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Informe n°1

Bioseguridad en laboratorio de
microbiología
1. Esquematice el área del laboratorio
2. Explique el nivel de seguridad que debe
tener el laboratorio en el que usted trabaja.
En cualquier laboratorio, se deben tomar precauciones para que
las personas que realizan investigación o tratan de identificar
organismos no se infecten. Debido a este peligro, los laboratorios
deben adherirse a normas de seguridad muy específicas para
trabajar con organismos que pueden constituir una amenaza
para la salud humana.
Los laboratorios se dividen en 4 niveles de bioseguridad, y las
prácticas obligatorias de protección aumentan con cada nivel.
 Nivel de Bioseguridad 1
Este nivel no representa una amenaza para la salud humana; esto
quiere decir que aparentemente no causan enfermedad en
adultos saludables.
Para este nivel sólo se requieren prácticas estandarizadas de
trabajo en laboratorio.
 Lavado frecuente de manos, especialmente después de
quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio.
 Límites en el acceso al espacio del laboratorio al trabajar;
 No fumar, comer, beber, o almacenar alimentos en el
laboratorio;
 Descontaminación de superficies de trabajo después de
cada uso y después de cualquier derrame;
 Descontaminación de desechos del laboratorio;
 Uso de pipetas mecánicas (no usar la pipeta por medio de
succión oral);
 Tener precauciones al usar objetos punzantes, lo que
incluye el uso de contenedores especiales para desecho
de agujas y otros objetos punzantes.
 Nivel de Bioseguridad 2
Se requiere generalmente para trabajar con cualquier derivado
de sangre humana, otros fluidos corporales o tejidos en los cuales
la presencia de un agente infeccioso puede ser desconocida. Al
trabajar los principales peligros para el personal son pinchaduras
accidentales con agujas, infección potencial mediante
exposición a los ojos y nariz e ingestión de materiales infecciosos.
Sin embargo, se debe tener extremo cuidado con las agujas e
instrumentos punzantes cuando éstos están contaminados con
estos agentes.
 Nivel de Bioseguridad 3
Debe utilizarse cuando el trabajo de laboratorio se realiza con
agentes nativos o exóticos que tienen potencial de ser
transmitidos por vía respiratoria (aerosol) y que pueden causar
infecciones serias y potencialmente letales.
 Entrenamiento específico para el personal de laboratorio,
en el manejo de agentes potencialmente letales.
 Descontaminación de todos los desechos.
 Cambio de ropas de protección de laboratorio y
descontaminación de toda la ropa de laboratorio antes de
su lavado
 Nivel de Bioseguridad 4
Agentes peligrosos y exóticos que poseen un alto riesgo de
infección y riesgosos para la vida, y agentes infecciosos de
transmisión por vía aérea se encuentran en laboratorios 4.
También se estudian en estos laboratorios agentes relacionados
con riesgo de transmisión desconocido. Estos agentes suponen un
alto riesgo de enfermedad mortal, pueden ser transmitidas por vía
aerosol (respiratoria) y no tienen vacuna o terapia disponible Las
prácticas de laboratorio para el BSL-4.
 Acceso estrictamente controlado al laboratorio,
 Cambio de ropa antes de entrar y salir del laboratorio (se
recomienda ducharse al salir del laboratorio) y
 Descontaminar todo el material al salir del lugar. Las
barreras primarias incluyen la realización de procedimientos
en gabinetes de bioseguridad usados en los otros niveles de
bioseguridad en combinación con un traje que cubre todo
el cuerpo, con oxígeno y presión positiva.

