CARACTERIZACIÓN DE METALOPORFIRINAS POR

LAS TÉCNICAS DE ELECTROSPRAY Y DESORCIÓN

ASISTIDA POR UNA MATRIZ
Diego Ariza, Laura Pinto, Natalia Rivero, Juliana Villabona.

4 de junio de 2017

Resumen

Las metaloporfirinas son complejos metálicos derivados de las porfirinas, estructuras que
cumplen papeles importantes en muchos procesos biológicos, entre ellas están: la clorofila,
porfirina que contiene magnesio, la vitamina B12 (cobalamina), que contiene cobalto
y porfirina de cobalto. La caracterización de las mismas se llevó a cabo mediante las
técnicas ESI-IT y MALDI-TOF MS, siendo ESI la que aportó mejores resultados en lo
que a resolución del espectro se refiere.

Palabras clave: Metaloporfirna, ESI-IT, MALDI-TOF, espectro, resolución.

Abstract

The metalloporphyrins are derived metal complexes of the porphyrines, this estructures
perform important roles in many biological processes, among these, the chlorophyll, a
magnesium porphyrine, the B12 vitamin (cobalamin), containing cobalt. The characte-
rization was performed by ESI-IT and MALDI-TOF MS, with ESI better results were
obtained in terms of spectrum resolution.

Keywords: Metalloporphyrins, ESI-IT, MALDI-TOF, spectrum, resolution.

1. Introducción sanguı́neos, esta metaloporfirina resulta de
la unión asimétrica de 4 anillos pirrólicos,
Las metaloporfirinas se caracterizan formando un grupo macrocı́clico casi planar
porque al menos un par de electrones en torno a un átomo central de cobalto
2
de los nitrógenos centrales de la cavidad (Co).
porfirı́nica se encuentran coordinados con
un metal,1 son sustancias fundamentales Dada la gran importacia de estas bio-
para el desarrollo de la vida en nuestro moléculas, su caracterización juega un rol
planeta. Una de ellas es la clorofila, cuya relevante en la ciencia, técnicas espec-
función principal es la fotonsı́ntesis, proceso trométricas como ionización por electros-
de almacenamiento y transformación de pray (ESI) y desorción ionización láser asis-
la energı́a solar en energı́a quı́mica; la tida por matriz (MALDI) permiten cumplir
supervivencia de la mayoria de seres vivos este objetivo. En la ionización por electros-
depende de este proceso. La cianocobala- pray la muestra disuelta en un disolvente
mina (vitamina B12) es otro ejemplo de adecuado pasa a través de un capilar metáli-
estas estructuras, su función principal es co, en cuya punta se aplica un potencial
mantener sanas las neuronas y los glóbulos eléctrico que produce una fina niebla de go-

1
tas de elevada carga,3 permitiendo una io- colisones (CID) para una posterior iden-
nización positiva o negativa, ası́ mismo si se tificación de la naturaleza de los fragmentos.
quiere obtener una fragmentación se puede
provocar aumentando el voltaje en la punta
Todos los barridos se llevaron a cabo apli-
del capilar. En el caso de MALDI, una diso-
cando un pontencial entre 4000-4200 Vol-
lución de muestra con una sustancia matriz
tios, en lo que respecta a la muestra se uti-
se deposita en el equipo, tras la evapora-
lizó un volumen total de 20 µL a una con-
ción del disolvente, los cristales de la mezcla
cetración de 5 · 10 – 6 M.
muestra-matriz se irradian con un haz láser
que ioniza las moléculas de ambas sustancias
manteniéndolas en fase gaseosa.3 La matriz
utilizada en MALDI, tiene dos misiones, ab-
sorber el fotón de energı́a procedente del haz
3. Resultados
láser y actuar como un disolvente del ana-
lito reduciendo las fuerzas intermoleculares
y disminuyendo la agregación de moléculas 3.1. MALDI-MS
del mismo.

