Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina

Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N° 1
MÉTODOS
ESPECTOFOTOMÉTRICOS

Integrantes : Susana Córdova

Dafne Del Mauro
Alessio Espinoza
Valentina Fuentes
Carrera: Medicina
Sección: I
Fecha de realizacion : 21 de abril, 2010
Fecha de entrega: 28 de abril, 2010
Docentesencargados :BQ Mirna Munoz,M.Sc.
Dr. Reginald Del Pozo, Ph.D.
1. Resumen
El objetivo de este laboratorio fue determinar la
concentración de una muestra proteica a partir de la
medida de absorbancia por el espectrofotómetro
utilizando el método de Biuret. Esto contempla la
realización de un blanco de reactivos de agua
destilada para ajustar la absorbancia a cero, y
también soluciones estándar de albúmina sérica de
bovino de concentraciones conocidas para obtener,
por interpolación en el gráfico, la concentración de
la muestra problema. Para la elaboración de estas
soluciones se utilizaron micropipetas para medir la
cantidad necesaria de reactivo de Biuret, en la
preparación de las muestras contenidas en tubos
kahn, que luego de ser agitadas en el vórtex e
incubadas por 15 min, fueron trasvasijadas en
cubetas para la medición de la absorbancia por
espectrofotómetro. Los resultados arrojaron que
nuestra muestra problema tenía una concentración
de 112 mg/ml. Comparándola con la concentración
normal de proteínas plasmáticas (60-83 mg/ml en
adultos) excede los valores normales. Si
consideramos que la muestra entregada
corresponde a una muestra sanguínea, estaríamos
en presencia de una alteración patológica, como lo
es la Hiperproteinemia que contempla el aumento
en la concentración de alguna o todas las
fracciones proteicas del plasma, así como otros
trastornos en la síntesis proteica.
2. Introducción
Las proteínas, una de las principales
macromoléculas que componen a los seres vivos,
desempeñan el mayor número de funciones dentro
del organismo, ya sea estructural siendo parte de
los tejidos en músculos, piel, en funciones
metabólicas y reguladoras en el transporte de
oxígeno, asimilación de nutrientes, entre otras.
Además, de formar parte de la identidad de cada
ser vivo, constituyendo la base de la estructura del
código genético y sistema de reconocimiento de
organismos extraños. En este informe pretendemos
conocer más acerca de los métodos
espectrofotométricos, usados para identificar y
detectar moléculas y de esta manera medir su
concentración en solucióna través del método de
Biuret. Además, de su vital importancia en el
análisis clínico de metabolitos y enzimas de los
líquidos biológicos. Entre algunos de los objetivos a
alcanzar encontramos:
 Conocer y aprender sobre métodos
espectrofotométricos para cuantificación de
proteínas.
 Aplicar el método de Biuret para
identificación de proteínas en una muestra
problema.
 Habituarse al uso correcto de materiales e
instrumentos en laboratorio.
 Utilizar los conocimientos previos sobre
diluciones en la preparación de soluciones
estándares para la cuantificación de
proteínas.
 Saber interpretar los resultados obtenidos
para poder compararlos con los rangos
normales de proteínas en el plasma.
3. Materiales:
2 Micropipetas (50-200 μl y 100-1000 μl), puntas
para micropipetas; amarillas (5-50 μl),y azules (50-
200 y 100-1000 μl), vaso precipitado de 50 ml, 9
tubos Kahn, 9 cubetas para el espectrofotómetro,
gradilla para tubos Kahn, gradilla para cubetas del
espectrofotómetro, vórtex, espectrofotómetro, reloj.
Muestras:
-Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre
1% en NaOH 14%)
- Solución estándar de BSA (Albúmina sérica de
bovino) 10 mg/ml
- Muestra problema : MP9 x fd 20 (concentración
desconocida)
- Agua Destilada
4. Métodos
Se comienza preparando el blanco de reactivo de
0.5 mL de agua destilada + 2 mL de reactivo de
Biuret.Se preparan 7 diluciones a partir de la
solución estándar de albúmina, calculando
la cantidad necesaria según la fórmula y diluyendo
la diferencia con agua destilada.
C1 x V1 = C2 x V2
C1: concertación de la solución estándar de
albúmina 10 mg/ml
V1: volumen necesario de la solución estándar
C2: concentración de la nueva solución que se
necesita obtener
V2: volumen requerido de la solución a formar (0.5
ml = 500 μl)
Estándar 0.5 mg/ml
C1 x V1 = C2 x V2
10 mg/ml x V1 = 0.5 mg/ml x 0.5ml
V1 = 0.025 ml / x 1000 = 25 μl
Luego diluir con 475 uL de agua destilada, para Concentración para determinar la concentración de
completar los 500 uL requeridos. la muestra problema.