3. Defina los siguientes términos:


 Antimicrobiano:
Es una sustancia química que, a bajas concentraciones, actúa
contra los microorganismos, destruyéndolos o inhibiendo su
crecimiento.
 Antiséptico:
Es un desinfectante, se dice de los agentes que impiden la
proliferación de microorganismos en los tejidos corporales. Por lo
tanto, son capaces de prevenir las infecciones y enfermedades
provocadas por los microorganismos.
 Biocida:
Son aquellos destinados a destruir, neutralizar, impedir la acción o
ejercer control de otro tipo sobre cualquier microorganismo dañino
por medios químicos o biológicos. Algunos ejemplos son los
desinfectantes, conservantes, pesticidas, herbicidas, fungicidas e
insecticidas.
 Descontaminación:
Es la eliminación total o parcial de los elementos que contribuyen a
disminuir la pureza del medio ambiente, de sustancias o
microorganismos no deseados en una mezcla.
 Desinfección:
Es la destrucción de los microorganismos patógenos ya sea por
medios químicos, mecánicos o físicos, los cuales pueden causar
infecciones.
 Desinfectante:
Es un proceso físico o químico que mata o inactiva a los
microorganismos tales como bacterias, virus y protozoos.
 Esporicida:
Es un producto químico o de otro tipo que destruye las esporas.
 Esterilización:
Es la eliminación o muerte de todos los microorganismos que
contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran
acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse
nuevamente.
 Germicida química:
Es un producto químico que se emplea para destruir gérmenes;
desinfectante.
 Microbicida:
Antibiótico o agente químico que destruye microbios.
Informe n°2
Reconocimiento y esterilización de
materiales para el cultivo bacteriano
Nombre del Caracteristicas
Usos
equipo
Las colonias pueden Sirve para
marcarse con un
Contador de aumentar la
rotulador o un puntero
colonias de recuento, cada vista de
vez que se toca la colonias que
placa con el puntero crecen en
de recuento se
una placa
incrementa una
unidad en el contador con el fin de
y suena un avisador. facilitar su
El máximo número de identificació
colonias que pueden n y conteo.
ser efectivamente
contadas esta entre
100 y 1000.
Funcionan Sirve para
Autoclave permitiendo la esterilizar
entrada o material de
generación de laboratorio,
vapor de agua utilizando
pero
vapor de
restringiendo
agua a alta
su salida, hasta
presión y
obtener una
presión interna
temperatura,
de 103 kPa, lo evitando con
cual provoca las altas
que el vapor presiones que
alcance una el agua llegue
temperatura a ebullir a
de 121 grados pesar de su
centígrados. alta
temperatura.
Las Se usa para
incubadoras
Estufa esterilizadora más simples
el secado
van de 20°a y/o
65°, aunque esterilización
pueden en seco de
alcanzar
temperaturas material de
mayores a laboratorio.
100°C.
Temperatura
optima de
crecimiento
generalmente
35_37°.
Los rangos de
temperatura en
Se emplea
los cuales frecuentemente
Baños de agua normalmente son
utilizados están
para inactivar el
entre complemento
temperatura
ambiente (20-
de sueros que
22°C) y los 60°C. van a ser
También se
pueden
sometidos a
seleccionar procedimientos
temperaturas de
100°C.
serológicos.
Presentan un
termostato que
regula la
temperatura del
agua y un piso
para colocar los
materiales que
desea.

Son barreras Se emplea para


primarias trabajar de modo
Cámara de bioseguridad
diseñadas para la
seguro con
contención y
protección del materiales
material contaminados (o
biológico- potencialmente
infeccioso, contaminados) con
reduciendo el agentes patógenos y
riesgo de
forma parte
contaminación
por salpicaduras y del equipamiento de
aerosoles para el laboratorio de
trabajador y su muchas unidades
entorno. biomédicas.
Mechero o Está constituido por
un tubo vertical que
Es utilizado
Quemador Bunsen va enroscado a un para
pie metálico con
ingreso para el flujo
calentar o
de gas, el cual se esterilizar
regula a través de
una llave sobre la
muestras o
mesa de trabajo. En reactivos
la parte inferior del
tubo vertical existen
químicos.
orificios y un anillo
metálico móvil o
collarín también
horadado, se logra
regular el flujo llevar
a cabo la
combustión.
Reconocimiento de materiales de
vidrio
Nombre del material Caracteristicas Usos
Placa Petri Recipiente redondo, Es utilizado para
hecho de vidrio o de poder observar
plástico, posee diferentes tipos de
diferentes diámetros, muestras tanto
es de fondo bajo, biológicas como
con una cubierta de químicas. Las
la misma forma que cuales se
la placa, pero un encuentran
poco más grande de encerradas dentro
diámetro. de la placa.

Pipeta Está compuesto por Se usa para medir


un tubo transparente volúmenes de
que termina en una líquidos con gran
de sus puntas de precisión y
forma cónica, y tiene exactitud.
una graduación (una
serie de marcas
grabadas) con la
que se indican
distintos volúmenes.
Tubo de ensayo Es un pequeño tubo Se utiliza para
de vidrio con una contener
abertura en la zona pequeñas muestras
superior, y en la zona líquidas, y preparar
inferior es cerrado y soluciones.
cóncavo.

Hecho de un vidrio
especial que resiste
las temperaturas muy
altas, sin embargo los
cambios de
temperatura muy
radicales pueden
provocar el
rompimiento de tubo
(Pírex).

Tecnicas de esterilizacion de
materiales y medios de cultivo
Esquema de la tecnica de esterilizacion de materiales de vidrio

 Esterilización de tubos de ensayo


Antes de su esterilización se deben elaborar tapones que cubrirán los
tubos.

o Los tapones serán de algodón un


pedazo conveniente y extendido de
forma rectangular.

o Se realizara una dobles a lo largo de


la fibra y se iniciara a enrollar de un
extremo presionando y
completando toda la longitud.
o El tapón debe entrar en el tubo hasta la mitad y la
otra mitad quedara fuera.

o Formar un paquete de tres tubos y envolver con


papel Kraft.

 Esterilización de Placa Petri


o Se obtiene una placa

o Se recorta el papel Kraft, para obtener pedazos de papel que


puedan cubrir la placa.
o Para envolver la placa la tapa se coloca boca abajo y se
inicia a envolver, realizando un doblez en medio y extremos.

