UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE Cs. VETERINARIAS

CÁTEDRA DE FISIOLOGÍA- AÑO 2009
TRABAJO COMPLEMENTARIO N° 2

DIFUSIÓN, OSMOSIS, FROTIS SANGUÍNEO, MICROHEMATOCRITO Y

ERITROSEDIMENTACIÓN.

PRIMERA PARTE:

TEMA: DIFUSIÓN Y ÓSMOSIS

MATERIALES:
Tubos de ensayo, gradilla, solución colorante (azul de metileno o tinta china), agua
destilada, hielo, baño termostático, eritrocitos lavados de bovino, solución de
cloruro de sodio al 0,9%, solución glucosada al 50 %, pipetas, portaobjetos,
cubreobjetos, timer(cronómetro).

DIFUSIÓN

1) Difusión es el proceso mediante el cual las moléculas de un soluto determinado

tienden a alcanzar una distribución homogénea en la solución en la que se
encuentran, desplazándose gracias a la energía cinética de sus partículas desde
el lugar de mayor al de menor concentración. La velocidad con la que un soluto
difunde está modificada por diferentes variables como ser : espesor de la
membrana, liposolubilidad, números de canales presentes en la membrana,
temperatura, peso molecular de la sustancia, cantidad de soluto , capacidad de
disociación, carga eléctrica del soluto.

ACTIVIDAD DEL ALUMNO

TÉCNICA :

En tres tubos de ensayo de 15 ml coloque 10 ml de agua, en el caso del tubo N 3 el

agua deberá estar bien fría o agregársele hielo , luego de esta operación a cada
uno de los tubos se le debe agregar una gota de colorante.

Tubo Nº 1 Colocar en baño termostático.

Tubo Nº 2 Dejar a temperatura ambiente

Tubo Nº 3 Dejar a baja temperatura

Esperar 1-2 minutos y observar: Tiempo de difusión del colorante en cada tubo.
Comente y explique las causas de las diferencias que haya encontrado.
 Colorante Colorante Colorante
TUBO Nº 1

_____ 10 ml _____ 10 ml _____ 10 ml

H2O H2O H2O

TUBO Nº 2 TUBO Nº3

Baño Termostático Tº Ambiente Baja Temp.

OSMOSIS

2) Osmosis: movimiento de moléculas de agua a través de membranas

semipermeables, regulada fundamentalmente por gradientes de concentración y
potencial eléctrico a cada lado de la membrana.
Aplicando estos principios específicamente al comportamiento de las células rojas de la
sangre ante diferentes gradientes de concentración de los diversos líquidos a los que
pueden ser expuestos y conociendo que existen soluciones isotónicas , hipotónicas
e hipertónicas con respecto al contenido de la célula , observaremos los cambios
morfológicos que sufren los eritrocitos como consecuencia de las diferencias de
concentración con dichas soluciones.

ACTIVIDAD PARA EL ALUMNO

TÉCNICA

En una gradilla coloque tres tubos de ensayos, agregue dos mililitros de las siguientes
soluciones, una en cada tubo:

Tubo Nº 1 Solución de Cloruro de Sodio al 0,9%.

Tubo Nº 2 Solución de Glucosa al 50 %.
Tubo Nº 3 Agua destilada.

Luego agregue 1 ml de glóbulos rojos lavados de bovino en cada tubo, mezcle

suavemente por inversión, deje reposar durante 15 minutos. Transcurrido este tiempo
en un porta objetos coloque una gota y observe al microscopio, realice la misma
operación con el contenido de cada tubo.
Comente y explique lo observado en el microscopio respecto a la morfología de los
eritrocitos y relacione el efecto de cada una de las soluciones. Diferencie crenación de
hemólisis y reconozca a cada una de las soluciones como isotónica, hipotónica e
hipertónica.

ERITROCITOS LAVADOS 1 ml

_____ 1 ml _____ 1 ml _____ 1 ml

ClNa Glu H2O

0,9% 50%

Tonicidad
Isotónico Hipotónica Hipertónica

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SEGUNDA PARTE
TEMA: FROTIS SANGUINEO, MICROHEMATOCRITO, ERITROSEDIMENTACIÓN

MATERIALES

Centrifuga para microhematocrito. Varilla de vidrio. Agujas. Colección de agujas,

tipos, conos, medidas, bisel, butterfly. Jeringas descartables, de vidrio, de metal.
Pipetas hematológicas. Anticoagulantes, EDTA, Citrato, oxalato y heparina. Maneas de
sujeción, mocheta y mordaza. Banda de Esmarch. Tijera, desinfectante y algodón.
Portaobjetos comunes. Portaobjeto extensor esmerilado. Tubo de Wintrobe. Pipetas
Pasteur. Jeringas con agujas de infiltración (120). Capilares para microhematocrito
heparinizados y no heparinizados. Tabla de Kaneko. Regla milimetrada. Centrifuga
internacional. Muestra de sangre. Tubos de Khans. Agua destilada. Detergente.
Alcohol. Cepillos. Algodón. Mechero o plastilina.

