UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUYO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN,

BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS.
QUÍMICA BIOLÓGICA II

TP N° 8 LABORATORIO
METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS
FUNDAMENTACIÓN:

La regulación en el metabolismo de nucleótidos ha sido objeto de serias

investigaciones. La recuperación y reutilización de los mismos tiene gran importancia en la
economía celular.

Las deficiencias genéticas en este proceso conducen a la instauración de patologías de

interés para el profesional de la salud.

OBJETIVOS:

• Conocer las propiedades del producto final de la degradación de las bases

púricas.
• Interrelacionar la clínica médica con trastornos derivados del metabolismo de
bases púricas
• Capacitar en técnicas de determinación de ácido úrico.
• Conocer criterios de almacenamiento de muestras biológicas
• Promover la consulta bibliográfica.

MATERIALES:

• Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
• Micropipetas, pipetas y material volumétrico adecuados.
• Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
• Baño de agua a 37°C (opcional).
• Reloj o timer.

DEGRADACION DE NUCLEÓTIDOS

Al producirse la degradación de los ácidos nucleícos por acción de las nucleasas, los
nucleótidos resultantes experimentan generalmente su hidrólisis enzimática hasta rendir
finalmente las bases púricas y pirimidínicas libres. Si no son recuperadas y reutilizadas, las
bases libres son ulteriormente degradadas y sus productos finales excretados. En algunos
primates el producto final de la degradación de purinas es el ácido úrico, en otros mamíferos y
reptiles es la alantoína. En invertebrados acuáticos el amoníaco es el principal producto de
degradación. La guanina se excreta como tal en arañas y cerdo.
En el hombre la degradación de purinas ha sido bien estudiada y se conocen las
aberraciones genéticas de esta ruta.

Xantina + H2O + O2  ácido úrico + O2-

El radical superóxido se convierte en H2O2 por acción de la superóxido dismutasa.

Aunque en una persona normal de forman diariamente hasta 5 g de purinas libres, solo se
excretan aproximadamente 0,5 g de ácido úrico, la mayor parte de las purinas libres son
recuperadas o recicladas.
Las purinas son recuperadas para su reutilización en la biosíntesis de nucleótidos y
ácidos nucleícos. El mecanismo principal es por la acción de la adenina fosforribosil
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transferasa y la guanina (o hipoxantina) fosforribosil transferasa.

Adenina + 5-fosforribosa-1-pirofosfato  AMP + PPi

Guanina + 5-fosforribosa-1-pirofosfato  GMP + PPi

Dado que hasta el 90% de las purinas libres son recuperadas y recicladas, estas rutas
de recuperación son de la mayor importancia por lo que se refiere a la economía celular. Asi,
por ejemplo, la deficiencia de la enzima guanina (o hipoxantina) fosforribosil transferasa
provoca el síndrome de Lesch Nyhan.

La degradación de las pirimidinas,

en la mayoría de las especies animales,
conduce a amoníaco y urea. También
pueden ser usadas para la síntesis de β-
alanina, y por tanto de Coenzima A. La
principal ruta de degradación de citosina y
uracilo se observa a la derecha. Una senda
similar conduce a la formación del ácido β-
aminoisobutírico a partir de la timina.

Biosíntesis de coenzimas nucleotídicas

Tanto el flavin-adenin-dinucleótido como los nucleótidos pirimidínicos y Coenzima A

son derivados del ácido adenílico. El flavin-mononucleótido (FMN), que no es un verdadero
nucleótido y que se denomina con mayor exactitud riboflavina-nucleótido, es sintetizado por
la enxima riboflavina-quinasa a partir de riboflavina libre (vitamina B2) y el ATP.