Esquema de técnica de preparación y esterilización de medios


de cultivo
 Preparación del caldo nutritivo
 Tenemos caldo nutritivo en un frasco.

 Agregamos 50 ml de agua destilada y


mover el frasco.

 Es llevado a baño maría (dentro de un


termo) hasta hervir.
 Por último es divido en tubos de ensayo.
 Preparación de agar nutritivo
 Pesar 1,5 de agar agar en un papel metálico.

 Vaciar en un frasco vacío la muestra pesada, luego agregar 50 ml de


agua y dejar reposando.

 Posteriormente es llevado a baño maría (dentro de un termo) hasta


hervir.
 Para terminar se divide en las placas Petri.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización en la
autoclave?
El fundamento de la esterilización en el autoclave es que coagula las
proteínas de los microorganismos debido a la alta presión y temperatura,
matando todos los patógenos que puedan estar presentes en el material.

2. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la


efectividad de la esterilización en la autoclave?
Las medidas que se podría tomar para verificar la efectividad de la
esterilización en la autoclave son:

 El vapor tiene que estar en contacto directo con el material a


esterilizar (por lo que la carga de los elementos es muy importante). -
Crear el vacío efectivo con el fin de desplazar todo el aire presente
inicialmente en la autoclave y su sustitución por vapor.
 Implementar un programa de control bien diseñado para la
evaluación del vapor y la refrigeración, de modo que la carga no se
deteriore.

3. ¿En qué se fundamenta los parámetros de control


en la autoclave?
Los parámetros de control en el autoclave se fundamentan por:

 Presión de vapor:
El vapor será saturado y libre de impurezas utilizando agua tratada.
La pureza del vapor, la saturación y la disponibilidad del vapor son
importantes variables del proceso. De la calidad del vapor depende
que la esterilización sea efectiva o no. Éstas impurezas pueden oxidar
el instrumental.
 Tiempo de esterilización:
Tiempo de exposición del producto o de la cámara a la temperatura
de esterilización. Es la duración de la fase de esterilización.
 Temperatura de esterilización:
Temperatura a la que se mantiene la cámara durante la fase de
esteriliza

4. ¿Cuáles son las imitaciones del uso de la autoclave


cuando se trata de esterilizar?
Las principales limitaciones de la autoclave están relacionadas a los
recursos necesarios para su operación y los peligros involucrados en la
misma. Por ejemplo en la seguridad una autoclave funciona aplicando
vapor muy caliente para tratar los materiales en el interior de dicha
maquina en un ambiente de alta presión. Si la autoclave sufre una grieta o
fisura, el vapor puede escaldar al operador. También una de sus
limitaciones está en que por usarvapor de agua a altas temperaturas para
la esterilización se hace imposible poder esterilizar papel o pastico.

5. Fundamento químico de un mechero de gas


Químicamente un mechero de gas fundamenta su función en que esta se
da por combustión de una mezcla de gases, tiene un orificio en la base por
el cual entra el aire para formar la mezcla con el gas combustible.

6. ¿Cuáles son las partes de un contador de colonias


y como se utiliza?
Las partes del contador de colonias son: Lupa, lectura borrado prendido y
apagado y plataforma donde se coloca la placa Petri.

Se utiliza para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos


que crecen en un aplaca de agar.

7. ¿Cuáles son los componentes del sistema óptico


del microscopio y cómo funcionan para la imagen de
un objeto?
Sus estructuras participan en el proceso de formación de la imagen y son
conocidos como lentes ópticos. Existen tres tipos de lentes: ocular, objetivo
y condensador. El ocular y el objetivo participan directamente en la
formación de una imagen de mayor tamaño que la del objeto observado.
Existen además varios lentes objetivos, cada uno con diferente aumento,
que se ubican en una estructura llamada revólver. El condensador es otro
tipo de lente, pero su función es diferente: concentra la luz en el mismo
plano del objeto, de manera que permite una correcta iluminación
asegurando una imagen nítida y clara.

8. ¿Porque y como se realiza la esterilización por


tindalización?
La tindalización es un método de esterilización que permite eliminar las
esporas y las bacterias resistentes a las temperaturas elevadas.
Específicamente 3 fases de 100°C por 30min por una fase diaria. Se
renueva la operación hasta que las formas vegetativas son eliminadas y el
ambiente ha quedado totalmente esterilizado.

9. ¿En qué consiste el método de pasteurización?


En un método de esterilización para líquidos que aumenta la temperatura
por un tiempo determinado, buscando no afectar tanto su física, química y
propiedades organolépticas

10. Defina Liofilización


La liofilización es un método de desecación en el que se elimina el agua
por congelación del producto húmedo y posterior sublimación del hielo en
condiciones de vacío. Al suministrar calor el hielo sublima y se evita el paso
por la fase líquida. Para acelerar el proceso se utilizan ciclos de
congelación-sublimación con los que seconsigue eliminar prácticamente
la totalidad del agua libre contenida en el producto original.

