Bioquímica - Cromatografía 1

Bioquímica
Separación de biomoléculas

Métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos son aquellos en que los diferentes componentes de una mezcla
de biomoléculas se separan al interaccionar diferencialmente con una matriz porosa inmóvil
dentro de una columna. El medio móvil (solvente) puede ser líquido o gaseoso, dependiendo
de la técnica, y puede ser de composición constante o variable.
La nomenclatura básica no ha cambiado desde los primeros intentos hechos ya hace casi un
siglo por Tswett: se denomina columna cromatográfica al tubo en que se realiza la corrida,
eluente al líquido o gas usado como medio móvil y cromatograma al resultado del análisis
cromatográfico.
La cromatografía se emplea con fines analíticos, en microescala, o preparativos, ya sea en
procesos industriales o de laboratorio, para purificar diversas sustancias: proteínas, ácidos
nucleicos, medicamentos, etc.
Las columnas son tubos de vidrio, metal o plástico, dependiendo de la técnica empleada, de
diámetro constante y preferentemente de un material biocompatible, es decir que no cambie la
función biológica del material en estudio ni interaccione con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la separación se dan sobre la matriz o soporte y pueden ser
de diversa naturaleza. Así se tiene la cromatografía de intercambio iónico, de interacción
hidrofóbica, de filtración o exclusión molecular, de afinidad, etc.
Dependiendo de las
necesidades de Bomba
resolución, diferentes
técnicas pueden ser
empleadas para la Figura 1
cromatografía, tales
Columna
como HPLC (High
performance liquid
chromatography, FPLC Solvente
(fast protein liquid
chromatography), en
que varían la presión a
la que se administra la Acme Corp.

fase móvil, la 1
0
3

constitución de las Detector

columnas, las
características de los
solventes y en general
la precisión con que se Figura 1. Configuración
miden los diferentes básica para una
parámetros de una cromatografía Colector de fracciones
cromatografía.

Diferentes tipos de matrices

Se utilizan matrices, o soportes, muy variados. Sobre la matriz se van a dar las interacciones
que resultan en la separación. Estas matrices entonces llevan los grupos químicos encargados
de tal interacción o bien su estructura ya posee alguna propiedad intrínseca que permite
separar biomoléculas.
El término resina se reserva para las que poseen cierto grado de hidrofobicidad, como
poliestireno.

1
Bioquímica - Cromatografía 2
Un soporte muy común es la celulosa, fácilmente hidratable pero que no permite elevados
flujos debido a su compresibilidad. Está compuesto de fibras de celulosa purificadas. Además
de su compresibilidad, este soporte no es compatible con algunos solventes orgánicos ni
álcalis, que hidrolizan la celulosa.
De gran uso son las matrices derivadas de dextranos, de polisacáridos diversos que pueden
ser mezclados con otros sustancias para dar diferentes características a la matriz. Se
presentas como microesferas porosas con diferentes tamaños de partícula y poro.
Ejemplos de éstas son la Sepharose y el
Figura 2. Partículas de Sepharosa Sephadex. La primera está compuesta por
agarosa, un polímero lineal de residuos alternados
de D-Gal y 3,6 anhidro-L-gal. La agarosa es un
componente del agar, junto a la agaropectina. La
agarosa forma geles debido a la multiplicidad de
puentes H y es un excelente medio debido a su
biocompatibilidad. La técnica de fabricación permite
que se formen partículas esféricas, cuentas de
collar, de tamaño más o menos uniforme y alta
porosidad. El Sephadex, por su parte, es un
dextrano entrecruzado. Todos los dextranos son
susceptibles a valores extremos de pH, en especial
en el lado alcalino de la escala. Esto se debe a la labilidad de los enlaces glucosídicos a la
hidrólisis alcalina.
El Sephacryl se prepara por entrecruzamiento covalente de alildextrano con
N,N'metilenbisacrilamida, dando un gel rígido con resistencia a la compresión. El BioGel es un
polímero de acrilamida que es especialmente resistente a valores extremos de pH.
Cuando se requieren velocidades de flujo y presiones elevadas se utilizan matrices más
rígidas, constituidas por polímeros
sintéticos o sílica.
Especialmente en soportes para
intercambio iónico se usa poliestireno Fase móvil
entrecruzado con divinilbenceno, que
forma una estructura tridimensional
grande de forma esférica.
Separación en base al tamaño.
Cromatografía de exclusión molecular Moléculas pequeñas: difusión
Dirección de flujo
(CEM) libre en la fase estacionaria

