ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS IES VIRGEN DE LA PALOMA

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Práctica nº1:
OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS
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OBJETIVO:
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Aprender el manejo de microscopio. Visualizar diversas preparaciones microscópicas
aprendiendo a diferenciar estructuras y tipos de microorganismos.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Situar el porta con la preparación en el microscopio. Comenzar la visualización con el objetivo
de menor aumento. Buscar diferentes campos de observación.
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2. Realizar un dibujo con el campo de observación que se estime oportuno, indicando el número de
aumentos totales empleado. Repetir esto con diversas preparaciones.
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OBSERVACIONES:
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PRÁCTICA Nº2:
MANEJO DEL MICROSCOPIO
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OBJETIVO: Afianzar el manejo del microscopio.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Recortar un trozo de papel cuadriculado, de manera que tenga la forma y el tamaño de un
portaobjetos.
2. Dibujar, en la porción media del trozo de papel un signo más (+), con dos trazos de 4 cua-
drados cada uno.
3. Escribir, lo más pequeño posible: Una letra D en el extremo derecho del signo +
Unas letras IZ en el extremo izquierdo.
Una letra S en el extremo superior.
Unas letras IN en el extremo inferior.
4. Fijar el trozo de papel al portaobjetos mediante una tira de cinta adhesiva, y de forma que
el signo + quede hacia arriba.
5. Situar el portaobjetos en la platina del microscopio.
6. Enfocar la zona central del signo +, con cada uno de los objetivos, excepto con el de in-
mersión.
7. Enfocar de nuevo la zona central del signo + con el objetivo de menor aumento. Sin dejar
de mirar a través de los oculares, y utilizando los tornillos reguladores de la platina:
- Desplazar el campo microscópico hacia la derecha, hasta visualizar las letras. Es-
cribir la letra o letras que se ven: ……………
- Desplazar el campo microscópico hacia la izquierda, hasta visualizar las letras.
Escribir la letra o letras que se ven: ……………
- Desplazar el campo microscópico hacia arriba, hasta visualizar las letras. Escribir
la letra o letras que se ven: ……………
- Desplazar el campo microscópico hacia abajo, hasta visualizar las letras. Escribir
la letra o letras que se ven: ……………