Para la muestra problema (MP9 x fd20) se preparan Gráfico 1. Curva Calibración Absorbancia vs
2 soluciones con 0.025 mL de ella + 0.025 agua Concentración.
destilada + 2 mL reactivo de Biuret. Nótese que se
tuvo que diluir nuevamente la mezcla problema a la Curva Calibración Proteína BSA (Método de Biuret)
mitad, pues la concentración debía encontrarse en 0.450
un rango que no sobrepasara el límite de linealidad.
0.400 f(x) = 0.04 x
A todas las soluciones se agregan 2 mL de reactivo 0.350 R² = 1
de Biuret. 0.300
Se agitan en el vórtex (tomar el tubo desde arriba). 0.250
Incubar por 15 minutos.
Se trasvasijan desde tubos Kahn a las cubetas, 0.200
llenando hasta la mitad de su capacidad(al ocupar 0.150
una cubetafijarse si esta rallada o sucia, si es así 0.100
espreferible no ocuparla. Al trasvasijar debemos 0.050
tomar la cubeta desde arriba porque sinonuestras
0.000
huellas podrían aumentar la absorbancia de la
muestra). 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Se somete primero el blanco de reactivo al concentracion de BSA (mg/mL)
espectrofotómetro a 540 nm para ajustar a cero la
absorbancia.
Se somete posteriormente el resto de las muestras Obtención de la concentración de la muestra
y anotar los resultados. problema a través de la ecuación de la recta.

5. Resultados La recta obtenida en la curva de calibración

corresponde a una ecuación de primer grado con 2
Tabla 1. De volúmenes, concentraciones utilizadas incógnitas, sustituyendo los valores podemos
y absorbancias obtenidas. encontrar el valor de la concentración de nuestra
muestra problema.
Concentración Volumen Volumen absorbancia La ecuación de la recta corresponde a la siguiente
a obtener necesario necesario fórmula matemática:
proteína de H2O