Figura 2
Las biomoléculas de diferente naturaleza
y tamaño pueden separarse en base a su
tamaño en columnas de filtración
molecular o filtración en gel. Esta técnica Moléculas medianas:
se basa en las propiedades separativas difusión en una fracción limitada
del soporte
de partículas esféricas, porosas, de
diámetro pequeño y más o menos
constante. Las biomoléculas que pasan a
través de estos geles tienen a su
disposición caminos de diferente longitud
de acuerdo con su tamaño. Así, las Moléculas grandes:
exclusión de fase estacionaria
moléculas pequeñas capaces de penetrar
los poros de la matriz se verán retardadas
en comparación con aquellas de mayor
tamaño, que son excluidas del interior de

Figura 3. Cromatografía 2
de exclusión molecular
Bioquímica - Cromatografía 3
la partícula y por lo tanto verán su tránsito a través de la columna acelerado. El tamaño mínimo
que debe poseer una molécula para incluirse, entrar a los poros, se denomina límite de
exclusión. P.ej. un límite de exclusión de 106 significa que moléculas con tamaño mayor a 106
kDa no serán incluidas. Esta técnica separa no solamente moléculas muy grandes de
moléculas muy pequeñas, como en el ejemplo anterior, sino que además permite la separación
de moléculas con tamaños parecidos. Esta última característica hace que uno pueda calibrar
una columna con patrones de tamaño (peso molecular) conocido, los cuales eluirán siempre en
la misma forma, y luego utilizar esta información para construir una curva de calibración. La
cromatografía se realiza sembrando la muestra y eluyendo con un buffer de composición
constante. 1
No se utiliza el volumen de elución Figura 4
directamente sino el coeficiente de
partición, que es la relación:
Abs 280

Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
0.5

Donde:
• Vo es el volumen vacío o de
exclusión, el espacio que queda
por fuera de las partículas del gel,
el único disponible para las 0
Vo Ve1 Ve2
macromoléculas que no se
incluyen en el gel.
• Ve es el volumen de elución de la macromolécula, medido en la altura máxima del pico
(ver Fig. 4)
• Vt es el volumen total de la columna

Kav tendrá un valor entre 0 y 1 e, idealmente,

dará una línea recta con pendiente negativa. 900
Las columnas usadas en cromatografía de 700
600
exclusión molecular tienden a ser largas y 500
Masa molecular (kDa)

400
angostas, de modo de maximizar el número 300 Figura 5
de platos teóricos, una medida de su 200
capacidad de resolución. Una limitación de
esta técnica es que el volumen sembrado 100

debe ser lo más pequeño posible para evitar

la obtención de picos anchos, con lo que se
pierde resolución. Para separaciones de
biomoléculas o determinación de peso
molecular se emplea un volumen de muestra
no mayor del 10% del volumen de la columna.
La técnica puede utilizarse para desalar 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45

macromoléculas, en cuyo caso puede Kav

sembrarse hasta un 20% del volumen.

Separación en base a la carga

Cromatografía de intercambio iónico (CIO)

En este tipo de cromatografía, la matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar
con la macromolécula en estudio de forma de unirse a ella por interacciones electrostáticas.

3
 Bioquímica - Cromatografía 4
Los grupos iónicos se hallan unidos en forma covalente a la matriz. Por ejemplo, una proteína
con punto isoeléctrico menor a 7 o un ácido nucleico estarán cargados negativamente a pH 7.0.
De esa manera, si se tiene una matriz con sustituyentes cargados positivamente, por ejemplo
una amina cuaternaria, las macromoléculas se unirán a los sustituyentes con una fuerza
proporcional a la carga que detenten al pH al que se realiza la corrida y al número y naturaleza
de los sustituyentes presentes en la matriz. Dado que las proteínas son iones multivalentes, las
resinas pueden ser de intercambio aniónico o catiónico, de acuerdo a la carga neta que
posean. Dependiendo de la macromolécula en estudio se usará una u otra. Los más comunes
son:

• dietil aminoetil (DEAE) –O-CH2-CH2-N+(C2H5)2H (débil) pK>11

• trimetil aminoetil (TMAE) –O-CH2-CH2-N+(CH3)3 (fuerte) pK>13
• dimetilaminoetil (DMAE) –O-CH2-CH2-N+(CH3)2 (débil) pK~10
-
• sulfometil -O-CH2SO3 pK<1 (fuerte)
-
• sulfopropil -O-CH2- CH2- CH2-SO3 pK<1 (fuerte)
-
• carboximetil -O-CH2COO pK~4.5