11. Defina Sonicación


La sonicación es el proceso de convertir una señal eléctrica en una
Vibración física que puede ser dirigida hacia una sustancia. Los
sonicadores son equipos vitales de laboratorio y se utilizan para muchos
propósitos. La sonicación se realiza generalmente para separar
compuestos o células para su examen más detallado. La vibración tiene un
efecto muy poderoso en las soluciones, haciendo que sus moléculas se
separen y las células se rompan.
Informe n°3
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
I. INTRODUCCIÓN:
Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio
para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado,
un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos)
y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento
microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo
axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos.
Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo
contaminante.

Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre,


fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas
vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden
colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras.

El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios


bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al
enfriarse a 40°C.
De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se


denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

• Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para


estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).

• Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios


inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas
visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbiólogo reconocer
la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia
no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para
la determinación de células viables (recuento en placas).
De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
• Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición
exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son
medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los
nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

• Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del


medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto
de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las
cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy
utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de
requerimientos nutricionales muy complejos.
De acuerdo a su función, los medios de cultivo se clasifican como:

• Medios selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes


añadidos, los cuales inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos
de especies de bacterias y/o promoverán el crecimiento de las especies
deseadas. Uno puede ajustar las condiciones físicas de un medio de cultivo
tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos
de interés.

• Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes


tipos de bacterias con base en alguna característica observable en su
patrón de crecimiento en el medio, ya sea por producción de algún
pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH,
o por halos de degradación de algún componente en el medio de cultivo.

• Medios de enriquecimiento: Contienen algún componente que permite el


crecimiento de cierto tipo específico de bacteria, pero no contienen
sustancias inhibidoras.

• Medios enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que


requieren un gran número de factores de crecimiento. Generalmente
contienen extractos biológicos poco usuales como sangre, suero en polvo,
extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc.
Medio de cultivo 1 Medio de cultivo 2
Medio de cultivo Caldo nutritivo Agar nutiritivo
Cantidad
preparada 50 ml 50 ml

Cantidad 1,5 g
pesada
Aspecto ambar amarillento
Estado físico liquido solido

Tipo de medio cultivo

complejo Complejo
Según la naturaleza de
los ingredientes

Según el propósito de basal Basal


uso
Distribución Tubo de ensayo Placa Petri

Condiciones de 121°C x 15’ 121°C x 15’


esterilización

Condiciones de Refrigeración Refrigeración


almacenamiento
II. CUESTIONARIO

1. Explique la función que cumplen cada uno de los componentes de los


medios de cultivo preparados.

 Peptona de caseína: fuente de carbono y nitrógeno necesarios para el


adecuado desarrollo bacteriano.
 Cloruro de sodio: Se utiliza para eliminar bacterias lábiles.

 Extracto de carne: fuente de carbono y nitrógeno necesarios para el


adecuado desarrollo bacteriano.
 Agar: Agente de solidificación inerte

2. Describa el fundamento de 3 medios selectivos ,3 medios diferenciales y


3 medios de enriquecimiento.

a) Medios selectivos

 Agar S.S.: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella


spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se
sospeche su presencia.
La selectividad, está dada por las sales biliares y el verde brillante, que
inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los
coliformes.
 Mac Conkey Agar: Es selectivo porque contienen sales biliares que
inhiben el crecimiento de los Gram positivos.

 Brucella agar: Medio recomendado para el aislamiento y cultivo de


Brucella spp.
Con la adición de sangre, el medio se usa para el aislamiento y cultivo
de Brucella spp. y de microorganismos aerobios y anaerobios
nutricionalmente exigentes, a partir de una gran variedad de muestras
clínicas. También es útil para observar reacciones de hemólisis.

b) Medios diferenciales

 Mac Conkey Agar: Es diferencial porque contiene Lactosa y Rojo


Fenol lo que permite diferenciar los microorganismos que fermentan
las Lactosa (lactosa positivos) de los que no lo hacen (Lactosa
negativos).

 Agar S.S.: Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la


formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

 TSI(TRIPLE SUGAR IRON: Busca determinar la capacidad de la bacteria


para degradar los azucares, formación de gas y sulfuros de
hidrógeno.
La fermentación aeróbica se produce en la parte de arriba del tubo
y la anaeróbica en el fondo del tubo. La presencia de gas se debe al
CO2 producto de la fermentación.

c) Medios de enriquecimiento

 Agar sangre :es una combinación de un agar base (agar nutritivo)


con el agregado de 5 % de sangre ovina, también puede usarse
sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre
aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver
la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es
un factor de virulencia).