FROTIS SANGUÍNEO: Extendido de sangre entera , que se realiza sobre un

portaobjetos , con diferentes fines diagnósticos.
El objetivo de realizar una extensión de sangre periférica o frotis sanguíneo es obtener una delgada capa
de sangre sobre un portaobjeto, que luego será teñido con una coloración específica con el fin de poder
evaluar la proporción de cada leucocito ( formula leucocitaria relativa o FLR) y la morfología de las
células sanguíneas y derivados celulares (leucocitos, eritrocitos y plaquetas).
Los frotis sanguíneos deben realizarse inmediatamente cuando se utilizar sangre fresca, o dentro de las 2-
3 horas de la extracción si se añade anticoagulante (preferiblemente EDTA, ya que no produce
deformación de las células)

RECUERDE: para obtener un buen frotis sanguíneo:

* Usar una gota de sangre pequeña.

* Usar portaobjetos perfectamente limpios, desengrasados y secos.
* Usar portaobjetos extensor de bordes lisos.
* Secar rápidamente (al aire) para evitar la crenación de los eritrocitos.

A-MÉTODO

1) colocar una gota de sangre, en un lado y en el centro de un portaobjeto, bien

limpio y desengrasado, previamente rotulado con una identificación del animal
2) colocar otro portaobjeto sobre el primero unos mm por delante de la gota de
sangre con una inclinación de 45° con respecto al porta horizontal
3) desplazarlo hacia atrás hasta que tome contacto con la gota de sangre y permitir
que por capilaridad la gota se extienda a lo largo del borde del portaobjeto
extensor.
4) Deslizar el porta con el que se hace la extensión hacia el lado contrario de donde
se colocó la gota de manera suave y rápida para permitir que la sangre quede
extendida. Solo debe pasarse una vez, de forma continua e ininterrumpida.
5) Secar el frotis al aire lo más rápido posible con movimiento en forma de abanico,
nunca soplando o por calor. La desecación rápida evita la deformación de las
células sanguíneas.
 6) Teñir y observar al microscopio. (actividad que se realizará en el próximo trabajo
complementario).

EL FROTIS SERA MAS GRUESO A MAYOR VELOCIDAD EN LA EXTENSION; MAS

DELGADO A MENOR ÁNGULO ENTRE PORTAOBJETOS.

Técnica de
frotis

PARTES DE UN FROTIS

CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN FROTIS

* Uniforme, de aspecto liso y homogéneo.

* Bordes largos, rectos y que no lleguen a los bordes del portaobjetos.
* Eritrocitos situados en una sola capa.
B - EVALÚE EL FROTIS OBTENIDO
C - REPITA SI NO SATISFACE LAS CONDICIONES
D - ENTREGUE AL DOCENTE

Métodos de los dos cubreobjetos:

MATERIALES: Dos cubres sin grasa limpios y secos

1) Colocar en uno una pequeña gota de sangre en el centro del cubre

2) Sujetarlo por los vértices e invertirlo colocándolo sobre el otro cubre
rotándolo 45 º
3) Por capilaridad se extiende la gota
4) Secar
HEMATOCRITO: Porcentaje de la sangre que corresponde a su parte celular ( glóbulos
rojos , glóbulos blancos , plaquetas), por ejemplo si un individuo tiene un
hematocrito de 45 , se entiende que el 45% del volumen sanguíneo son células y el
resto plasma .

MATERIALES: tubo de Wintrobe. Diámetro uniforme de 3 mm. y calibrado en doble

escala de 10 cm. con divisiones milimétricas. Pipeta de Wintrobe con pera de goma,
puede ser reemplazada por una pipeta Pasteur o bien por una jeringa y aguja de
infiltración (mas de 10 cm de largo). Centrifuga, sangre con anticoagulantes.

MÉTODO

1- Tome la muestra de sangre con la pipeta o jeringa y aguja.

2- Introduzca la pipeta hasta el fondo del tubo en posición vertical.
3- Llene el tubo, levantando la pipeta al mismo tiempo, pero sin sobrepasar el limite
de la columna de sangre, evitando así la formación de burbujas de aire.
4- Enrase en el límite superior de la columna graduada (0-10).
5- Centrifugue a 3000 r.p.m. durante 30 minutos, hasta volumen constante entre dos
lecturas.
6- Lea observando la separación de los componentes sanguíneos.