Una característica importante de los medios de intercambio iónico es su capacidad, es decir la

cantidad de macromoléculas que pueden unir por unidad de volumen de fase estacionaria, La
capacidad se expresa en mg proteína/ml gel o meq/ml. La capacidad es mayor cuanto más
sustituida esté la matriz, más fuerte sea la interacción con la macromolécula y mayor sea el
tamaño de poro de la matriz.
La elución puede realizarse de dos formas diferentes. La más usual consiste en aumentar
progresivamente la concentración de un contraión, de modo de desplazar el equilibrio de unión
de la macromolécula hacia la forma libre. El contraión es normalmente una sal (NaCl, KCl, etc.)
disuelta en el eluente.
0-DEAE(+) + Prot(-) Æ 0-DEAE-Prot
0-DEAE-Prot + Cl(-) Æ 0-DEAE-Cl + Prot(-)

Cromatografía de intercambio iónico Las macromoléculas de una mezcla

se irán desplazando en forma
Interacción secuencial de acuerdo con la fuerza
Cargado de la columna con la matriz cargada de la unión: las que posean menor
densidad de carga eluirán antes,
- mientras que para las de mayor carga
+ + -
- neta el tiempo de retención será
mayor. En la Figura 6 se esquematiza
- --
- el proceso para el caso, muy ideal por
+ --
+
- cierto, de que sólo una de las
-
- macromoléculas presente en la
muestra se una a la matriz. Esto
generalmente no es así, sobre todo al
Elución Lavado trabajar con mezclas complejas.
-
+ + - La otra manera es realizar un cambio
+ - + -
- + - en el pH del solvente. Esta técnica se
-
+ -
Fuerza emplea con intercambiadores débiles.
+
- - iónica
- - La lógica es que al cambiar el pH, de
+ -
+
+ --
+
modo de acercarnos al pI de cada
proteína, la carga neta de esta irá
Figura 6 disminuyendo y en algún punto dejará
- + de interaccionar con la matriz. Sin
- +
+ -
-+
-
+ - +
4
Bioquímica - Cromatografía 5
embargo, esta técnica posee sus desventajas. Dado que en este caso las proteínas eluirán a
un pH igual a su pI, su solubilidad estará disminuida y pueden precipitar. Además, la proteína
puede perder su actividad biológica a los valores de pH usados para establecer el gradiente. Es
de uso muy restringido.
El volumen que se puede cargar la columna no está restringido en la CIO. Por el contrario,
usualmente esta es una etapa de concentración, al sembrarse grandes volúmenes y recuperar
la muestra en volúmenes reducidos.
Las matrices usadas para la CIO son diversas: Sepharosa (dextranos), acrilamida, celulosa,

Figura 7. Cromatograma obtenido en una CIO de una mezcla de proteínas. Luego de la siembra se observa
un pico de Absorbancia (la técnica de detección puede ser otra) que corresponde a la fracción de proteínas
que no se unen a la matriz. Luego de lavar con el mismo buffer de siembra hasta eliminar aquello que no se
une a la matriz, se comienza a elevar la fuerza iónica en el buffer y se observa la aparición de picos que
corresponden a macromoléculas unidas. El primero es un pico doble que contiene al menos dos proteínas que
eluyen a fuerzas iónicas parecidas.

Sephadex, etc. Más recientemente se han agregado las matrices con tentáculos,
prolongaciones de 15 a 20 monómeros a los cuales se une el grupo iónico. Estas matrices
evitan el impedimento estérico que puede ofrecer el soporte para la unión de proteínas grandes
y evitan otros fenómenos como los cambios locales de pH que ocurren en el interior de las
partículas en otras matrices. Al respecto, las resinas macroporosas, que poseen poros 10 a
100 veces mayores que los microporos de 10-30 Å presentes en intercambiadores basados en
geles de dextrano, facilitan el movimiento de los iones y macromoléculas, poseen mayor
capacidad de unión de ligandos y velocidades de flujo elevadas.