8. Extraer consecuencias sobre lo observado:

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9. Enfocar sucesivamente, con el objetivo de menor aumento, las letras rotuladas alrededor
del signo +. Fijándose en las escalas longitudinal y transversal de la platina, establecer la
posición exacta de cada una de esas letras. Anotar los resultados:
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! LETRAS COORD. LONGITUDINAL COORD. TRANSVERSAL
D
IZ
S
IN
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10. Quitar el portaobjetos y mover la platina. Volver a poner el portaobjetos en la platina. Si-
tuando las escalas en las posiciones previamente establecidas, localizar directamente cada
una de las letras, sin necesidad de barrer visualmente la tira de papel.
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OBSERVACIONES:
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PRÁCTICA Nº3:
ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LA CRISTALIZACIÓN DE LA SALIVA
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OBJETIVOS: Afianzar el manejo del microscopio; Realizar una preparación microscópica sencilla.
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FUNDAMENTO: En el periodo preovulatorio, debido a la creciente concentración de estrógenos en
el organismo de la mujer, comienzan a formarse en la saliva unos cristales en forma de helecho,
que van aumentando en cantidad a medida que nos acercamos a la ovulación.
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La cristalización máxima de la saliva se produce cuando la concentración de estrógenos
llega a un nivel máximo. Esto sucede justo antes de la ovulación.
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Una cristalización considerable de la saliva se prolonga, pero ya en descenso, durante los
tres o cuatro días que siguen a la ovulación. En el periodo postovulatorio, debido a la alta concen-
tración de estrógenos en el plasma, los cristales van desapareciendo, hasta ser casi inexistentes en
la última semana del ciclo menstrual.
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Esta cristalización es visible microscópicamente.
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MUESTRA: Saliva. Antes de emitirla, es conveniente enjuagarse la boca, para procurar que la sali-
va esté limpia.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Depositar una gota de saliva sobre un portaobjetos perfectamente limpio.
2. Extender la gota, con ayuda de otro portaobjetos.
3. Dejar secar la extensión. Para ello, puede utilizarse una fuente de calor (aire caliente, luz
solar, una bombilla).
4. Disponer el porta sobre la platina, teniendo en cuenta que la extensión ha de estar hacia
arriba.
5. Enfocar la preparación, con cada uno de los objetivos del microscopio, excepto con el de
inmersión.
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NOTAS:
- Para la observación microscópica de la cristalización de la saliva, es preferible que la muestra sea
atravesada por poca luz. Esto se logra alejando el condensador de la preparación y/o cerrando par-
cialmente el diafragma.
- Para la lectura de resultados es preferible la observación de la muestra con un objetivo de poco
poder de ampliación, por ejemplo de 10x.
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VISUALIZACIÓN: LECTURA DE RESULTADOS, CONCLUSIONES:
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OBSERVACIONES:
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Práctica nº4:
EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS EN AGUAS
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OBJETIVOS:
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Observación de microorganismos vivos. Observación de diferentes movimientos microbianos.
Practicar con el manejo del microscopio.
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MUESTRA: Agua estancada.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Tomar una gota de la muestra con el asa de siembra previamente flameada y depositarla en el
portaobjetos.
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2. Colocar el cubreobjetos sobre la gota. Para evitar burbujas al depositar el cubreobjetos, comen-
zar apoyando éste sobre una arista.
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3. Observación al microscopio. El calor desprendido por el foco luminoso irá secando progresiva-
mente la preparación. En consecuencia los microorganismos se irán paralizando y, además, pueden
aparecer corrientes de líquido que dificultarán la observación de la muestra. Cuando se observe
esto, levantar el cubreobjetos y añadir más líquido.
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4. Dibujar detalladamente los diferentes tipos morfológicos y describir sus movimientos. Apuntar
todas las observaciones que sean precisas:
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Práctica nº5:
EXAMEN EN FRESCO DE LEVADURAS
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OBJETIVOS:
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Observación de levaduras; Observar morfologías, tamaños, forma de reproducción. Practi-
car con el manejo del microscopio.
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MUESTRA: Levadura de panadería; preparado farmacéutico conteniendo levaduras.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Preparación de la muestra: En un vaso de precipitado pequeño, realizar una disolución de agua