 Agar cled: usado en el aislamiento y diferenciación de organismos


urinarios. Al ser deficiente en electrólitos, previene del crecimiento
exagerado de las especies de Proteus. El agar CLED tiene la
característica de ser semitransparente y por la acción del azul de
bromofenol las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa se
tiñen de color amarillo mientras que las no fermentadoras se tiñen de
azul.
 Agar Chocolate (CHOC) Es una variante del agar sangre.
Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave
calentamiento a 56 °C. Este agar se usa para el delicado y exigente
crecimiento de bacterias respiratorias.
Estas bacterias necesitan factores de crecimiento, como el NAD y
hematina. El agar se llama así debido a su parecido con el chocolate,
pero no contiene nada de este.
Debido a que este medio soporta muchos tipos de bacterias, no es
muy útil para coprocultivos.
Informe n°4
SIEMBRA BACTERIANA
¿Qué significa sembrar?

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra


(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano,
para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo
se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

 Que se efectúen asépticamente


 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire.
 De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

Tener en cuenta:

 Temperatura de incubación

 Condición de oxigeno

 Tiempo de incubación

¿Dónde y para que sembramos?

Sembramos en medios de cultivo para hacer que las bacterias se


reproduzcan con el objetivo de aumentar el número de individuos de una
población.
Medios de cultivo más comunes

 Agar nutritivo
 Tryptic Soy Agar (TSA)
 Agar Sangre (AS)
 Agar Muller-Hinton (MH)
 Caldo Nutriente (CN)
 Agar McConkey (McC)
 Kilosa-Lisina-Tergitol 4 (Agar (XLT4)
 Salmonella-Shigella Agar (SSAgar)
 Manitol Sal Agar (MSA)

Métodos de siembra

a) Estrías

Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las


colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se
vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente
esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre
la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias
formas:

Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando


se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas
de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo
material.

Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado


el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace
una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar
nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas

El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al


borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así
sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento. Asa
Finalidad. Obtener colonias aisladas

b) Dispersión o Agotamiento

Tomar una asada de muestra y colocarla en un extremo del medio sólido,


realizar movimientos del ZIG ZAG hacia el centro de la placa. Luego girar la
placa 60° y hacer el mismo procedimiento, tomando solo una vez la asada
de la muestra. Finalidad: obtener colonias aisladas
Materiales:
 Placa Petri con medio de cultivo
 Muestra (sólida o líquida)
 Asa de siembra de platino
Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa.
Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión
anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y
volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección.
Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y,
en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la
primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si
tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un
cultivo puro.

c) Puntura

Con una aguja de platino, tomar una pequeña cantidad de una colonia
sembrar en el agar semisólido o sólido introduciendo la aguja en forma
vertical.
o Flamee el asa o aguja por unos segundos en forma vertical.
o Quite el tapón del tubo y manténgalo en la misma mano en que
tiene el asa o aguja para inoculación. Flamee la boca del tubo y
tome una pequeña porción de inoculó.
o Flamee nuevamente la boca del tubo que tiene el espécimen que
va a trasferir y tápelo.
o Quite el tapón del tubo que va a inocular y proceda de acuerdo de
acuerdo al medio de cultivo:

Caldo: Basta con tocar el medio con el asa o aguja, si es poco caldo
inclínelo de manera que no introduzca en el tubo el mango del asa o aguja.

Medio semisólido: por lo general para este medio se usa la aguja de


inoculación la cual se introduce dentro del medio hasta aproximadamente
¾ partes de profundidad. En un solo movimiento.

Medio sólido inclinado: se lleva el asa o la aguja hasta donde empieza el


declive y se sube haciendo un movimiento de zigzag sobre la superficie
dibujando así una serie de estrías.
d) Inoculación
El agar, una sustancia similar a la gelatina que se extrae de las algas rojas,
es usado comúnmente para cultivar microorganismos. Se le agregan varios
nutrientes para favorecer el crecimiento bacteriano y se coloca tanto en
placas planas como en tubos de ensayo. Cuando se coloca en un tubo de
ensayo, el agar está en forma líquida. Estos luego son colocados en ángulo
para que se enfríen y solidifiquen, creando una superficie inclinada, o un
agar inclinado (agar slant, en inglés).

e) Inclinación
Los medios de agar inclinado se realizan llevando el agar a punto de
ebullición y vertiéndolo en un tubo de ensayo. Antes de que el agar se enfríe
y solidifique, el tubo de ensayo se coloca inclinado sobre un lado. Una vez
que el agar se enfría, el tubo puede volver a colocarse en posición vertical
y el agar que se encuentra en su interior se verá inclinado.
El inóculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:
• En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a
sembrar y se introduce mediante punsión en el medio contenido en la parte
inferior del tubo
• En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se
esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.
METODOS DE DESCRIPCION DE LA MEDIO DE CULTIVO
SIEMBRA SIEMBRA USADO
ESTRIA Agar Nutritivo
Con la asa de
siembra se toma una
muestra y se hace
estrías en zigzag

DISPERSION Agar nutritivo


AGOTAMIENTO Con la ayuda del
aza de dragalski se
dispersa por toda la
placa Petri,
chocando las
paredes de la placa

PUNTURA Agar Semisólido


Con el aza de Nutritivo
puntura colocamos
la muestra en un
tubo de ensayo que
contiene el medio
de cultivo en estado
solido

INOCULACIÓN Caldo nutritivo


Con un aza en arco,
introducimos hasta el
fondo, sin tocar las
paredes e inclinado
hasta un ángulo de
45°
CONCLUSIONES

El tipo de siembra por estriado a diferencia de los otros nos ofrece una
mejor apreciación en el aislamiento de colonias respecto a su
monografía.

