Genética Clínica.

Tarea 1
Teoría y Laboratorio

1. Explicar los experimentos y evidencias de que el DNA es el portador

de la información genética

El trabajo de Gregor Mendel mostró que los rasgos (como el color de las flores en
plantas de guisantes) no se heredaban directamente, sino que en realidad eran
especificados por genes que pasan de padres a hijos. El trabajo de otros científicos
más a comienzos del siglo XX, como el de Theodor Boveri, Walter Sutton y Thomas
Hunt Morgan, estableció que los factores hereditarios de Mendel probablemente se
encontraban en los cromosomas.

En 1928, el bacteriólogo británico Frederick Griffith llevó a cabo una serie de

experimentos con ratones y bacterias Streptococcus pneumoniae. Griffith no
intentaba identificar el material genético, sino en realidad trataba de desarrollar una
vacuna contra la neumonía. En sus experimentos, Griffith utilizó dos cepas de
bacterias relacionadas, conocidas como R y S.

 Cepa R. Cuando se cultivan en una caja de Petri, las bacterias R formaban colonias,
o grupos de bacterias relacionadas, que tenían bordes bien definidos y un aspecto
rugoso (de ahí la abreviatura "R"). Las bacterias R no eran virulentas; es decir, al
inyectarse en un ratón no causaban enfermedad.

 Cepa S. Las bacterias S forman colonias redondas y lisas (la abreviatura "S" es por
la palabra "smooth" en inglés). La apariencia lisa se debía a una envoltura de
polisacárido, a base de azúcares, que producían las bacterias. Esta capa protegía a
las bacterias S del sistema inmunitario del ratón, por lo que resultaban virulentas
(capaces de causar enfermedad). Los ratones a los que se les inyectaban bacterias
S vivas desarrollaban neumonía y morían.

Como parte de sus experimentos, Griffith inyectó bacterias S muertas por calor en
ratones (es decir, bacterias S que se calentaron a altas temperaturas, lo que causó
la muerte de las células). Como era de esperarse, las bacterias S muertas por calor
no enfermaron a los ratones.

Sin embargo, los experimentos tomaron un giro inesperado cuando inocuas

bacterias R se combinaron con las inofensivas bacterias S muertas por calor y se
inyectaron en un ratón. El ratón no solo desarrolló pnenumonia y murió, sino que
 cuando Griffith tomó una muestra de sangre del ratón muerto, ¡encontró que
contenía bacterias S vivas.

Griffith concluyó que las bacterias de la cepa R debían haber tomado lo que él llamó
"principio transformante" de las bacterias S muertas por calor, que les permitió
"transformarse" en bacterias con cobertura lisa y volverse virulentas.

En 1944, tres investigadores canadienses y estadounidenses, Oswald Avery, Maclyn

McCarty y Colin MacLeod, se propusieron identificar el "principio transformante" de
Griffith.

Para ello, comenzaron con grandes cultivos de células S muertas por calor, y
mediante una larga serie de pasos bioquímicos (que se determinaron por cuidadosa
experimentación), purificaron progresivamente el principio transformante al lavar,
separar o destruir enzimáticamente los otros componentes celulares. Con este
método, fueron capaces de obtener pequeñas cantidades de principio transformante
altamente purificado, el cual podían luego analizar con otras pruebas para
determinar su identidad

Varias líneas de evidencia les sugirieron a Avery y a sus colegas que el principio
transformante podría ser el ADN.

 La sustancia purificada dio un resultado negativo en las pruebas químicas conocidas

para detectar proteínas, pero un resultado fuertemente positivo en un examen
químico conocido para detectar ADN.

 La composición elemental del principio transformante purificado era muy semejante

a la del ADN en su proporción de nitrógeno y fósforo.
 Enzimas que degradan proteínas y ARN tenían poco efecto sobre el principio
transformante, pero las enzimas capaces de degradar ADN eliminaban la actividad
transformante.