templada y azúcar, y depositar una porción de la muestra. Agitar un poco y dejar entre 15-30 minu-
tos.
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2. Tomar con un cuentagotas estéril una gota de la preparación anterior, situar en un portaobjetos,
colocar un cubre, y observar directamente al microscopio. Adicionalmente, sobre todo en el caso
en que no se hayan observado bien, puede realizarse una tinción, de la forma descrita en la práctica
de “tinción simple”.
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Práctica nº6:
OBSERVACIONES VARIAS
OBJETIVOS:
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Observación de amiloplastos, tejido epidermal, cromoplastos. Diferenciar morfologías.
Afianzar el manejo del microscopio.
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OBSERVACIÓN DE AMILOPLASTOS:
! Nota: Los amiloplastos son orgánulos que provienen de la acumulación de almidón. Se pueden observar en la
patata, legumbres, cereales, y en cada caso tienen formas diferentes.
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MUESTRA: Patata, arroz u otros vegetales.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Tomar una porción de patata cruda y raspar con una hilo de platino. Depositar el raspado sobre
un portaobjeto, donde previamente se ha depositado una gota de agua.
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2. Añadir sobre la preparación anterior una gota de lugol. Esta sustancia (a base de I2) reacciona
con el almidón dando un complejo coloreado azul-violeta negruzco. Colocar un cubreobjetos y
observar al microscopio.
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3. Repetir el procedimiento machacando y raspando unos granos de arroz. También pueden usarse
plátanos, judías, guisantes, maíz, etc.
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Amiloplastos de la patata:
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Amiloplastos en plátanos (1ª) y otros:
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OBSERVACIÓN DE TEJIDO EPIDERMAL DE CEBOLLA
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MUESTRA:Cebolla.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Con un cuchillo, hacer un corte sobre la epidermis de la cebolla. Levantar suavemente con una
pinza una capa delgada y transparente de la parte interna. Esta capa es el tejido epidermal. Exten-
der sin invertirlo sobre un portaobjeto.
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2. Añadir una gota de colorante o de agua. Situar un cubre sobre la preparación. Observar al mi-
croscopio, con los aumentos de 10X y de 40X.
!Epidermis de la cebolla:
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OBSERVACIÓN DE CROMOPLASTOS:
! Los cromoplastos son un tipo de plastos, orgánulos propios de la célula vegetal, que almacenan los pigmentos
a los que se deben los colores, anaranjados o rojos, de flores, raíces o frutos.
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MUESTRA:Tomate.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Cortar finísimas porciones de pulpa de tomate maduro de la zona situada bajo la piel. Depositar
la porción sobre un portaobjeto, colocar el cubre y comprimir suave y lentamente. Observar al mi-
croscopio.
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Cromoplastos del tomate:
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Práctica nº7:
TINCIÓN SIMPLE
OBJETIVOS:
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Aprender a realizar un frotis bacteriano y una tinción simple. Observar morfologías celulares y
bacterianas. Practicar con el manejo del microscopio.
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PROCEDIMIENTO: (esquema adjunto)
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1. Raspar la cara interna de la mejilla con la uña. Extender el material extraído con ayuda de un
asa de siembra sobre un portaobjetos en el que previamente se ha depositado una gota de agua.
Remover la mezcla hasta obtener una suspensión homogénea y extenderla para facilitar su secado.
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2. Esperar hasta que la fina película de líquido se evapore.
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3. Fijar la preparación al portaobjetos mediante pases del portaobjetos sobre la llama (tres o cuatro
veces). Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.
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4. Cubrir la preparación con abundante colorante, dejándolo actuar uno o dos minutos.
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5. Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante. Para ello, inclinar el portaobjetos y aplicar
el chorro de agua en su parte superior permitiendo que resbale sobre la fijación. No dirigir el agua
directamente sobre la misma, pues podría arrastrar parte de ella consigo.
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6. Esperar a que el agua se evapore. Este proceso puede acelerarse por presión entre dos papeles de
filtro. En ningún caso frotar el portaobjetos.
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7. Observar la preparación al microscopio. Seleccionar un buen campo de observación y dibujarlo.
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Entregar un informe de esta práctica.
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Práctica nº8:

TINCIÓN DE GRAM
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OBJETIVOS:
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Aprender a realizar una tinción diferencial. Diferenciar entre bacterias Gram + y Gram -.
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MUESTRA:
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Yogur natural desnatado y otras.
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PROCEDIMIENTO: (esquema adjunto)
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1. Preparar un frotis bacteriano (es decir, extensión y fijación).
2. Teñir con cristal violeta durante 1 minuto.
3. Lavar con abundante agua.
4. Cubrir con lugol 1 minuto.
5. Lavar con abundante agua.
6. Decolorar con alcohol-acetona hasta que la preparación deje de perder color (unos 30
seg.)
7. Lavar con abundante agua para eliminar los disolventes usados.
8. Teñir con safranina durante 1 minuto.
9. Lavar con abundante agua.
10.Secar la preparación.
11.Examinar al microscopio.
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Nota:
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Durante la fijación, el porta nunca debe quemar al tacto. Si alcanzase una temperatura excesiva a
la llama, las células pueden deformarse o romperse. Si las bacterias proceden de un medio líquido,
es más conveniente fijarlas con metanol.
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La fijación con metanol se hace como sigue: Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión
completamente seca. Retirar de inmediato el exceso de metanol del porta, golpeándolo con suavi-
dad por su canto sobre el papel de filtro que protege la mesa de trabajo. Esperar a que el metanol
se evapore completamente.
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Entregar un informe de esta práctica.
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Práctica nº9:
ANÁLISIS DE MANIPULADORES
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INTRODUCCIÓN:
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Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien
lo contamine durante el procesado. Las personas tienen una abundante carga microbiana en su piel.
Pero nunca deberán aislarse de las manos de un manipulador de alimentos bacterias patógenas o
que indiquen poca higiene, pues sería una fuente de contaminación del alimento. Lo mismo puede
aplicarse a un analista microbiológico, donde una mala higiene llevaría a falsos positivos en los
análisis que realice. Se pueden estudiar manos, uñas y fosas nasales.
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OBJETIVOS: Análisis de manipuladores. Aprender a realizar una correcta limpieza de manos. Eva-
luar el efecto de un desinfectante de manos.
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PROCEDIMIENTO:
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1. Preparar un medio de cultivo general (por ejemplo, APHA), siguiendo las instrucciones del fras-
co. Preparar por cada grupo el volumen suficiente para llenar dos placas de Petri.
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2. Preparar medio VRBG, que es selectivo para aislamiento de Enterobacteriaceae, en canti-
dad suficiente para una placa por grupo.
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3. Esterilizar en el autoclave el medio de cultivo, en un recipiente adecuado, durante 20 minutos a
121 ºC. Con estas condiciones nos aseguramos que no quedan microorganismos vivos en el mis-
mo, y los que crezcan después del cultivo serán debidos únicamente a la muestra inoculada.
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4. Los medios, una vez esterilizados y atemperados a unos 55ºC, se vierten en las placas de Petri.
El volumen a verter no se mide con ningún instrumento, simplemente se llenan aproximadamente
a la mitad (eso equivale a unos 15-20 ml). Dejar solidificar en las inmediaciones del mechero.
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5. Una de las placas de Petri conteniendo APHA se utilizará para evaluar el efecto de la limpieza
mecánica y de un desinfectante en las manos:
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- Marcar tres sectores en la placa de la forma siguiente: 1º; 2º; 3º.
- Sin lavarse las manos, presionar suavemente con un dedo en el primer sector de la placa.
- Lavarse las manos con agua y jabón, y tocar con el dedo en el 2º sector.
- Aplicarse el desinfectante de manos aportado por la profesora, y tocar en el 3º sector.
- Rotular la placa adecuadamente (en su base, no en su tapa).
- Incubar las placas durante 24-48 horas a 37ºC (en la estufa se colocan invertidas).
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6. La placa conteniendo VRBG servirá para controlar la posible presencia de enterobacterias en la
piel. Sin lavarse las manos, se pasan por la superficie de la placa, se rotula y se incuba a
37ºC durante 24-48 horas.
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7. Por último, en la otra placa de Petri con APHA añadir 0,1 ml de desinfectante de manos, exten-
der con el asa de Digralsky, previamente esterilizada, por toda la superficie con movimientos de
rotación hasta que el líquido esté totalmente absorbido. Rotular e incubar como las otras placas.
Esta última siembra servirá para hacer un control de calidad del desinfectante.
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8. Contar las colonias que han crecido en cada una de las placas. Se supone que por cada microor-
ganismo vivo que hubiera en la superficie analizada, crece una colonia. Pero el resultado no se da
en número de microorganismos, sino en unidades formadoras de colonias (UFC), que es más exac-
to, porque es realmente lo que se cuenta. Extraer conclusiones de los resultados obtenidos.
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Nota: El análisis de fosas nasales o de uñas se realiza tomando la muestra mediante
hisopo estéril humedecido en solución salina estéril y sembrando directamente en las pla-
cas antes mencionadas. También se usa Agar manitol sal o agar Baird-Parker para aisla-
miento de Staphylococcus aureus. En la legislación española actual no se recogen los lími-
tes de bacterias toleradas en cada caso, aunque unos niveles elevados de éstas nos harán
sospechar una mala higiene del manipulador y la posibilidad de que sea portador de bacte-
rias patógenas.
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Entregar informe de esta práctica
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Esto es un ejemplo de plantilla de los informes:
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CFGS LABORATORIO DE ANÁLISIS Y PRÁCTICA nº : FECHA
CONTROL DE CALIDAD
! ! REALIZACIÓN:

Módulo profesional: Poner título

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ENSAYOS
MICROBIOLÓGICOS
NOMBRE:

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1. OBJETIVO/S:
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!2. MUESTRA, TRATAMIENTO, CONSERVACIÓN:
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!3. ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO:
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!4. RESULTADOS EXPERIMENTALES:
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!5. RESULTADOS FINALES:
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6. CONCLUSIONES, OBSERVACIONES:
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Numeración, del tipo 1 de 4, 2 de 4,…