Riboflavina + ATP  riboflavina-5’-fosfato + ADP

A partir del FMN se forma FAD por acción de la FMN-adenilil-transferasa:

Riboflavina-5’-fosfato + ATP flavin-adenin-dinucleótido + PP

En las bacterias el NAD es sintetizado a partir del ácido nicotínico libre según una serie
de reacciones, que resumida da:
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Ácido nicotínico + 5-fosfo-D-ribosa-1-PP + 2ATP + glutamina + H2O 

 NAD+ + ác. glutámico + ADP + Pi

TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

El esquema reaccional es el siguiente:

UOD
Ácido úrico + 2 H2O + O2 > alantoína + H2O2 + CO2
POD
H2O2 + 4‐AF + clorofenol > quinona coloreada + H2O

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Reactivo 4‐AF/POD: reconstituir agregando 50 ml de agua destilada,
homogeneizando inmediatamente por inversión para permitir la disolución. Rotular y fechar.
Antes de usar, mezclar por inversión, sin agitar.
Reactivo Fenol: listo para usar. Ver PRECAUCIONES.
Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta 80 partes de
agua destilada, 10 partes de Reactivo Fenol, 10 partes de Reactivo 4‐AF/POD (reconstituido)
y 0,8 partes de Uricasa. Mezclar por inversión, sin agitar, evitando la formación de espuma.
Rotular y fechar.
Pueden prepararse distintas cantidades respetando las proporciones establecidas. Es
importante además, respetar el orden de agregado de los reactivos y asegurar una perfecta
homogeneización de los mismos, a fin de que el Reactivo Fenol no deteriore el
Reactivo de Trabajo.

PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso "in vitro". El fenol es tóxico e irritante.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Reactivo 4‐AF/POD (reconstituido): es estable 3 meses a temperatura ambiente (menor de
25°C) o 10 meses en refrigerador (2‐10°C) a partir de la fecha de su reconstitución. A
bajas temperaturas este reactivo puede cristalizar. En este caso, antes de usar, redisolver
completamente a temperatura ambiente y homogeneizar. La disolución puede acelerarse
colocando el frasco en baño de 37°C unos minutos.
Reactivo de Trabajo: en frasco de vidrio color caramelo y en refrigerador (2‐10°C) es
estable 30 días a partir de la fecha de su preparación. A temperatura ambiente es estable 5 días.
MUESTRA
Suero o plasma heparinizado
a) Recolección: obtener suero de la manera usual. Separar el coágulo dentro de las dos
horas posteriores a la obtención.
b) Aditivos: en caso de emplear plasma, usar solamente heparina como anticoagulante.
c) Sustancias interferentes conocidas:‐ Los sueros ictéricos o con hemólisis visible o
intensa producen resultados erróneos por lo que no deben ser usados.
‐ El fluoruro inhibe la uricasa.
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‐Medicamentos: sustancias fuertemente reductoras, como ácido ascórbico (vitamina C),

Buscapina (butil bromuro de hioscina), etc., suministrados en dosis elevadas interfieren en la
reacción consumiendo H2O2. Por tal razón siempre que sea posible, debe suspenderse la
medicación al paciente 24 horas antes de la toma de muestra. Caso contrario, pueden
obtenerse valores falsamente disminuidos.
No se observan interferencias por: bilirrubina hasta 120 mg/l, hiperlipemia o hemólisis ligera.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.
Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: emplear suero fresco. En caso de no
efectuarse el ensayo en el momento, el suero puede conservarse hasta 3 días en el congelador
(sin agregado de conservadores).

PROCEDIMIENTO
En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B
(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D

Standard ‐ 20 μl ‐

Muestra ‐ ‐ 20 μl

Reactivo de Trabajo 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37°C o 30 minutos a

temperatura ambiente (18‐25°C).
Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde
(490‐530 nm), llevando el aparato a cero con el Blanco.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de reacción final es estable 45 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro
de ese lapso.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

Ácido úrico mg/l = D x f donde f =100 mg/l

S

VALORES DE REFERENCIA
En adultos normales, con ingesta normal de proteínas, se observan los siguientes
rangos de valores:
Hombres: 25‐60 mg/l
Mujeres: 20‐50 mg/l

Los niveles de ácido úrico varían de acuerdo a la edad, el sexo y las diferentes dietas;
incluso se ha observado una variación estacional. Se recomienda por lo tanto, que cada
laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia, teniendo en cuenta
estos factores.