Los espectros obtenidos al variar la inten-

2. Materiales y métodos sidad de incidencia del láser sobre la muestra
de porfirina de cobalto en una matriz de FV,
2.1. Análisis de clorofilas y sus deri-
se muestran a continuación:
vados provenientes de la espina-
ca, vitamina B12 y porfirina de
Co por MALDI-MS: Figura 1. Espectro de porfirina de
cobalto con incidencia del láser de 10 %
Con este fin, se utilizó un equipo Bru-
ker UltraFleXtreme MALDI-TOF/TOF y
matrices de transferencia a-CHCA, DCTB,
FVCNCH3 y IDTM. Es ası́ como, muestras
de clorofilas y vitamina B12 fueron ana-
lizadas variando la matriz de transferen-
cia protónica, caracterizando los compuestos
por medio de LDI-TOF, finalmente, se mo-
dificó el parámetro de intensidad del láser
para el caso particular de la porfirina de co-
balto, se obtuvieron los espectros respecti-
vos y se compararon los resultados obteni-
dos.
Figura 2. Espectro de porfirina de
2.2. Análisis de vitamina B12 por cobalto con incidencia del láser de 20 %
ESI-MS:
Para este propósito, se usó un es-
pectrómetro de masas de electrospray (ESI)
con trampa iónica (QIT). La muestra
se analizó en modo full scan modo ion
positivo y ion negativo, seguido de esto
se utilizó el modo mejorado como forma
de operación del equipo y finalmente,
se realizó la disociación inducida por

2
 Figura 3. Espectro de porfirina de Figura 6. Espectro de vitamina B12
cobalto con incidencia del láser de 30 % en matriz CHCA

Figura 7. Espectro de vitamina B12

en matriz IDCN

Figura 4. Espectro de porfirina de

cobalto con incidencia láser de 40 %

Figura 8. Espectro de vitamina B12

en matriz IDTM

Figura 5. Espectro de porfirina de

cobalto con incidencia láser de 50 %

Figura 9. Espectro de vitamina B12

en matriz LDI

Ası́ mismo, para la vitamina B12 se regis-

traron los espectros en tres diferentes matri-
ces: CHCA, IDCN, IDTM y LDI.

3
 De la misma manera, se registraron los es- Figura 13. Espectro vitamina B12
pectros de masas de la clorofila en la matriz modo mejorado
DCTB y del extracto de espinacas en LDI

Figura 10. Espectro de clorofilas en

DCTB

Figura 14. Espectro vitamina B12

primera fragmentación

Figura 11. Espectro extracto de es-

pinacas en LDI con irradiancia de 30 %

Figura 15. Espectro vitamina B12

segunda fragmentación

3.2. ESI-MS

Para la experimentación con ESI, se regis-

traron los espectros de la vitamina B12 en
modo positivo y negativo, ası́ como en modo
mejorado.

Figura 12. Espectro vitamina B12 Figura 16. Espectro vitamina B12
modo positivo modo negativo

4
4. Discusión de resultados el cual cabe resaltar que depende en gran
parte de la muestra que se está analizando,
4.1. MALDI-MS y aunque fue una buena forma de operación
A pesar de que los espectros de la porfiri- del equipo se hace necesario el control de
na de cobalto con las diferentes intensidades cada una de las variables, como por ejemplo
de incidencia del láser muestran que al au- la intensidad, para obtener un espectro
mentar la intensidad lo único que se obtiene significativo. En este caso se obtuvieron
es ruido de fondo, es necesario comparar lo solo tres señales con resolución baja, que
obtenido con el patrón isotópico que se ilus- concordaron con el patrón isotópico calcula-
tra en la Figura 17. do (Figura 18), además el espectro contiene
una cantidad de ruido que entorpece el
Figura 17. Patrón isotópico porfirina análisis. El modo mejorado solo mostró
de cobalto cambio en la intensidad de las señales
respecto al modo positivo (Figura 13).

