• La hidrólisis con ácido diluido tiende a rendir una gran cantidad de

subproductos.
• La hidrólisis ácido concentrado forma menos subproductos pero por
razones económicas el ácido debe reciclarse. La separación y
reconcentración de ácido genera más complejidad al proceso, además el
ácido sulfúrico es altamente corrosivo y difícil de manipular.
• Ambos procesos se realizan a altas temperaturas (entre 100-200ºC), lo cual
puede degradar los azúcares, y se reducen las fuentes de carbono y se
obtiene una disminución en el rendimiento a etanol (DiPardo, 2000).

Una de las desventajas al utilizar este tipo de pre tratamiento radica la acción
corrosiva del ácido sobre los equipos empleados en el procedimiento, lo que
causa un deterioro de las partes metálicas que este pueda tener, también existe la
degradación de los carbohidratos hidrolizados a compuestos derivados del furano,
como el furfural proveniente de la hidrólisis de las pentosas y el 5-
hidroximetilfurfural (5-HMF) por hidrólisis de las hexosas, compuestos que pueden
causar una inhibición en la fase de la fermentación. En la Tabla.4 se muestran
diferentes pre tratamientos usados para diversos sustratos.

11
 Tabla 4. Parámetros de pre tratamientos usados para diversos sustratos

Sustrato Pre Concentración Condiciones de Referencias

tratamiento reacción
Cáscaras H2SO4 2% La pre hidrólisis se (Martín y
de frutas realiza con ácido Hernández,
diluido, a 1 atm, T= 2006).
30º a 37ºC y
tiempos de reacción
entre 10 y 40
minutos
Betabel H2SO4 0.05, 0.5, 1, 2 y Las muestras fueron (Islas et al.,
3N incubadas a 30 °C a 2011).
150 rpm en un
agitador orbital.
Después de 24 y 48
h de reacción, se
cuantificaron los
azúcares totales,
además se
realizaron algunas
pruebas para
identificación de
xilosa mediante el
analizador
bioquímico YSI.
Aserrín NaOH 1y3% 120 º C durante 30 (López-
de pino minutos, utilizando Miranda
una solución de et al.,2009).
hidróxido de sodio
al 2%.
Maíz NaOH 2% 120 º C por 30 (Mendiola et
minutos. al., 2008).
Hueso de H2SO4 0,5%(p/v) 200 g de material (Ballesteros,
aceituna seco se et al., 2002).
impregnaron con 1
litro de una solución
ácida durante una
hora.
Cascarilla NaClO 6.25% 2 horas a 100 rpm y (Piñeros y
de arroz 30°C. Otálvaro,
2009).

Los trabajos realizados con sub productos del café en materia de biocombustibles
han utilizado el mucilago (Delesma y Morales, 2006) , pulpa de café combinado

12
con mucilago para biogás (Cabrera et al., 1987) y los jugos de la pulpa de café
para biogás (Calzada et al.,1987).

4.4.3 Hidrólisis enzimática de materia lignocelulósica

La biomasa pre tratada químicamente se somete a una hidrólisis enzimática

posterior, usando celulasas exógenas, lo cual hace que se obtenga una solución
de azúcares fermentables (azúcares reductores totales) que contiene
principalmente glucosa, así como pentosas, resultantes de la hidrólisis inicial de la
hemicelulosa (Abril y Navarro, 2012). Los azúcares obtenidos de la biomasa
celulósica pueden ser utilizados para otros fines como en la producción de
bioetanol y en la producción de prebióticos.

En la Tabla. 5 Se muestran las diferentes enzimas utilizadas en la hidrólisis

enzimática.
Tabla 5. Ejemplos de enzimas usadas para hidrólisis.
Enzima Origen Resultados Referencias
Celluclast Trichoderma Los rendimientos de hidrólisis (Ballesteros
1.5L reesei enzimática no varían al aumentar et al., 2002).
la concentración de sustrato.
Tampoco se producen variaciones
en el rendimiento utilizando cargas
de enzima de 7,5 y 15 FPU/g
sustrato, produciéndose un
incremento en los rendimientos a
concentraciones de 30 FPU/g.
α-Amilasa Aspergillus Para el caso usado con harina de (Alarcón.A,
oryzae yuca y malanga se eligió la 2010)
hidrólisis enzimática por encima de
la hidrólisis química ya que dio
mayor cantidad de azúcares para
la producción de etanol.
β- Aspergillus Se probaron diferentes (Fonseca,
Glucosidasa níger concentraciones de la solución de 2007).
enzima, dando mejores resultados
en la obtención de azúcares de
hasta 2.50mg con la concentración
de enzima de 1.01 CBU/g de
bagazo tratado

13
Cellulasas Trichoderma La hidrólisis enzimática con (Rebolledo,
reesei celulasas de Trichoderma reesei, y 2013)
la fermentación de los azúcares de
manera simultánea con Zimomona
mobilis y Saccharoyse cerevisiae,
inmovilizadas en matrices de
alginato-quitosan, se generó
etanol, aunque con bajos
rendimientos.