Todos estos resultados apuntaban hacia el ADN como el probable principio

transformante. Sin embargo, Avery fue cauteloso en la interpretación de sus
resultados. Se dio cuenta de que era posible que alguna sustancia contaminante
presente en pequeñas cantidades, y no el ADN, fuera el principio transformante real

Debido a esta posibilidad, el debate sobre el papel del ADN continuó hasta 1952,
cuando Alfred Hershey y Martha Chase utilizaron un enfoque diferente para
identificar concluyentemente al ADN como el material genético

Hershey y Chase estudiaron bacteriófagos, virus que atacan bacterias. Los fagos que
utilizaban eran simples partículas compuestas de proteína y ADN, con sus
estructuras externas hechas de proteínas y el núcleo interno compuesto por ADN.

Hershey y Chase sabían que los fagos se unían a la superficie de una célula
bacteriana hospedera e inyectaban alguna sustancia (ya sea ADN o proteínas) en el
hospedero. Esta sustancia daba "instrucciones" que causaban que la bacteria
hospedera comenzara a producir montones y montones de fagos, es decir, este era
el material genético del fago. Antes del experimento, Hershey pensaba que el
material genético resultaría ser proteína.

Para establecer si el fago inyectaba ADN o proteína en las bacterias hospederas,

Hershey y Chase prepararon dos lotes diferentes de fagos. En cada lote, el fago se
produjo en presencia de un elemento radioactivo específico que se incorporó a las
macromoléculas (ADN y proteínas) que componían el fago.

 Una muestra se produjo en presencia de 35S, un isótopo radiactivo de azufre. El

azufre se encuentra en muchas proteínas y está ausente en el ADN, por lo que este
tratamiento solo marcaba radiactivamente las proteínas del fago.

 La otra muestra se produjo en presencia de 32P, un isótopo radiactivo de fósforo. El

fósforo se encuentra en el ADN y, pero no en las proteínas, por lo que este
tratamiento solo marcaba radiactivamente el ADN del fago (y no sus proteínas).

Cada lote de fagos marcados radiactivamente se utilizó para infectar un cultivo

diferente de bacterias. Después de que ocurría la infección, cada cultivo se metía en
una licuadora para retirar cualquier fago o fragmento de fago restante del exterior
de las células bacterianas. Finalmente, los cultivos se centrifugaron, o giraron a altas
velocidades, para separar las bacterias de los residuos de fago.
La centrifugación causa que el material más pesado, como las bacterias, se mueva
a la parte inferior del tubo y forme una masa llamada sedimento. El material más
ligero, como el fago, los fragmentos de fago y el medio (caldo) que se usó para
alimentar a las bacterias, permanece cerca de la parte superior del tubo y forma una
capa líquida llamada sobrenadante.

Cuando Hershey y Chase midieron la radioactividad del sedimento y del

sobrenadante en ambos de sus experimentos, encontraron que una gran cantidad
de 32P aparecía en el sedimento, mientras que casi todo el 35S aparecía en el
sobrenadante. Con base en esto y otros experimentos similares, Hershey y Chase
concluyeron que el ADN, y no la proteína, se inyectaba en las células del hospedero
y constituía el material genético de los fagos.

2. Señalar los constituyentes químicos que forman la molécula de DNA y la

importancia biológica del ADN

3. Describir el modelo de Watson y Crick del DNA y el Dogma Central

de la Biología Molecular, su alteración y la biología del prión.