Figura 18. Patrón isotópico de la vi-

tamina B12

El espectro que es más parecido al patrón

isotópico es el mostrado en Figura 2, al
mismo tiempo, este espectro muestra las
mejores relaciones señal ruido, intensidades
mayores y no se observan otros picos
notables por posibles fragmentaciones de la
molécula, como se evidencia en las Figura 4 Se realizó la identificación de los picos de
y Figura 5, lo que permite deducir que no mayor intensidad en el espectro obtenidos y
es necesario, ni útil trabajar con el láser los resultados se relacionaron en la Tabla 1.
a alta irradiancia. Análogamente, para
la vitamina B12, la mejor matriz fue la
Tabla 1. Identificación picos espectro
CHCA, gracias a que presenta la mejor
Vitamina B2 con ESI modo positivo.
relación señal/ruido, ası́ como la menor
fragmentación de todas las matrices usadas, Modo positivo
donde no se presentaban señales por encima m/z Corresponde a
de m/z 1000. 1393 Aducto de potasio
1377 Aducto de sodio
Para el extracto de espinaca en LDI y la 1355 Ion molecular
clorofia en DCTB, no se observa el ion mole- 700 Ganancia de dos Na con Z=2
cular, aunque hay algunos picos cercanos a
este m/z, y se muestra que la mejor matriz
Siguiendo con el modo negativo se en-
para la clorofila fue LDI con intensidad de
contró que la eficiencia de producción de
láser de 30 %
iones fue menor, esto se debe al aumento
del tiempo de acumulación, por otra par-
4.2. ESI-MS
te, es evidente la aparición de señales do-
El primero de los modos utilizados para bles (Figura 16) que tienen coincidencia con
el análisis fue el fullscan modo positivo, el patrón isotópico calculado, estas se pre-

5
sentan gracias a que el barrido se hizo de
manera más lenta lo que conlleva una mejor
resolución pero al mismo tiempo aumento
en la acumulación de iones lo que causa el
Figura 19. Fragmentación de la vita-
mina B12 con el modo fragmentación.
O

H2N

rompimiento del pico debido a la cercanı́a

O
H3C NH2
CH3 C

de los iones en la trampa. En la Tabla 2 se

H3C H2N C
C O
C
C

hizo la identificación correspondiente de los

C O
C N N
H3C NC
NH2 Co

picos más importantes obtenidos en el es-

C O
C O
N C H2N N N
N C

pectro tomado.
C CH3
O
HO CH3
HO P O CH3 CH3
NH
O C

Tabla 2. Identificación picos espectro

O NH2
H3C
O

Vitamina B2 con ESI modo negativo.

Modo negativo 5. Conclusiones

m/z Corresponde a
1401 Ganancia de dos Na
1393 Aducto de potasio
1373 Perdida molécula de H2 O
1355 Ion molecular
1354 Perdida H+
677 Molécula con Z=2
Finalmente se utilizó la trampa de io-
nes para realizar tándem en tiempo, aquı́ se
aplicó un voltaje de corriente directa y ocu-
rrieron las fragmentaciones de la muestra,
las cuales evidencian mejores resoluciones e
intensidades respecto a los modos anterio-
res. Es importante recordar que la molécula
protonada es capa cerrada es decir no pudo
perder radicales. Igual que en los casos an-
teriores se hizo un análisis de los picos más
representativos obtenidos en el espectro, los
resultados se relacionaron en la Tabla 3 y
esta vez además se ilustra en la Figura 19
los fragmentos perdidos por la molécula y
se relaciona con su respectivo pico.
Tabla 3. Identificación picos espectro
Vitamina B2 con ESI modo fragmenta-
ción.
Modo fragmentación
m/z Corresponde a
1355 Ion molecular
1270 *Perdida de neutral
1209 *Perdida de neutral
1124 *Perdida de neutral
997 *Perdida de neutral
*Ver Figura 19.
Comparando los resultados obtenidos
con ESI y MALDI en la caracterización
de metaloporfirinas se determinó que
ESI es la técnica más óptima para reali-
zar este estudio con base en la observa-
ción de una mejor relación señal/ruido,
picos mejor definidos en los espectros de
masas y adicionalmente porque la pre-
paración de la muestra para el análisis
es mı́nima.
En un análisis con ESI el tiempo de acu-
mulación, la velocidad de barrido, y el
voltaje aplicado para la formación del
electrospray son variables fundamenta-
les que tienen un alto impacto en la re-
solución e intensidad de los picos resul-
tantes en un espectro de masas, por eso,
es importante establecer las condiciones
adecuadas para realizar una buena ca-
racterización.
6. Referencias
1. Sheldon, R. A., Metalloporphyrins in
catalytic oxidations; CRC Press: 1994.
2. Forrellat Barrios, M.; Gómis
Hernández, I. y Gautier du Défaix
Gómez, H. Revista Cubana de Hema-
tologı́a, Inmunologı́a y Hemoterapia
1999, 15, 159-174.
3. Gross, J. H., Mass spectrometry: a text-
book; Springer Science & Business Me-
dia: 2006.