Fonseca (2007) utilizó bagazo de caña de azúcar sometiéndolo a procesos de pre

tratamiento con hidróxido de calcio al 0.4 g Cal/ g de Biomasa, 70°C, 150 rpm,
36h y con peróxido de hidrógeno al 7.335% H2O2, v/v; pH 11.5; 25°C, 1h antes de
la hidrólisis enzimática (50°C, pH 4.8, 100rpm, 48 a 72h), utilizando
concentraciones de celulasa de 3.42 FPU/g de biomasa seca y de β-glucosidasa
1.01 CBU/g de biomasa seca, obteniendo cerca de 15g/L de azúcares reductores.
De igual manera, Contreras y Córdoba (2012) utilizaron bagazo de caña pre
tratado con hidróxido de sodio a 121ºC durante 90 minutos, agregando 10 ml de
una solución al 2 % (p/v) de hidróxido por gramo de bagazo seco, evaluando el
rendimiento de la hidrólisis enzimática, manteniendo fijos el pH (4,8) y la
temperatura (50ºC), y variando la concentración de enzima (3 FPU/g y 8 FPU/g),
bagazo(8 g/L y 12 g/L), y el tamaño de partícula (1,41 a 3,36 mm y de 0,71 a 1,00
mm), obteniendo rendimientos de 70,2 % de glucosa, y 83,6 % de azúcares
reductores, con una concentración de enzima de 8 FPU/g, una concentración de
bagazo de 8 g/L, y un tamaño de partícula de 1,41 a 3,36 mm. Al incrementar la
concentración de enzima a 20 FPU/g, y manteniendo la concentración de bagazo
de 8 g/L, y un tamaño de partícula de 1,41 a 3,36 mm, obtuvieron un rendimiento
de glucosa de 91,7%.

Por otra parte, Alarcón (2010) utilizó harina de yuca y malanga con el fin de
determinar las mejores condiciones para la hidrólisis enzimática, usando a las
enzimas α-amilasa y amiloglucosidasa, bajo tres factores: temperatura (60 y
90°C), concentración de ácido sulfúrico (1 y 5% (v/v)) y tiempo de hidrólisis (1 y 5

14
h). El análisis de superficie de respuesta mostró que la respuesta fue mínima en
los puntos centrales para ambos tubérculos y que, con un nivel de confianza del
95%, las mejores condiciones para la hidrólisis enzimática fueron: 73.6 ° C, pH
4.08 y 24h, con un rendimiento de 0.64 g glucosa / g de harina de yuca.

Mateus et al., (2012) seleccionaron el pasto Maralfalfa (15 g) utilizando el pre

tratamiento con ácido sulfúrico diluido a diferentes temperaturas (110, 130, 150,
170 y 190 °C) y concentraciones de ácido (0.8, 1.2 y 2.0% (v/v)), seguido de un
proceso de hidrólisis enzimática utilizando celulasas y celobiosas comerciales. La
glucosa, xilosa y arabinosa, en el producto líquido de la reacción, alcanzan su
máxima concentración para las reacciones realizadas a 0.8 y 1.2 % y 150°C; y
para la realizada al 2.0 % y 130°C. La degradación de los carbohidratos se
potencializa con el aumento de la temperatura y concentración de ácido, hallando
el máximo contenido de furfural y 5-HMF a 190°C y 2.0 % (p/p).

Rebolledo (2013) utilizó bagazo de caña pre tratándolo con NaOH al 2%(p/v) con
un tiempo de 15 min en autoclave (1.2 Kg/cm2, 120°C), obteniendo 0.471± 0.038
g/L de azúcares reductores, utilizando celulasas de Trichoderma reesei (2.9 u/L) y
realizando una fermentación con Zymomonas mobilis y Saccharomyces
cerevisiae inmovilizadas en perlas de alginato-quitosano, obteniendo un
rendimiento de etanol de 52±12.18% con una productividad de 0.003±0.001 g/L/h.

5. Hipótesis

El pre tratamiento químico con ácido sulfúrico de pulpa de café, seguido de la

hidrólisis enzimática, permitirá obtener azúcares reductores totales con
rendimientos de al menos 50%, a diferencia del pre tratamiento con hidróxido de
sodio.

15
6. Objetivos

6.1 Objetivo general

Obtener al menos 50% de rendimiento de producción de azúcares reductores

totales, mediante un pre tratamiento físico, químico-enzimático de pulpa de café.

6.2 Objetivos específicos

• Determinar las condiciones de pre tratamiento químico (ácido o alcalino) de

la pulpa de café que produzca mayor concentración azúcares reductores
totales.
• Estimar la generación de azúcares reductores totales, usando celulasas de
Trichoderma reesei, a partir de la pulpa de café pre tratada químicamente.

7. Materiales y métodos

A continuación se muestra el diagrama de la experimentación que se realizó

(Fig.4).

16
 Recolección*de*
la*pulpa

Secado*

Pre*tratamiento*
Físico

Tratamiento*
Tratamiento* Químico*
Químico*(H2SO4) (NaOH)

Determinación de*
ART

Tratamiento*
enzimático

Determinación*de* Determinación*de* Determinación

proteínas celulasas de*ART

Análisis*
estadístico

Representación*
de*resultados

Discusión de*
resultados

FIGURA. 4 DIAGRAMA DE LA METODOLOGÍA.

7.1 Recolección y tratamiento previo de la pulpa de café

La pulpa de café se obtuvo del Municipio de Xico, proveniente de la cosecha

2013-2014. La pulpa colectada directamente del beneficio de café se secó al sol,
después fue secada en estufa a 50°C por 24 horas y fue almacenada para su
posterior utilización.