La estructura del ADN, representada según el modelo de Watson y Crick, es una

hélice dextrógira de doble cadena antiparalela. El esqueleto de azúcar-fosfato de las
cadenas de ADN constituye la parte exterior de la hélice, mientras que las bases
nitrogenadas se encuentran en el interior y forma pares unidos por puentes de
hidrógeno que mantienen juntas a las cadenas del ADN.
El ADN de doble cadena es una molécula antiparalela, lo que significa que se
compone de dos cadenas que corren una junto a la otra, pero en direcciones
opuestas. En una molécula de ADN de doble cadena, el extremo 5' (el que termina
con un grupo fosfato) de una cadena se alinea con el extremo 3' (el que termina
con un grupo hidroxilo) de su pareja y viceversa.

las dos cadenas de ADN giran una alrededor de la otra para formar una hélice
dextrógira. Todas las hélices tienen direccionalidad, que es una propiedad que
describe cómo se orientan los surcos en el espacio.

La torsión de la doble hélice del ADN y la geometría de las bases crea un hueco más
amplio (llamado surco mayor) y un hueco más estrecho (llamado surco menor) que
corren a lo largo de la molécula. Estos surcos son importantes sitios de unión para
las proteínas que mantienen el ADN y regulan la actividad de los genes.

las dos cadenas de la doble hélice del ADN se mantienen unidas por puentes de
hidrógeno entre las bases nitrogenadas en cadenas opuestas. Cada par de bases
forma un "peldaño" en la escalera de la molécula de ADN.

Los pares de bases no se forman por cualquier combinación de bases. Por el

contrario, si hay una A en una cadena, deben estar emparejada con una T en la otra
(y viceversa). Del mismo modo, una G en una cadena siempre debe tener una C
como compañera en la cadena opuesta. Estas correspondencias entre A-T y G-C se
conocen como pares de bases complementarias.

El dogma central de la biología molecular es un concepto que ilustra los mecanismos

de transmisión y expresión de la herencia genética tras el descubrimiento de la
codificación de ésta en la doble hélice del ADN. Esto nos propone que existe una
unidireccionalidad en la expresión de la información contenida en los genes de
una célula, es decir, que el ADN se transcribe como ARN mensajero y que éste
se traduce como proteína, elemento que finalmente realiza la acción celular. El
dogma también postula que sólo el ADN puede duplicarse y, por lo
tanto, reproducirse y transmitir la información genética a la descendencia. Francis
Crick expresó el dogma central por primera vez en 1958.

4. Explicar el mecanismo de la replicación semiconservativa del DNA

(Experimento de Messelson y Stahl)

Cuando se descubrió la doble hélice de DNA y la complementariedad entre las dos

hebras, se hizo la hipótesis de que la replicación del DNA sucedería por un
mecanismo de copia, en el que las dos hebras de la molécula parental se separasen,
rompiéndose los puentes de hidrogeno, y cada hebra de la molécula parental sirviera
de molde para fabricar la complementaria. Este modelo dereplicación recibe el
nombre de sistema semiconservativo por que en cada molécula hija una hebra es
de nueva síntesis, y la otra es la hebra vieja que ha servido de molde; o sea que se
conserva la mitad de lo que había.

5. Describir el fenómeno de replicación del DNA a nivel molecular mencionando

las enzimas que intervienen
6. Explicar la técnica de hibridación y su importancia.****

La capacidad del DNA desnaturalizado de reunirse (o sea, de volver a formar pares

de bases entre cadenas complementarias) permite la formación de moléculas
híbridas cuando se mezclan moléculas de DNA homólogas desnaturalizadas
provenientes de dos fuentes diferentes y se mantienen condiciones apropiadas de
fuerza iónica y temperatura. El proceso de apareamiento de bases entre
monocadenas de polinucleótidos complementarios provenientes de fuentes distintas
se denomina hibridación.

7. Explicar los principales mecanismos de reparación del DNA

(fotorreactivación enzimática, reparación por escisión y reparación
por recombinación)

El proceso llamado fotorreactivación, pues solo sucede en presencia de la luz,

consiste en que la enzima llamada fotoliasa, presente en todos los organismos,
reconoce el dimero de timina, se coloca sobre él y revierte la primera reacción
dejando las dos timinas normalmente apareadas con las adeninas de la hebra
complementaria.