Muestra ---- 500 µL 0

Blanco
Estándar 0.5 25 µL 475 µL 0.016 En donde, y= Absorbancia, m= pendiente, x=
mg/mL concentración, b= coeficiente de posición.
Estándar 1.0 50 µL 450 µL 0.035
mg/mL Debido a que la recta pasa por cero, el coeficiente
Estándar 2.5 125 µL 375 µL 0.108 de posición de la ecuación (b) es igual a cero, por lo
mg/mL que se desprecia y la ecuación queda reducida a:
Estándar 5.0 250 µL 250 µL 0.223
mg/mL
Estándar 7.5 375 µL 125 µL 0.323
mg/mL
Estándar 500 µL ---- 0.409
10.0 mg/mL Luego, se deben de reemplazar los datos,
Muestra 500 µL ---- 0.5 utilizando dos puntos de la recta ya conocidos, con
problema el fin de conocer la pendiente de la recta:
Muestra 250µL 250µL 0.225
problema Punto 1 (5.0, 0.223) y Punto 2 (7.5 , 0.323)
diluida
m = (0.323 – 0.223) / (7.5 – 5.0)
A partir de los datos de la tabla podemos crear un
Curva de Calibración que grafique Absorbancia v/s m =0.04
Reemplazando en la ecuación de la recta podemos
encontrar el valor de la concentración de nuestra
muestra problema.
y = mx
0.225= 0.04*x
x= 5,6 mg/mL
5,6 mg/mL * fd 20 = 112 mg/mL
Comparando la concentración de proteínas del
rango normal fisiológico con el resultado obtenido
en laboratorio fue.
Tabla 2. Comparación entre muestra y rango
normal.
Valor normal de Valor de muestra
proteínas sanguíneas problema
60-83 mg/mL 112 mg/mL
6. Discusión y conclusión.
La aplicación de métodos espectrofotométricos y el
uso de reactivo de Biuret, nos permite determinar la
concentración proteica de una muestra problema.
Su correcto uso, apegándonos a normativas y
estándares establecidos con anterioridad, nos
permitió cumplir con los objetivos determinados
antes de empezar la experimentación, y a partir de
los resultados desarrollar conclusiones.
El trabajar con muestras estándares nos facilitó
llevar nuestros resultados a un gráfico, donde
pudimos observar que describía linealidad. El
grafico 1. posee 6 soluciones estándar que
aseguran su fiabilidad. Fueron preparadas teniendo
en consideración su concentración original y
disolviendo a medida que fuese necesario. Un paso
importante dentro de la experimentación fue hacer
uso del método de Biuret, previamente estudiado, el
cual nos contribuyó al momento de comparar
visualmente la diferencia de concentración, pues el
reactivo de Biuret reacciona en presencia de 2 o
más grupos carbamilos (con excepción de la
histidina, que a pesar de ser una unidad
monomérica, reacciona positivo), agregando una
coloración violeta-azulada a la preparación. Durante
el desarrollo del laboratorio, la tercera y cuarta
muestra estándar correspondiente a una
concentración de 5.0 mg/ml y 7.5 mg/ml
respectivamente, no mostraron la coloración
esperada siguiendo el patrón de las soluciones
anteriores, por tanto decidimos repetir dichas
preparaciones, con el fin de asegurar un correcto
resultado, sabiendo de antemano que el más
mínimo error en un instrumento con tal precisión
como lo es la micropipeta, podía arrojarnos a
resultados que distaban mucho de lo esperado. La
falta de práctica en el manejo de instrumentos, nos
obligó a estar atentos en cada paso de la
preparación y no delegar el trabajo sólo a un
responsable, sino más bien, los 4 integrantes estar
pendientes de lo que ocurría.
Al agregar el reactivo de Biuret a la muestra
problema arrojo un color levemente más intenso de
nuestro estándar con mayor concentración (10.0
mg/ml), decidimos al desconocer cuál era el límite
de linealidad de la muestra, disolver a la mitad
empleando un cálculo de disoluciones y agua
destilada, por lo que el factor de dilución de nuestra
muestra corresponde a 20. Fue esta preparación
diluida la que empleamos en último término para
determinar su absorbancia.
Al comparar la concentración proteica de nuestra
muestra, con el suero humano normal, nos
encontramos que los resultamos nos arrojaron una
concentración de 124 ml/mg, en comparación con
los valores normales de proteínas sanguíneas que
van de 60-83 mg/ml en adultos, 62-80 mg/ml en
niños y 46-73 mg/ml en recién nacidos.
En todos los casos mencionados, nuestra muestra
excede a los valores normales, por tanto si
consideramos que la muestra entregada
corresponde a una muestra sanguínea, estaríamos
en presencia de un paciente patológico. Teniendo
en cuenta que cualquier desajuste dentro de los
parámetros normales de las concentraciones
proteicas sanguíneas pueden ser causa o
consecuencia de afecciones, no nos queda más
que trazar las posibles situaciones donde
encontrásemos órdenes similares.
Hiperproteinemia se define como la concentración
elevada de alguna o todas las fracciones proteicas
del plasma. Esta situación puede ser provocada por
múltiples factores. No es parte de nuestros
objetivos abordar estos trastornos de un punto de
vista fisiológico, por tanto solo haremos mención de
ellos. Podemos citar a las deshidrataciones, los
cuadros infecciosos, neoplasias, entre otros, como
responsables de un desencadenamiento en la
síntesis proteica concernientes a albúminas y
globulinas (proteínas más representativas)
presentando cuadros de hiperviscosidad que deben
ser corroborados con exámenes complementarios.

El desajuste de las concentraciones proteicas en la

sangre son responsables de afecciones graves, que
deben ser examinadas con sumo cuidado. Los
métodos espectrofotométricos nos aportan una
ayuda valiosa en la cuantificación de dichos
desajustes. Conocer y saber emplear estas
técnicas, nos contribuirán como herramienta
indispensable en un futuro desempeño clínico.

Bibliografia:

 Muñoz. M, Del Pozo. R, Guía de Trabajos

Prácticos,
 Carrera de Medicina 2010, Universidad
Católica de la Santísima Concepción,
 Facultad de Medicina, Departamento de
Bioquímica.
 http://www.tuotromedico.com/temas/protein
as_en_sangre.htm
 http://www.diagnosticomedico.es/descripcio
n/Hiperproteinemia--14412.html
 Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de
Bioquímica, Tercera Edición,Ediciones
Omega, 2000, Barcelona, España.