17
7.2 Pre tratamiento de pulpa

7.2.1 Físico

La pulpa de café se separó en bolsas con 500 g aproximadamente, para ser

molida en un molino de discos (Chapingo) con diámetro de 300 mm para obtener
un tamaño de partícula menor a 1 mm La pulpa así tratada se usó para los
análisis posteriores.

7.2.2 Químico

7.2.2.1 Alcalino y ácido

El pre tratamiento químico, ya sea alcalino (NaOH) o ácido (H2SO4), se realizó

en base a un experimento bifactorial; donde los factores principales fueron la
concentración de la solución química (álcali o ácida) y el tiempo de reacción, a 4
niveles cada uno. Para la concentración de la solución química se probaron los
niveles: 0.5, 1, 1.5 y 2 % (p/v); y para el tiempo de reacción se probaron 5, 15,
30 y 60 min en autoclave (120°C, 1.2 kg/cm2), con 4 réplicas para cada
tratamiento. Este método está basado en el utilizado por López-Miranda et al.,
(2009) con modificaciones para la pulpa de café.

Las muestras se depositaron en frascos de 50 ml, se agregaron 5 ml de

solución química correspondiente (hidróxido de sodio para el tratamiento alcalino
o ácido sulfúrico para el tratamiento ácido) diluidos al 0.5, 1, 1.5 y 2 % (p/v) por
gramo de pulpa, posteriormente fueron llevados a autoclave a 1.2 kg/cm2 y
120°C con tiempos de retención de 5, 15, 30 y 60 min. Una vez terminado el
tiempo en autoclave las muestras se aforaron a 300 ml con agua destilada
estéril. La determinación de ART se realizó a partir de las muestras finales, con
tres réplicas experimentales.

7.3 Hidrólisis enzimática

Se utilizaron celulasas de Trichoderma reesei (Sigma-aldrich Co. ≈700 u/g)
agregando 1.240 ml de celulasas/300 ml de jugo pre tratado químicamente
previamente (Rebolledo, 2013). Para determinar las condiciones de generación
18
de ART se realizó un diseño monofactorial, donde el factor principal fue el tiempo
de reacción. Se hicieron 3 réplicas a los tiempos de reacción de 0, 2, 4, 5, 6 y 8
horas. Durante el tiempo de reacción enzimática se determinaron los azúcares
reductores totales, las celulasas totales y las proteínas totales.

7.4 Determinación de rendimientos

El rendimiento de conversión se calculó como la razón de la concentración de

glucosa o azúcares reductores, respecto a la concentración de material celulósico
pre tratado en base seca.

7.5 Determinación de azúcares reductores

La cantidad de azúcares reductores liberados fueron determinados por el método

del ácido 3-5-dinitrosalicílico (Miller, 1959; Gil et al., 2006). Como se muestra a
continuación:

Preparación del DNS

Pesar 5g de DNS, 150g de tartrato de NaK y 8g de NaOH.

Método: Disolver el NaOH en 200 ml de dH2O y se adiciona en agitación el

tartrato lentamente, se adicionan 200 ml más de dH2O y se agrega el DNS,
lentamente, en agitación hasta disolución total, en caliente (sin hervir). Si se
forman precipitados, filtrar en watman 1.

En tubos de cristal de 10 ml adicionar 500µl de muestra y 500 µl del reactivo DNS.

Llévelos a baño maría a 100 grados por 5 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente y adicionar en cada tubo 5 ml de dH2O. Agitar y leer en espectro a
540nm. Haga un control de reacción con agua.

Previo a los análisis se preparó una curva patrón usando glucosa (Anexo. 1).

Los datos obtenidos se analizaron mediante una regresión lineal y el modelo

obtenido se utilizó para calcular la cantidad de azúcares contenidos en las
muestras.

19
7.6 Determinación de proteínas totales

Se realizó por la técnica colorimétrica de azul de comassie G-250 (Bradford,

1976). Como se muestra a continuación:

Esta técnica se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también

Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas
una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un
complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el
colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas
sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren
están los detergentes y las soluciones básicas.

Se añade 250µL de Bradford. 250 µL de muestra y 500 µL de agua se

homogeniza y se lee en espectrómetro a 595nm.

7.7 Actividad de celulasas totales

La actividad celulasa se determinó de acuerdo a Kim et al., (2009).

• Coloque una tira de papel de filtro en cada vial.

• Añadir 1,0 ml de 50 µM del tampón de citrato (pH 4,8 ) a los tubos ; la
tira de papel debe estar sumergida en el búfer.
• Agregar a los viales 500 µl de muestra.
• Incubar por 1 h a 50ºC.
• Una vez incubados tomar 500 µl del vial y agregar 500 µl de DNS.
• Llevar a choque térmico ( calentar los tubos a baño maría hasta la
ebullición dejar 5 min posteriormente sacarlos e inmediatamente
sumergirlos en agua helada por 10 min).
• Leer a 540 nm en espectrofotómetro.

La preparación del buffer citrato para la técnica análisis de celulasas se encuentra

en el Anexo.2

20
7.8 Actividad específica
La actividad específica es el cociente de actividad enzimática (expresada en
unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas, es la velocidad a la que
una enzima completa una reacción química y produce un producto químico final.
La actividad específica de una enzima describe la velocidad enzimática por
miligramo de enzima (Garret y Grisham, 2013).