En la actualidad este método ha sido reemplazado por la técnica de Microhematocrito

MICROHEMATOCRITO:

MATERIALES

1- Algodón, alcohol.
2- Capilares heparinizados para microhematocrito (75 x 1 mm.)
3- Mechero de gas o plastilina.
4- Centrifuga (12.000 r.p.m.).
5- Lector de Kaneko.

MÉTODO

1- Cargue el tubo con sangre obtenida directamente por punción venosa o en su

defecto del frasco de la muestra de sangre (con anticoagulante) manteniendo el tubo
en posición horizontal.
2- Limpie con algodón el exterior del tubo.
3- Obture el extremo libre de sangre, colocando sobre la llama azul del mechero
mientras lo rota entre los dedos. También puede utilizarse plastilina.
4- Centrifugue a 12.000 r.p.m. durante 3 a 5 minutos.
5- Lea utilizando la escala de referencia de Kaneko o con regla milimetrada.

VENTAJAS DEL MICROHEMATOCRITO

* Se puede obviar la extracción de sangre venosa.
* Se obtienen resultados en 5 minutos.
* Valores globulares más exactos y constantes.
*Por la rapidez y facilidad de la técnica se lo puede utilizar para controles seriados
inmediatos.

TUBO DE MICROHEMATOCRITO

PLASMA

CAPA FLOGÍSTICA

CAPA DE GLÓBULOS ROJOS

ESPECIE HEMATOCRITO %
CANINO 37 - 55
FELINO 24 - 45
 EQUINO 32 - 55
BOVINO 30
OVINO 24 - 50
CAPRINO 24 - 48
PORCINO 32 - 50

ERITROSEDIMENTACIÓN

FUNDAMENTO:

Si se deja reposar sangre que contiene anticoagulante , los glóbulos rojos van
descendiendo lentamente quedando por encima de ellos una capa de plasma. El
tiempo que dura la sedimentación es muy constante para cada especie y en individuos
normales. La velocidad de sedimentación depende de múltiples factores que pueden
afectar al eritrocito al plasma o a ambos , siendo algunos de ellos :
 Particularidades propias de la especie
 Número de células
 Forma de las células
 Tensión superficial
 Contenido de fibrinógeno
 Globulinas
 Tipo y concentración de anticoagulante

VENTAJAS
 Facilidad de realización.
 En equinos, caninos y felinos es una prueba muy sensible.
DESVENTAJAS
 Requiere cantidades importante de sangre.
 No puede aplicarse en todas las especies, por ejemplo vacunos y porcinos
reaccionan débilmente a esta prueba.

ACTIVIDAD PARA EL ALUMNO

TÉCNICA:
Se utiliza el método Westergreen el cual consiste en que la sangre (2ml) con citrato
(0,4 ml al 3,8 %), se introduce en pipetas de precipitación (o de Westergreen)
graduadas en milímetro que se coloca en un soporte vertical o inclinado ( lo cual acelera
la velocidad de sedimentación) a temperatura ambiente. Se observa al cabo de
diferentes lapsos de tiempo los mililitros de plasma formado.

VALORES DE REFERENCIA: método vertical expresado en milímetros

Equinos 10min 30min 1h 2hs

Razas de deporte 4-18 3-60 30-110 70-150
Razas de trabajo 0-60 50-150 100-160 120-160
Caninos 1h 2hs 24hs
0-2 2-10 19-35
Felinos 1h 2hs 3hs
0-2 2-10 19-35

BIBLIOGRAFIA

Dukes, H.; Swenson, M. Fisiología de los animales domésticos. 4ta edición. Ed. Aguilar. Madrid. 1977.
Guyton, A. Tratado de Fisiología Médica. 8va edición. Ed. Interameriana. Madrid. 1991.
Harper, H. Manual de química Fisiológica. 7a edición. Ed. El Manual Moderno. México. 1980.
Kolb, E. Fisiología Veterinaria. 2da edición. Ed. Acribia, Zaragoza. 1976.
Schalm, O. Hematología Veterinaria. Ed. Hemisferio Sur. 1981.
Material ofrecido por la cátedra.
William J. Reagan, Teresa G. Sanders, Denis B. DeNicola (Eds.), "Atlas de Especies Domésticas
Comunes", Editorial Harcourt.
Willard, Md; Tvedten, H. Diagnóstico clínico patológico práctico en los pequeños animales, Intermédica,
2004.
Rebar, A.H. Interpretación del hemograma canino y felino. Nestlé Purina PetCare Company 2003