5
Bioquímica - Cromatografía 6
Interacción hidrofóbica (CIH)

Es una poderosa técnica separativa para el aislamiento de proteínas tanto en escala

preparativa como analítica.
Está técnica se basa en la interacción de Cromatografía de interacción hidrofóbica
biomoléculas con grupos hidrofóbicos,
ligandos, unidos a una matriz inerte. Los Cargado de la columna Interacción
grupos unidos pueden ser fenil (fuerte), butil, con la matriz
(alta fuerza iónica)
propil (débiles), etc., que interaccionan
favorablemente con res. de Leu, Ile, Val, Phe y
otros que pueden estar presentes en la
superficie de una proteina. Aunque la norma
es que los res. hidrofóbicos se encuentren en
el interior de la proteina, recientemente
estudios de cristalografía han localizado
parches hidrofóbicos superficiales, a menudo Elución Lavado
relacionados con la función biológica de la
proteína. En general, esta técnica consiste en
Baja fuerza iónica,
unir la biomolécula de interés a la matriz en un solvente apolar

entorno altamente hidrofílico y con fuerza

iónica elevada, por ejemplo en presencia de
concentraciones molares de NaCl, (NH4)2SO4,
KCl, etc., realizando la elución con una
solución que contiene concentraciones Figura 8
progresivamente menores de la sal pero
crecientes de algún cosolvente con cierto
grado de hidrofobicidad, tal como glicerol, etilenglicol, etanol, etc. La unión entre la biomolécula
y la resina se da a través de regiones hidrofóbicas expuestas. Estas regiones, al estar en
contacto con un medio altamente polar como lo es una solución salina, producen una
separación de fases con el medio, aumentando su energía libre y disminuyendo la entropía en
ese entorno. Así, una forma de disminuir el contenido de energía libre del sistema es unir esas
regiones a los centros hidrofóbicos de la resina.
Las matrices usadas son diversas, Superose, Sepharose, Sephadex. Permite separaciones
rápidas con buenos rendimientos en general, pero los medios cromatográficos usados deben
tener características especiales. Así, una densidad demasiado elevada de grupos hidrofóbicos
producirá rendimientos pobres debido a desnaturalización y a las condiciones extremas
Fuerza iónica

Figura 9
% buffer B
Abs 280 nm

Siembra y lavado Elución

Bioquímica - Cromatografía 7
requeridas para la elución. Acá también se usa la cromatografía de tentáculo.
La Fig. 9 muestra el perfil de elución de una columna de interacción hidrofóbica en la que se
incrementa el porcentaje del buffer B, conteniendo 20% de glicerol, lo que da como resultado la
aparición de picos de proteína. Los últimos en aparecer corresponden a aquellas proteínas más
hidrofóbicas. Nótese que el gradiente se inicia luego de un cierto período de lavado con el
buffer inicial, con lo que se desprenden moléculas que no se unen a la matriz, y que en este
caso la fuerza iónica disminuye.

Cromatografía de afinidad Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es
Interacción
muy usada en el laboratorio como Cargado de la columna
con el ligando
herramienta analítica y preparativa.
Se basa en la interacción de
proteínas con ligandos unidos a la
matriz de forma muy específica. En
general se trata de análogos
(sustancias estructuralmente muy
parecidas) a ligandos que
naturalmente interaccionan con la
proteína, p.ej. el sustrato, inhibidor
o cofactor de una enzima; el
mensajero (hormona, neuro- Elución Lavado
transmisor, toxina) en el caso de
un receptor, aminoácidos
(proteasas; ligandos pseudo-
específicos como pigmentos
(Cibacron blue, dextran blue, etc.)
que se parecen a nucleótidos
usados como cofactores, o
secuencias complementarias de
un ácido nucleico que se desee Figura 10
aislar de una mezcla compleja.
Se utilizan matrices diversas:
agarosa, dextranos, acrilamidas, etc., prefiriéndose aquellas con poros grandes de modo que
posean un límite de exclusión elevado.
La selección del ligando depende de dos factores. En primer lugar, el ligando debe poseer una
elevada afinidad por la sustancia a ser purificada, pero la interacción debe ser reversible. En
segundo término, debe ser posible unir el ligando a la matriz por algún medio sin que esto
modifique sustancialmente su interacción con la macromolécula. La afinidad del ligando
debería situarse entre 10-4 y 10-8 M en solución. Afinidades pobres (Ki > 10-4 M) son
usualmente demasiado débiles para proveer una especificidad adecuada. Si la afinidad es
grande (Ki < 10-8 M), va a ser muy difícil remover la macromolécula una vez unida sin
desnaturalizar la muestra. El ligando interacciona mejor si está situado en el extremo de un
brazo espaciador que lo aleje de la matriz, lo que evita impedimentos estéricos o de otro tipo
relacionados con el tamaño o las propiedades de unión inespecíficas de la matriz.
Los métodos de unión del ligando a la matriz son variados, e incluyen:
• Activación por CNBr: permite la unión de ligandos que contengan grupos amino
primarios (Fig. 10).
• Activación epoxi: une a través de grupos hidroxilo