7.9 Análisis estadísticos

Para determinar el efecto del tiempo y concentración de pre tratamiento sobre la

producción de azúcares reductores totales, se realizó un análisis de varianza
(ANDEVA) y una prueba de comparación de medias (Tukey), con un valor α=0.05.
Los análisis de varianza se realizaron con el programa (Statistica, 2004).

8. Resultados

8.1 Pre tratamiento alcalino

Los azúcares reductores (Fig.5) aumentan conforme aumenta la concentración de

NaOH evaluada. El tratamiento que generó la mayor concentración de ART fue la
condición con 2% de NaOH; variando de 2.947 ±0.16 g/L a los 5 min, hasta 3.242
±0.03 g/L a 60 min, sin observarse diferencias significativas (P > 0.05) entre
tiempos de reacción evaluados. En general, a mayor tiempo de reacción mayor
fue la concentración de azúcares reductores generados (Fig. 4). Es importante
señalar que el tratamiento control (sin NaOH) en todos los tiempos de retención
generó más ART que los tratamientos con concentraciones de 0.5 y 1% (p/v) de
NaOH, en el mismo tiempo, esto indica que en un inicio existe un consumo de los
azúcares reductores totales que componen a la pulpa y que, posteriormente, la
liberación de ART es mayor que la pérdida.

21
 3.5
2
3.0 1.5
1
2.5 0.5
0
ART(g/L)

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
15

30

60
5

Tiempo (min)

FIGURA 5. CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES DESPUÉS DEL PRE TRATAMIENTO

ALCALINO.
Haciendo un análisis de la grafica anterior podemos observar que el
comportamiento es igual en todas las concentraciones, donde se ve un aumento
de los azucares reductores con forme va variando el tiempo.
El análisis de varianza (Tabla 6) muestra los parámetros y la ecuación general
correspondiente al pre tratamiento químico con NaOH.
Tabla 6. Análisis de varianza de dos vías del pre tratamiento NaOH.

SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 754.79 1 754.79 7769.30 0.00
β1 Concentración 156.89 4 39.22 403.75 0.00

β2 Tiempo 31.58 3 10.52 108.37 0.00

β3 Concentración 21.64 12 1.80 18.56 0.00
* Tiempo
e Error () 21.37 220 0.09
Ecuación y=β0+β1X1+β2X2+β3X1X2+ e

22
Donde β0 (el intercepto), β1, β2 y β3, son los coeficientes de la ecuación
correspondiente a las variables predictoras; X1 valor de la concentración del
NaOH, X2 valor del tiempo, X3 el producto del tiempo * concentración, e es el
error.

En la Tabla. 7 se muestran los resultados de los rendimientos obtenidos en el pre

tratamiento con NaOH.

Tabla 7. Rendimientos de conversión del pre tratamiento alcalino (% en base a ART generados en
cada tiempo de pre tratamiento).

Tiempo Concentración Rendimiento de conversión

g/L
(min) (w/v)
0 1.71 Control
0.5 0.29 -82.92
5 1 0.12 -93.17
1.5 0.93 -45.63
2 2.95 72.42
0 1.78 Control
0.5 1.08 -39.30
15 1 0.55 -69.07
1.5 2.29 28.82
2 3.06 71.87
0 1.91 Control
0.5 1.54 -19.20
30 1 0.80 -58.25
1.5 2.68 40.39
2 3.04 59.49
0 2.17 Control
0.5 1.13 -48.16
60 1 1.85 -15.00
1.5 2.41 10.86
2 3.24 49.25

El análisis de rendimientos de conversión nos ayudan a ver con mayor facilidad

dónde existe pérdida o una generación significativa de azúcares reductores; todos
los rendimientos negativos (datos en rojo) nos indican una perdida de azúcares

23
por acción del hidróxido de sodio, que los destruye, los rendimientos de
conversión positivos (datos en negro) nos indica que la generación o liberación de
azúcares es mayor que el consumo de los mismos y los datos en azul son los
valores mas altos obtenidos.

Dentro de todos los datos, encontramos dos que son los más altos, los cuales
superan el 70% de rendimiento de conversión, en la tabla anterior se confirma que
el mejor tratamiento fue la condición de 5 minutos y una concentración del 2%
(w/v) de NaOH, obteniendo un rendimiento de conversión de 72.42%. A su vez, el
análisis de varianza y el Tukey previamente mostrados, sustentan que este fue el
mejor tratamiento, el cual fue el que se utilizó para la siguiente fase; la de
hidrólisis enzimática.

8.2 Pre tratamiento ácido

Al igual que con el pre tratamiento alcalino, el ácido indica en general que los
azúcares reductores aumentan conforme aumenta la concentración de H2SO4
evaluada y el tiempo de reacción.

A diferencia del pre tratamiento alcalino, en el pre tratamiento ácido no existe una
pérdida de azúcares, esto es por que el acido trabaja directamente a hidrolizar la
celulosa a diferencia del hidróxido que trabaja sobre la lignina y reduce la
cristalinidad y polimerización de la celulosa, es por esto que los ART aumentaron
de 5.48 ±0.11g/L con 5 min de reacción a 7.57 ±0.23 g/L con 60 min; usando 1%
de ácido. Las condiciones que generaron más ART fueron 1 y 1.5 % de ácido
sulfúrico (7.57 ±0.23 y 7.87 ±0.18 g/L, respectivamente; Fig. 6).