Otros daños en el DNA pueden también repararse por un mecanismo, que no

requiere luz llamado por ello reactivación oscura o reparación escindidora, que se
lleva a cabo por la enzima UvrABC, que corta unos cuantos nucleótidos de la hebra
dañada a ambos lados del dímero, luego un DNA polimerasa rellena el hueco y,
finalmente, una ligasa restablece el esqueleto azúcar fosfato.

En los sistemas antes mencionados, la hebra vieja sirve de molde a las enzimas
reparadoras para sintetizar los nucleótidos correctos, pero cuando ambas hebras
han sido dañadas y no existe molde, incluso se puede reparar el daño siempre que
esté presente en la célula otra copia completa y correcta del trozo dañado, es decir,
que ese trozo de DNA se encuentre en condición diploide. En las bacterias esto
puede ocurrir si de las dos moléculas hijas producidas por la replicación, una de ellas
estuviera dañada. Se piensa que la reparación en este caso debe ser por un
mecanismo de recombinación de modo que el trozo correctosea copiado de una
molécula y empalmado en la otra molécula donde estaba el error, aunque se
desconoce en detalle como sucede.

8. Explicar los diferentes tipos de mutaciones (transversiones, deleciones,

inserciones, etc.) en un punto y sus consecuencias.

9. Explicar los mecanismos químicos y físicos de la mutación,

utilizando como ejemplo los siguientes mutágenos químicos (5-
bromouracilo, 2-aminopurina, ácido nitroso, hidroxilamina y
acridina)****

Entre lo mutágenos más utilizados están los análogos de base, como la 2-

aminopurina (AP) y el 5-bromouracilo (5-BU), llamados así porque su molécula tiene
una forma semejante a una base del DNA, pero tienen diferentes propiedades de
apareamiento. Por ejemplo, el 5-BU es un análogo de la timina que solo se diferencia
de ella por tener un átomo de Bromo en lugar del grupo metilo de la timina. La
estructura normal (forma ceto) del 5-BU empareja con la adenina; sin embargo, el
5-BU puede cambiar con frecuencia a la forma enol o a una forma ionizada que
empareja con la guanina. Ésta en otra replicación se apareará con su
correspondiente citosina. Por lo tanto, se ha producido una transición de AT a GC.

El ácido nitroso, la hidroxilamina, son moléculas que reaccionan directamente con el

ADN, el cual no está replicándose, ocasionando cambios químicos en las bases lo
que provoca apareamientos incorrectos. Se llama transición si se pasa de una base
púrica a otra forma de apareamiento de otra base púrica o de una pirimidina en otra
pirimidina; se denomina transversión si una purina se convierte en una pirimidina.

Son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases del ADN,
separándolas entre sí. Durante la replicación, esta conformación anormal puede
conducir a inserciones o deleciones en el ADN, originando mutaciones por
corrimiento de lectura. Las sustancias más características de este grupo son
las acridinas (naranja de acridina), bromuro de etidio y proflavina.
Los colorantes de acridina actúan insertándose ellos mismos entre dos bases púricas
vecinas de un sólo filamento del ADN.

10. Explicar las mutagénesis dirigidas o mutación específica.

Todos los agentes mutagénicos producen las mutaciones al azar, puesto que,
aunque tengan un mecanismo de acción especifico el nucleótido afectado 0puede
estar en cualquier posición del DNA. Con la tecnología del DNA recombinantes se ha
conseguido realizar una mutagénesis dirigida sobre el gen concreto que se está
interesado en investigar.

es una técnica de biología molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en

una cadena de ADN.

11. Explicar los fundamentos bioquímicos de la extracción de ADN

12. ¿Qué otros métodos de extracción de ADN existen? ¿En qué se basan?

13. Propiedades físicas y químicas del ADN

14. ¿Qué aplicaciones tiene el ADN obtenido? ¿En qué áreas se puede usar?