7
Bioquímica - Cromatografía 8
• Activación por tioles: tiene un espaciador de glutatión que permite unir a través de
grupos tioles
Figura 11 NH
La elución se puede realizar incrementando OH O C NHR
la concentración de sal en el medio de CNBr Derivado de
lavado, por la adición del ligando en forma tiourea
soluble (más frecuente) o por cambios en el
pH de la solución. RNH2
OH OH

Cromatografia de quelado de metales.

Esta técnica explota la Cromatografía de quelado

propiedad de muchas proteínas
de unirse a metales
Carga de la columna
fuertemente. P. ej. en el caso Activación de la columna
de enzimas que requieren un
cofactor metálico para su unión. Me ++
Me ++
Me ++
Me ++
Se usan matrices que Me ++
contienen grupos que pueden
unir en forma no covalente pero Me ++ Me ++
Me ++
muy fuertemente iones
metálicos, como Zn o Co, a
través de grupos
especializados como moléculas
de ác. iminodiacético Elución Lavado
(-CH2N(CH2COOH)2). A
Me ++
menudo la interacción se
Quelante de Me ++
produce a través de residuos en el solvente
de His presentes en la
superficie de la macromolécula. Me ++
Estos residuos pueden estar
presentes naturalmente en la
proteína o haber sido
Me ++
artificialmente introducidos por
técnicas biología molecular en Me ++
el caso de proteínas que han Figura 12
sido clonadas y expresadas en
un sistema heterólogo.

La técnica consiste en cargar la columna con el ión metálico, p.ej. una solución 1 M de Cl2Zn,
luego equilibrar con el buffer, cargar la muestra, y luego eluir con una solución (o establecer un
gradiente) de EDTA, un quelante que secuestra el Zn y despega por tanto a la proteína.

8
Bioquímica - Cromatografía 9
Otros

En general uno puede generar Purificación de proteínas

columnas de prácticamente lo
que desee debido a que se mediante proteína A Agarosa
dispone de matrices activadas,
p.ej. con grupos epoxi, a los que
puede unirse una gran gama de Fc
A A
ligandos.
Un caso especial de IgG
cromatografía de alta +
especificidad lo constituye la Fc
A A
unión de anticuerpos a matrices. 1
Los anticuerpos se pueden
inmovilizar mediante una
variedad de técnicas, pero una 2
de las más usadas es la unión a Fc
A Fc
través de proteína A agarosa. La A
proteína A es una proteína
bacteriana que se une con 3
elevada afinidad al dominio Fc Fc
Fc
A
de la molécula de IgG. De esa A
manera, al pasar una solución
de anticuerpos específicos
contra una determinada
macromolécula a través de una
columna de proteína A-agarosa,
Figura 13
estos quedarán inmovilizados y
formarán un soporte con una
muy elevada especificidad por la macromolécula en cuestión. De esta manera se pueden
purificar proteínas con elevados rendimientos. En la Figura 12 se observa un esquema de este
tipo de cromatografía. En el paso 1, se carga la columna con la solución de anticuerpos. Se
hace pasar luego la mezcla de proteínas a separar, quedando unidas sólo las que son
reconocidas por el anticuerpo (Paso 2). La elución se realiza de diversas maneras, por ejemplo
sustituyendo el buffer en que se trabajó hasta el momento (por lo común cercano a pH 7), por
100 mM glicina pH 3.0.
Por supuesto, la técnica puede ser usada para la purificación de anticuerpos de otras
proteínas, por ejemplo para la purificación de IgG total de suero.

La cromatografía de adsorción es muy usada. En esta las macromoléculas se unen por

interacciones no necesariamente de alta especificidad pero con distinta fuerza de acuerdo con
las propiedades particulares de la macromolécula. Ejemplos de matrices de este tipo son la
fosfocelulosa (fosfato de celulosa) o la hidroxiapatita.