24
 8.5
8.0 0
7.5 0.5
7.0 1
6.5
1.5
6.0
5.5 2
5.0
ART(g/L)

4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
15

30

60
5

Tiempo (min)
 

FIGURA 6. CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES DESPUÉS DEL PRE TRATAMIENTO

ÁCIDO.
Como se menciono en la Figura. 4 los azucares reductores van aumentando
conforme al tiempo en cada concentración de ácido, con diferencia en la
concentración de acido sulfúrico al 2%(v/v) donde a partir de los 30 min comienza
a disminuir, esto puede deberse que la concentración en conjunto con el tiempo
de retención comienzan a degradar los azucares y puedan estar formando otros
compuestos.
El Análisis de varianza (Tabla.8) indica que tanto el tratamiento como el tiempo
de reacción fueron determinantes en la generación de ART.

25
 Tabla 8. Análisis de varianza de dos vías del pre tratamiento H2SO4.

SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 1874.463 1 1874.463 30434.00 0.000000
β1 Concentración 370.915 4 92.729 1505.55 0.000000
β2 Tiempo 16.063 3 5.354 86.93 0.000000
β3 Concentración 12.747 12 1.062 17.25 0.000000
* Tiempo
e Error 3.695 60 0.062
Ecuación y=β0+β1X1+β2X2+β3X1X2+ e

En la tabla se indican los parámetros y la ecuación general, correspondiente al

pre tratamiento con H2SO4. Donde β0 es el intercepto, β1, β2 y β3 son los
coeficientes de la ecuación correspondiente a las variables predictorias, X1 valor
de la concentración del H2SO4, X2 valor del tiempo y X3 el producto de tiempo *
una concentración y e es el error.
En la tabla 9 se observa el caso contrario a lo observado con el pre tratamiento
alcalino, donde existía una pérdida de los azúcares, con el pre tratamiento ácido
se liberan azúcares a partir de 5 minutos, mostrando ser un tratamiento
adecuado para la pulpa de café.  

26
Tabla 9. Rendimientos de conversión del pre tratamiento ácido. (% en base a ART generados en
cada hora de tratamiento)
Tiempo Concentración
g/L Rendimiento de conversión
(min) (v/v)
0 1.19 Control
0.5 2.29 91.91
5 1 5.49 360.39
1.5 6.24 423.41
2 5.82 388.36
0 1.24 Control
0.5 2.36 90.07
15 1 6.39 415.11
1.5 6.94 458.95
2 6.64 435.34
0 1.32 Control
0.5 2.98 126.47
30 1 6.72 410.33
1.5 7.10 439.40
2 5.54 320.72
0 1.79 Control
0.5 4.04 125.43
60 1 7.54 320.14
1.5 7.88 339.06
2 5.76 221.08

Se observa que a los 15 minutos de tratamiento con una concentración de ácido

de 1.5% (v/v) se generan cerca de 7 g/L de azúcares (datos en rojo), obteniendo
un rendimiento de conversión cercano al 459%. El tratamiento a 60 min con 1%
de concentración de ácido generó más ART, esto es considerando la diferencia
de los ART generados en el control a 60 min, siendo este tratamiento el utilizado
para la siguiente fase de hidrólisis. Los resultados marcados en azul son los mas
altos obtenidos en los tratamientos.

8.3 Hidrólisis enzimática

8.3.1 A partir del pre tratamiento alcalino

La generación de ART fue proporcional al tiempo de hidrólisis. Así, a partir de la

primera toma de muestra se comenzó a observar un incremento progresivo de

27
 los azúcares, siendo muy marcado en la segunda hora, donde casi ha sido
duplicada la cantidad de azúcares liberados, en las horas posteriores la
liberación de azúcares se incrementó paulatinamente, obteniéndose la máxima
concentración (6.32±0.13 g/L) después de 8 horas de hidrólisis enzimática (Fig.
7).

9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ART(g/L)

6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0

8
Tiempo(h)

FIGURA 7. GENERACIÓN DE ART DURANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA, POSTERIOR AL PRE

TRATAMIENTO ALCALINO.(LOS VALORES INDICAN PROMEDIOS Y LAS BARRAS DESVIACIÓN ESTÁNDAR,
N=4)

En la Figura. 7 se observa una pendiente pronunciada entre los puntos del tiempo
0 h y 2 h indicando que la tasa de conversión de la enzima es muy rápida en esos
puntos, posteriormente a esos puntos, la producción de ART es más lenta; sin
embargo, la enzima continúa activa hasta las 8 horas de reacción.

Se realizó un análisis de varianza de una vía (Tabla 10), siendo la variable de

respuesta los g/L de azúcares reductores y la variable independiente el tiempo,
manteniéndose la concentración de enzima constante. Se encontró que el mejor
tiempo de generación de ART fue a las 5 horas de hidrólisis (Tabla. 11).

28
 Tabla 10. Análisis de varianza de una vía de la hidrólisis alcalina.

SC Grados SM F p
de
libertad
β0 Intercepto 1182.18 1 1182.18 3442.65 0.000000
β1 Tiempo 14.44 5 2.88 8.41 0.001278
e Error 4.12 12 0.34

Ecuación β0+β1x1+e

Los rendimientos de la eficiencia de la hidrólisis (Tabla 11) indican que en dos

horas se obtiene cerca del doble de la cantidad de los azúcares iniciales. También
indica que a partir de la quinta hora de hidrólisis no hay un incremento significativo
(P > 0.05) en la generación de ART, siendo la cantidad de azúcares liberados muy
parecida hasta octava hora de hidrólisis.