Las siembras por inoculación, puntura, etc. Nos ofrece entender como
las bacterias aprovechan el medio de cultivo con la condición que
estas se les puede agregar reactivos y visualizar cómo reaccionan
ante ello (metabolismo).

Una buena siembra dependerá de la buenas técnicas a utilizar


(posición, seguridad, precaución, paciencia en algunos casos)
CUESTIONARIO

1. Cite para cada uno de los tipos de siembra y explique su motivo de uso

 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de


Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente
fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.
 Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por
inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra
de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml.
aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios
facultativos y microaerofílicos.
 Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de
cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el
inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el
inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de
siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.
 Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de
cultivo fundido y se deja solidificar.

2. ¿Qué características de las bacterias se evalúan en un medio


semisólido?
La característica que se evalúa en las bacterias en un medio
semisólido es detectar la movilidad bacteriana y producción de indol.
Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. El
medio de cultivo semisólido, son medios intermedios entre los medios
líquidos y sólidos, su proporción de Agar suele ser suele ser inferior al
5%, pero siempre suele presentar cierta cantidad que le proporcione
una consistencia semisólida.

3. ¿Cuál es la utilidad de la siembra por dispersión-agotamiento?

El objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera que al


final se obtenga colonias separadas y aislarlas fácilmente, para poder
iniciar el estudio de identificación y sensibilidad a los antimicrobianos.
Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se
deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material
de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio
formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:
a) Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías.
Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar
dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar
con el asa nuevo material.
b) Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez
depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas
del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto
cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante
aparecerán las colonias aisladas.
c) El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima
al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y
así sucesivamente.

4. ¿Cómo es la siembra en anaerobiosis?


Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen en
general las mismas sustancias nutritivas que para las bacterias
aerobias, pero es necesario privarlos del O2 libre o en disolución
mediante distintos métodos:

a) Métodos Físicos:
a) Expulsión del aire por ebullición: antes de efectuar la siembra, los
medios líquidos y sólidos se llevan a ebullición en baño María con el fin
de eliminar el aire. Este proceso se denomina “regeneración” de los
medios. Esto evita el reoxigenamiento de los medios líquidos.
b) Reemplazo del aire por gases inertes: este método consiste en la
eliminación del aire, mediante bomba de vacío, del recipiente que
contiene los medios sembrados y su reemplazo por Hidrógeno,
Nitrógeno, CO2, etc.

b) Métodos Químicos:
a) Sustancias reductoras tóxicas para las bacterias, por cuyo motivo
no se adicionan a los medios de cultivo, sino que en un lugar
adecuado del recipiente que contiene los tubos sembrados. Se utiliza
principalmente Acido Pirogálico o Hidróxido de potasio
b) Sustancias reductoras no tóxicas que se agregan directamente a
los medios de cultivo, por ejemplo Glucosa al 1-2%, Tioglicolato de
sodio 0. 1 – 0.2%, Cistina al 0.05% entre otros.

c) Métodos Biológicos:
a) Tejidos animales que se adicionan a los medios de cultivo, como
por ejemplo: carne picada, cerebro, hígado, etc.
Informe n°5
Análisis Microbiológico del Agua

INTRODUCCION

El crecimiento de la población a nivel mundial y el aumento del uso del agua


para diferentes actividades, ha incrementado los niveles de contaminación.
Esta contaminación está relacionada con los vertidos de origen doméstico
e industrial a los cuerpos de agua. En el caso de los residuos de origen
doméstico, la carga contaminante está representada por altos porcentajes
de materia orgánica y microorganismos de origen fecal. Estos
microorganismos son causantes de enfermedades de origen hídrico, que
generan altos porcentajes de morbi-mortalidad en la población. El control
de la calidad microbiológica del agua de consumo y de vertido, requiere
una serie de análisis dirigidos a determinar la presencia de microorganismos
patógenos.

Dentro de los microorganismos patógenos se encuentran el grupo de


bacterias coliformes el cual está conformado por dos subgrupos: los
coliformes totales y los termotolerantes. A estos últimos antes se los
denominaba coliformes fecales. El cambio de nombre se debe a que se
demostró que en el grupo de coliformes que se detectaban en siembras
incubadas a temperaturas de 44,5 °C y en medios de cultivo específicos,
sólo una parte del grupo eran bacterias de origen fecal; el resto eran
bacterias ambientales. Se les puso entonces el nombre de bacterias
coliformes termotolerantes debido a la alta temperatura de incubación
(44,5 °C) en la cual se obtenía un óptimo desarrollo.