Detección

Las macromoléculas eluidas pueden detectarse por varios métodos: absorción en el UV o a la

longitud de onda de absorción máxima si fueran coloreadas, por variaciones en el índice de
refracción, la conductividad, etc. La Fig. 4 muestra un perfil de elución de una cromatografía de
exclusión molecular en el cual la detección se realiza a 280 nm. Obviamente, este recurso
puede utilizarse para proteínas que contengan residuos aromáticos. Los ácidos nucleicos

9
Bioquímica - Cromatografía 10
pueden detectarse por absorción a 260 nm y las proteínas también a 254 nm (enlace
peptídico). Los hidratos de carbono pueden detectarse haciendo uso de cambios en el índice
de refracción. También pueden tomarse alícuotas de los tubos recogidos y hacer allí la
determinación de la concentración de la macromolécula en cuestión ya sea por sus
propiedades ópticas, por su actividad biológica (actividad enzimática) o por alguna reacción
específica (p.ej. por Coomassie en caso de proteínas).

Flujo del solvente

Con respecto a este parámetro, la administración del solvente se puede realizar por gravedad
o con bombas. El primer caso es posible sólo cuando el soporte es suficientemente laxo como
para permitir el flujo sin necesidad de presión adicional. En este caso entran la mayoría de
medios cromatográficos basados en Sephadex. En el segundo caso, pueden usarse equipos
totalmente automatizados que permiten variar el flujo en forma muy controlada y realizar
automáticamente los gradientes. La velocidad de flujo está en estrecha relación con la
resolución de la técnica, de modo que este punto se amplía en el siguiente apartado.

Técnicas cromatográficas de alta resolución. HPLC y FPLC.

En general, se pretende que las corridas duren el menor tiempo posible para minimizar la
pérdida de actividad biológica, pero sin sacrificar la resolución del método.
La distribución de las macromoléculas en una columna durante la elución hace que se detecten
a su salida de la columna como picos, 1
caracterizados por su altura y su anchura. Lo
ideal es que cada pico sea tan angosto como Figura 14
sea posible, para separarlo de sustancias
Abs 280
que eluyan en la vecindad. En la Fig. 14 se
observa una separación completa de los
0.5
picos 1 y 2. Sin embargo, existe un
solapamiento de los picos 3 y 4 , por lo que
las fracciones intermedias entre ambos
contendrán ambos componentes, y
obviamente la purificación no es en este 1 2 3 4
caso perfecta.
0
Dos procesos causan el ensanchamiento del
pico: la difusión y la turbulencia. La difusión Volumen
es el proceso por el cual la macromolécula, que se concentra en una banda a medida que se
separa de los otros componentes, tiende a difundir hacia atrás y adelante hacia zonas en que
su concentración es menor. La difusión depende del tiempo, por lo tanto puede controlarse con
corridas cortas, aumentando la velocidad de flujo. Sin embargo, esto causará que el flujo
alrededor de las partículas no sea laminar, formándose turbulencias en el lado de la partícula
cercano a la salida que ensancharán el pico. Por otra parte, muchos soportes no aceptan
velocidades muy altas debido a que al aumentar el flujo aumenta la resistencia al avance y en
consecuencia la presión. Con ello la fase inmóvil tiende a comprimirse, dificultando aún más el
flujo y aumentando mas la presión.
La turbulencia puede controlarse haciendo la partícula cada vez más chica. A su vez, al achicar
la partícula se aumenta la superficie, aumenta el rozamiento con el solvente y esto hace que se
requiera más presión para poder lograr un flujo determinado. Para esto se usa un equipo
especializado llamado HPLC (High performance liquid chromatography). En HPLC se utiliza un
sistema de bombas de alta precisión, capaz de entregar flujos muy precisos y constantes a
diferentes velocidades y a elevada presión. Este factor determina que se utilicen cañerías y
columnas de acero u otros materiales capaces de soportar hasta 6000 psi (400 atm). Los

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Bioquímica - Cromatografía 11
soportes utilizados en HPLC también poseen características especiales para permitirles
soportar presiones elevadas. Uno de los materiales más comunes es la sílica, aunque también
se encuentran polímeros sintéticos de alta resistencia.
El HPLC tiene usos como herramienta analítica pero también se puede trabajar en escala
preparativa.
La técnica de FPLC es un intermedio entre los sistemas de baja presión y el HPLC. En este
caso también es posible controlar muy exactamente el flujo mediante un sistema de bombas de
precisión, pero el sistema está limitado a presiones medias, hasta un máximo de 5 MPa. Se
pueden acoplar columnas de diverso tamaño y con una variedad de soportes más amplia que
en el caso del HPLC, aunque no se alcanza la misma resolución. Su uso se inclina más a la
parte preparativa (purificación de proteínas, péptidos y ac. nucleicos) que a la analítica.

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