El análisis estadístico y la prueba Tukey nos marcan que el mejor tiempo para la
máxima liberación de azúcares fue a las 5 horas (datos en rojo).

Tabla 11. Rendimientos de hidrólisis enzimática después del pre tratamiento con NaOH (% en
base a ART generados en cada hora de tratamiento).

Hora g/L Rendimiento de conversión

0 2.22
2 4.34 195.41
4 5.24 236.04
5 5.73 258.10
6 5.84 262.87
8 6.32 284.65

29
  

8.3.2 A partir del pre tratamiento ácido

La mayor producción de los azúcares se registró durante las primeras 4 horas de

hidrólisis, tiempo a partir del cual la producción de ART comenzó a estabilizarse.
Obteniéndose la concentración máxima de 8.91±0.17 g ART/L a las 8 horas (Fig.
8).

9.5

9.0

8.5

8.0
g/L

7.5

7.0

6.5

6.0
0

Tiempo (h)

FIGURA 8. RESULTADOS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA POSTERIOR AL TRATAMIENTO CON ÁCIDO.( LOS

VALORES INDICAN PROMEDIOS Y LAS BARRAS DESVIACIÓN ESTÁNDAR, N=4).

De forma contraria al tratamiento con NaOH, la pendiente formada por los puntos
de los tiempos 0 h y 2 h no es tan marcada como en el tratamiento alcalino, pero
la pendiente formada por los puntos de los tiempos 0 h y 4 h se incrementa
abruptamente, y a partir de la esta última hora comienza a ser muy poca la
generación de azúcares. Esto quiere decir que la tasa de conversión enzimática
se ve favorecida por el tratamiento alcalino, debido a que fue mayor que la
registrada con el tratamiento ácido (Fig. 7 y 8). Posiblemente las condiciones

30
ácidas degradaron un poco a la enzima o existen inhibidores enzimáticos
generados bajo condiciones ácidas, lo que provocó una tasa menor. La enzima
fue más eficiente bajo condiciones alcalinas (Fig. 6).

El análisis de varianza indica que los azúcares reductores fueron afectados por el
tiempo de reacción (Tabla.12).

Tabla 12. Análisis de varianza de una vía de la hidrólisis posterior al pre tratamiento ácido.

SC Grados de libertad Sm F p
β0 Intercepto 1182.187 1 1182.187 3442.650 0.000000
β1 Tiempo 14.444 5 2.889 8.412 0.001278
e Error 4.121 12 0.343
Ecuación β0+β1x1+e
De acuerdo a la prueba de Tukey, para la hidrólisis enzimática después del pre
tratamiento ácido, el mejor tiempo de reacción durante la hidrólisis fue de 4 horas
(Fig.8).

Los rendimientos de conversión (Tabla 13), durante la hidrólisis enzimática,

indican que después de cuatro horas de reacción no existe una diferencia
significativa (P < 0.05) en la liberación de azúcares, llegando a un rendimiento de
conversión de 130.19%. A partir de esta hora, la liberación de azúcares no
incrementa significativamente.  

Tabla 13. Rendimientos de conversión durante la hidrólisis enzimática del pre tratamiento con
H2SO4 (% en base a ART generados en cada hora de tratamiento).

Hora g/L Rendimiento de conversión

0 6.5663
2 7.1904 109.51
4 8.5485 130.19
5 8.5532 130.26
6 8.8538 134.84
8 8.9126 135.73
El análisis estadístico y la prueba de Tukey nos marca que el mejor tiempo para la
liberación de azúcares es a las 4 horas siendo esta la que mejor rendimiento
generó (datos en rojo).

31
8.4 Análisis de proteínas y celulasas

Las concentraciones de proteínas y las actividades de celulasas fueron dos

variables de respuesta evaluadas durante la hidrólisis enzimática (Fig. 8). Estas
variables nos ayudan a ver la tendencia de la actividad de la enzima. Así, con los
datos de proteínas (Fig. 9 a y 9 c) y celulasas (Fig. 9 b y 9 d) de los procesos de
hidrólisis enzimática con los tratamientos alcalino (Fig. 7) y ácido (Fig. 8) podemos
ver que la tendencia de reacción es muy parecida, tanto la concentración de las
proteínas como la actividad de las celulasas permanece estable durante la
hidrólisis, por lo que concluimos que la enzima continúa activa en los dos
tratamientos usados.

NaOH NaOH
1.2 400
1.1 350
Proteinas (mg/ml)

1.0 300
Celulasas (u/L)

0.9 250
0.8 200
0.7 150
0.6 100
0.5 50
0.4 0
0

8
Tiempo (h) Tiempo (h)
a) b)

H2SO4 H2SO4
1.2 400
1.1 350
Proteinas (mg/ml)

300
Celulasas (u/L)

1.0
0.9 250
0.8 200
0.7 150
0.6 100
0.5 50
0.4 0
0

Tiempo (h) Tiempo (h)

c) d)
 
FIGURA 9. A) PROTEÍNAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ALCALINO, B) CELULASAS EN LA
HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ALCALINO, C) PROTEÍNAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ÁCIDO Y
D) CELULASAS EN LA HIDRÓLISIS CON TRATAMIENTO ÁCIDO.