En el grupo de bacterias termotolerantes está incluida la Escherichia coli,


considerada como un organismo indicador de contaminación fecal. Se ha
demostrado que esta bacteria siempre está presente en un número elevado
en las heces de humanos y animales de sangre caliente y comprende casi
95% de los coliformes en las heces. Por esta razón, la contaminación de
origen fecal puede ser evaluada mediante la determinación de coliformes
termotolerantes o mediante la presencia de E. coli. En los valores guía para
la calidad bacteriológica del agua de bebida (OMS, 1995), ambas
determinaciones se consideran como alternativas aceptables y su presencia
indica contaminación de origen fecal.
OBJETIVO

 Realizar el recuento en placa de bacterias heterotróficas y la técnica del NMP


usando tubos múltiples para coliformes en muestras de agua potable.

 Determinar si la muestra analizada es apta para el consumo humano.


1. ¿Cuáles son las características de las bacterias heterótrofas?

 Las bacterias heterótrofas pertenecen al grupo de las enterobacterias


 Son negativas a la tinción de Gram, además tienen forma de bacilos de
tamaño mediano, que pueden ser aerobios y anaerobios facultativos
 Son fermentativas de algunos carbohidratos, casi siempre con producción de
gas, y generalmente son móviles, reducen los nitratos y los nitritos,
 necesitan de compuestos orgánicos tanto como para obtener energía como
para su crecimiento.
 Se asocian con enfermedades humanas, algunas de ellas son provenientes de
heces fecales y la presencia de estas en medios externos como es el agua
indica una contaminación de origen fecal.
 son productoras de enfermedades gastrointestinales en el hombre, en algunos
animales y en algunos peces que se ven perjudicados con la presencia de
estas bacterias en el agua en que ellos se encuentran, algunos ejemplos de
géneros bacterianos patógenos.

2. ¿Cuáles son los criterios para ser considerado como parámetro microbiológico
para el agua potable?

 Análisis de bacterias patógenas.


 Análisis de bacteriófagos.
 Análisis de recuento total bacteriano en aire.
 Análisis de legionella tanto por PCR como por medios de cultivo, de
muestras de agua y de aire.
 Estudio de bioindicación en estaciones depuradoras de aguas residuales
para control del proceso biológico, utilizando microscopio de campo
claro, nomanski y contraste de fase, con análisis de imagen.
 Ensayos de toxicidad de agua potable y residual.

3. Explique el mecanismo de acción de los componentes de cada medio de


cultivo utilizando en el análisis de agua.

 CALDO LACTOSA:
Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento
bacteriano. Permite recuperar células injuriadas diluye sustancias
toxicas o inhiben y favorecen el desarrollo de salmonella con respecto
a otras bacterias. El extracto de carne y la peptona son la fuente de
carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas
(el cual se evidencia al utilizar las campanas Durham).
 CALDO BRILA:
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para
el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los
agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positiva
y Gram negativas a excepción de coliformes, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable.
Es una propiedad del grupo de coliforme, la fermentación de la lactosa
con producto de ácido y gas.

 CALDO EC:
En el medio de cultivo la tripteína es la fuente de péptidos, aminoácidos
y nitrógeno, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece
el desarrollo de bacterias coliformes, las sales biliares inhiben el
crecimiento de la flora acompañante de Gram positiva, las sales fosfato
constituyen un sistema buffer que impide que los productos ácidos
originados por la fermentación de lactosa afecten el crecimiento
microbiano y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

4. Según la NTP, ¿Cuáles son los parámetros microbiológicos para el agua


potable y cuáles son sus límites permisibles?
5. ¿Cuál es la técnica a utilizar para identificar escherichia coli?

COLIMETRÍA: Determinación de Bacterias Coliformes.


6. ¿Cuáles son las características que debe reunir un microorganismo indicador?

 Ser un constituyente normal de la flora intestinal de individuos sanos.


 Estar presente cuando los microorganismos patógenos intestinales lo están.
 Debe ser incapaz de reproducirse fuera del intestino de los animales
homeotermos.
 Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las
bacterias patógenas (su resistencia a los factores ambientales debe ser
igual o superior al de los patógenos de origen fecal).
 Debe ser fácil de aislar y cuantificar.
 No debe ser patógeno.

 Presentarse en número elevado, facilitando su aislamiento e identificación.
 Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotermos.

7. ¿Porque el número de coliformes totales es siempre mayor que el de


coliformes fecales?

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los
Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además
fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a
temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los
coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas
cepas de Enterobacter y Klebsiella.

8. ¿porque aun cuando los microorganismos patógenos se encuentran en poca


concentración en agua pueden causar enfermedad?