32
Con los resultados anteriores se calculó la actividad específica, la cual indica que
no hubo diferencias entre las actividades enzimáticas de ambos tratamientos
(alcalino y ácido; Fig. 10)

NaOH H2SO4
400 400
Actividad específica (U/g)

Actividad específica (U/g)

350
350
300
300
250
200 250
150
200
100
150
50
0 100

8
0

Tiempo (h) Tiempo (h)

a) b)

Figura 10. Actividad Específica, a) hidrólisis con pre tratamiento alcalino y b) hidrólisis con
tratamiento acido.

Por ultimo, con la actividad específica se confirma que la enzima sigue presente y
puede continuar generando azúcares en el medio.

9. Discusión

Para poder validar los resultados presentados en este trabajo, se compararon con
los resultados de autores, que trabajaron de manera similar diferentes sustratos
para obtener azúcares y algunos llevándolos hasta la fermentación.

Méndez (2014), trabajando con Agave salmiana a dos concentraciones de H2SO4

(1% y 2% v/v), a dos tiempos de retención (1 y 2 h en autoclave 1.2 kg/cm2) y
temperaturas de 100° y 120°C, concluye que el pre tratamiento con la
concentración del 2% a 120°C generaba 17% más ART que a 1 h. En nuestro
trabajo, usando las mismas concentraciones de ácido (1% y 2% v/v) y el mismo
tiempo de reacción (1 h), obtenemos 31% más de ART al 1% que al 2% de
H2SO4.

A diferencia de Méndez en este trabajo no se realizaron lavados del sustrato

previos al pre tratamiento, donde podía existir una perdida de los azucares.

33
Mateus et al.(2012), usando 15 g de pasto marafalfa, obtuvieron los mejores
resultados a 150°C y concentraciones de ácido de 0.8% y 1.2% (v/v); y a 130°C
con concentraciones de 2% (v/v), los autores indican que la temperatura a la que
se lleva acabo el pre tratamiento influye de forma importante para hidrolizar la
glucosa del sustrato, y que, a su vez, una alta temperatura (190°C) puede formar
inhibidores como lo es el furfural y el 5-HMF.

En este trabajo solo se manejó una sola temperatura que fue a 120ºC, dando
buenos resultados en la obtención de los azucares con las concentraciones
utilizadas.

En un estudio similar, pero con excretas de ganado lechero, Mariela y Zamorano,

(2008) utilizaron las mismas condiciones de temperatura y concentración de ácido
sulfúrico que los usados en este trabajo ((121º C y 2%(v/v) y 110º C con
2.5%(v/v)) dándole este ultimo los mejores resultados para la obtención de etanol;
concluyendo que temperatura y la concentración del ácido sulfúrico son dos
parámetros que deben considerarse juntos para definir las condiciones de pre
tratamiento de materiales lignocelulósicos e hidrólisis de estos mismos.

Como se menciono anteriormente, que la temperatura y la concentración del

ácido influyen en la liberación de azucares reductores, un punto también
importante es el tipo de sustrato que se utiliza. Así, en los trabajos anteriores
mencionados trabajaron con dos sustratos donde la fracción de celulosa es mayor
que la de la pulpa de café, pero en el trabajo de Mariela y Zambrano la celulosa
tenia un proceso biológico realizado por el ganado lechero (rumen), lo cual nos
lleva que si un sustrato lleva un pre tratamiento previo, podemos reducir los
tiempos de retención y la concentración del ácido para obtener los mismos
resultados que nos daría una temperatura mayor a menor concentración o
viceversa.

La hidrólisis en un medio básico favorece la producción de azúcares reductores

en pulpa de café. Nuestros rendimientos son de 284.65% de rendimiento de

34
conversión de los azúcares iniciales a 8 horas de hidrólisis, bajo condiciones
alcalinas. Lo anterior está en acorde a lo reportado por Contreras y Córdoba
(2012), usando Bagazo de Caña de Azúcar, con condiciones de 121°C, 90 min,
10 ml al 2%(p/p) de hidróxido/ g de bagazo, 8 FPU/g, 8 g/L de bagazo y tamaño
de partícula de 1,41 a 3,36 mm y 52h de hidrólisis, obtuvieron 83.6% de
conversión azúcares reductores y, aumentando a 20 FPU/g sin modificar las
demás variables, obtuvieron 91.7% de conversión de azúcares.

Rebolledo (2013), utilizó como sustrato bagazo de caña y un tratamiento con

NaOH al 2%, realizó pruebas de pre tratamiento a tiempos de 15, 30, 60, 120 y
240 minutos, reportando como el mejor tiempo 15 min, que fue usado para la
fase de sacarificación (hidrólisis enzimática) y fermentación simultánea, esta se
llevó acabo en un reactor a 50ºC, pH 4.9 y 110 rpm de agitación. La sacarificación
se llevó hasta 480 minutos siendo el mejor tiempo de hidrólisis enzimática 360
min. Los resultados reportados aquí concuerdan con lo reportado por Rebolledo
(2013). El mejor tiempo de hidrólisis con la pulpa de café, con el pre tratamiento
alcalino, fue de 5 horas. Para el caso del trabajo con bagazo de caña, el mejor
tiempo con NaOH fue de 6 horas de hidrólisis, y la mejor hidrólisis con el
tratamiento ácido se encontró a las 4 horas.