Acerca de los virus se sabe que, aún en bajas concentraciones, tienen la


capacidad de causar infección o enfermedad. Algunos virus son más
resistentes a la desinfección que los organismos coliformes, por lo que los
indicadores tradicionales de contaminación bacteriana no evalúan de
manera eficiente la presencia o ausencia de virus en el agua.
PRUEBA PRESUNTIVA:

CALDO LACTOSA

Tubos con caldo Tubos con caldo


lactosa con doble lactosa de simple
concentración concentración

Lectura en tubos: número de tubos positivo por cada dilución.


Cálculos para determinar el NMP de coliformes totales/ml en la muestra.

Discusión:
El grupo coliforme se caracteriza por fermentar a la lactosa, le damos a la
bacteria lo que a ella necesita para que lo poco que queda de ella se
comiencen a crecer; la mínima probabilidad de que un coliforme esté presente
en una muestra, ahora se verá favorecido porque ha encontrado algo que
fermentar (un factor de crecimiento que es la lactosa).

Conclusión:
Después de dejarlas incubar, encontramos:
 tubo de 10 ml un tubo con película, turbidez y gas, signos de bacteria
 tubo de 1 ml encontramos un tubo de con película, turbidez y gas
 tubo de 0.1 ml también encontramos un solo tubo con película, turbidez y
gas.

Su NMP del caldo lactosa: 2-2-2

Resultados del caldo lactosa:


 Se seleccionó una muestra de cada tubo de 10ml, 1 ml y 0.1ml; se les
extrajo una gota (0.1 ml) para llevarlos a los 9 tubos de caldo BRILA.
 Finalmente se rotularon los tubos de ensayo y se llevaron a la
incubadora

DETERMINACION DE COLIFROMES FECALES TERMOTOLERANTES

Tubos con caldo BRILA positivo


Resultados del caldo brila:

10 ml presencia
de bacterias
(burbuja y
precipitado).

1 ml (más oscuro)
presencia de
bacterias (burbuja
y precipitado)

0.1 ml no se ve
evidencia de
presencia de
bacterias.

NMP en caldo brila: 2-2-2

 Ya seleccionados los 3 tubos de volumen diferente, retiramos de cada tubo


0.1 ml para sembrarlos en los tubos de caldo EC para luego llevarlos a una
temperatura de 45°C x 24 h.
Tubos con caldo EC (Incubación 45°C x 24hs)

10ml
 Presenta
turbidez,
película y
sedimento
 Presenta gas

1ml
 Presenta
turbidez,
película y
sedimento
 Presenta gas

1ml
 Presenta
película y
sedimento
 Presenta gas
Resultados: Numero de tubos positivos para cada dilución.

VOLUMEN INOCULADO
MEDIO DE CULTIVO 10 ml 1 ml 0.1 ml
CALDO BRILA 1 2 1
CALDO EC 1 2 0

Cálculos para determinar el NMP de coliformes totales/ ml, en la


muestra

Discusión: ya sometidos los tubos a una temperatura de 45°C,


confirmamos que hay coliformes fecales termotolerante.

Conclusión:
Hasta este proceso hemos concluido que la muestra contiene
coliformes fecales.
Aislamiento e identificación de coliformes fecales: Escherichia coli

Aislamiento de coliformes fecales en medio de cultivo EMB


Medio selectivo:

LECTURA DE COLONIA:
Tipo de bacteria: Escherichia coli
CARACTERÍSTICAS:
 Forma: circular
 Elevación: elevada
 Borde: entera
 Superficie: Lisa
 Tamaño: 0.1 mm
 Consistencia: cremosa
 Cromogénesis: negro
Medio EMB: Este medio (también
denominado E.A.M.) es utilizado para el
aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas
exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la
IDENTIFICACION
familia Enterobacteriaceae.

VRBM SIM Urea TSI citrato LIA


M
IDENTIFICACION: Medio diferencial

LIA:
En la superficie que esta inclinada, en la
parte inferior, podemos observar una
coloración negra, diferente al color del
medio que es de morado, esto nos indica
que hubo cambio del medio, por lo tanto
la descarboxilacion de la lisina es
negativa.

Citrato:

El citrato es POSITIVO, esto


quiere decir que el medio
cambia de color

No hay presencia de escherichia


coli.

TSI:

Es A/A eso significa que es ácido/ácido y


que todo el tubo queda de color amarillo ya
que fermenta glucosa, lactosa y sacarosa.
En producción de gas es negativo eso
significa que tiene no tiene la facilidad para
romper el medio.
En producción de ácido sulfhídrico es
negativo esto quiere decir que el medio no
debe quedar de color negro.
SIM:

Presencia de
turbidez difusa en el
medio.

INDOL:

Si se pone de color rojo


es positivo.

El resultado de la urea fue


negativo
Discusión:

Dependiendo del cambio de color (dependiendo de su metabolismo), recién se


puede afirmar que tiene Escherichia coli.

Conclusiones:

Con todo el proceso que hicimos para detectar si encontramos la bacteria


escherichia coli, el resultado nos dio positivo.