Como este trabajo se basó en las técnicas usadas por Rebolledo, es el trabajo
con el que se puede comparar directamente, aunque los sustratos son muy
diferentes se observan tendencias muy parecidas, como se muestra la
concentración seleccionada de las pruebas de pre tratamiento que mejor
resultados fue al 2%(p/v); los tiempos de hidrólisis donde se obtuvieron la
obtención de azucares mas significativa fue a las 5 horas con el hidróxido de
sodio y a las 4 horas con el ácido, resultados similar al obtenido por la hidrólisis
con BCA que fue a las 6 horas.

Esto nos indica que aunque la liberación de azucares con el NaOH es

relativamente baja en el pre tratamiento, en la hidrólisis se obtiene mejores
rendimientos con respecto a los azucares inicialmente agregados a la

35
sacarificación, es decir, se podría considerar este tratamiento como posible
candidato con algunas mejoras.

Por otro lado se observó que las celulasas de Trichoderma reseei trabajaron sin
problemas en los medios ácidos y alcalinos, al igual que con la pulpa de café.

Por ultimo, la hipótesis inicial de este trabajo fue la obtener al menos el 50% de
rendimiento en el proceso de hidrólisis química y posterior hidrólisis enzimática.
Teniendo rendimientos máximos de 284.6% con el tratamiento alcalino y de
135.75% con el tratamiento ácido, los resultados indican que con la hidrólisis
enzimática, posterior al tratamiento de la pulpa de café con NaOH 2%(p/p) y 5
min; y con el tratamiento con ácido sulfúrico al 1% (v/v) y 60 min, se alcanza
rendimientos de conversión superiores al 50%, planteados al inicio.

10. Conclusiones

• El pre tratamiento ácido de la pulpa de café liberó mayor cantidad de

azúcares reductores alcanzando 7.88 g/L y un rendimiento de conversión
de 339% superando la expectativa de obtener mínimo el 50% de
rendimiento.
• El mejor tratamiento fue la condición con ácido al 1% (v/v) y 60 min,
seguido de la hidrólisis enzimática, generando 8.55 ± 0.17 g ART/L a las 4
horas de reacción.
• La enzima celulasas de Trichoderma reseei usada para la hidrólisis es más
eficiente después del pre tratamiento alcalino teniendo una tasa de
conversión mas alta (284.65%) en comparación que la hidrólisis ácida
(135.73%).
• El tratamiento alcalino liberó menor cantidad de azúcares (3.04 g/L) que el
tratamiento ácido(7.88 g/L) pero obtuvo una mejor conversión de azucares
en la hidrólisis alcalina (Fig.7).

36
11. Recomendaciones

• Llevar acabo una hidrólisis enzimática con el tratamiento ácido con

concentración de 1.5% y 30 min (Tabla. 9), y realizar una comparación con
la hidrólisis de 1% y 60 min (Tabla.8)
• Llevar los tratamientos usados a tiempos de 12, 24 y 36 horas de hidrólisis
enzimática para analizar si continúa la liberación de azúcares.
• Realizar una hidrólisis aumentando al doble la cantidad de celulasas de
Trichoderma reseei utilizada, E.G. con 2.480 ml y compararlas con los
resultados de las hidrólisis (Fig. 7 y 8).
• Realizar análisis de High-performance liquid chromatography (HPLC) de los
jugos de los pre tratamiento y las hidrólisis para conocer la cantidad precisa
y el tipo de azúcares reductores totales que se obtuvieron, ya que la
determinación de azúcares por el método de DNS, solo nos indican la
existencia de ellos mas no cuales azúcares ni la cantidad obtenida.
• Realizar la fermentación alcohólica del mejor tiempo obtenido en la
hidrólisis.

37
12. Bibliografía

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41
Anexo.1 Curva patrón de azúcar

Prepare una solución patrón de Glucosa bajo las siguientes concentraciones:

0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7 y 1.9 g/L. Desarrolle la reacción con el reactivo DNS
(mismo método que para las muestras).

Replicas
Concentración (g/L) 1 2 3 Promedio (g/L) DS

0.5 1.70 1.63 1.68 1.67 0.03

0.7 2.33 2.42 2.30 2.35 0.05

0.9 2.78 2.99 2.89 2.89 0.10

1.1 3.84 3.68 3.79 3.77 0.07

1.3 4.32 4.38 4.38 4.36 0.03

1.5 5.19 5.04 4.89 5.04 0.14

1.7 5.46 5.66 5.63 5.58 0.10

1.9 6.07 5.93 6.04 6.01 0.07

42
Anexo.2 Tampón CITRATO

Soluciones Stock

A: Solución 0.1M de ácido cítrico (21.01g en 1000ml de agua destilada)

B: Solución 0.1M de citrato sódico (29.41g de C6H5O7Na3·2H20 en 1000ml de

agua destilada)

X ml de A + y ml de B y diluido en un total de 100 ml de agua destilada

Sol. A (ml) Sol. B (ml) pH

46.5 3.5 3.0
43.7 6.3 3.2
40.0 10.0 3.4
37.0 13.0 3.6
35.0 15.0 3.8
33.0 17.0 4.0
31.5 18.5 4.2
28.0 22.0 4.4
25.5 24.5 4.6
23.0 27.0 4.8
20.5 29.5 5.0
18.0 32.0 5.2
16.0 34.0 5.4
13.7 36.3 5.6
11.8 38.2 5.8
9.5 41.5 6.0
7.2 42.8 6.2

43