INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT

Guía de Trabajos Prácticos

MICROBIOLOGIA I

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 Trabajo Práctico Nº 1

Práctico Integratorio – Pruebas Bioquímicas

Objetivo:
Realizar aislamiento, tinción y tipificación bioquímica en una muestra incógnita (cultivo
mixto), que contiene bacterias estudiadas anteriormente.

Materiales y reactivos:
- 3 placas conteniendo agar CLDE
- Set de colorantes para tinción de gram
- Batería de tubos conteniendo los distintos medios para realizar las pruebas bioquímicas
según corresponda
- Reveladores de pruebas bioquímicas
- Caldo conteniendo la muestra incógnita
- Ansa recta y ansa rulo

Procedimiento:

Clase 1
- Realizar aislamiento en estrías por agotamiento de inóculo y tinción de la muestra
incógnita, según prácticos anteriores.

Clase 2
- Sobre colonias aisladas de distintos tipos, previa incubación de la muestra, realizar
tinción de Gram.

Clase 3:
- Lectura de pruebas bioquímicas

Resultados:
- Identificar todas las bacterias de la muestra, en caso de ser posible, familia, género y
especie.
- Presentar un trabajo especial sobre Flia. Enterobacterias y Flia. Micrococaceae ,
búsqueda bibliográfica, a realizar por el grupo de trabajo.

Cuestionario:
1- ¿ Cuál es la composición de la leche ?
2- ¿ Lo considera un medio nutritivo para la bacteria ?
3- Mencionar las enzimas que se ponen de manifiesto en esta prueba.
4- Nombrar algunos alimentos a base de leche fermentada.
5- ¿ Qué es la gelatina nutritiva ? Nombre las enzimas responsables de esta licuación.
6- Discuta brevemente la relación entre estas dos pruebas (gelatina y leche) y su
aplicación en bacterias Gram (-).
7- Mencione todas las pruebas bioquímicas que se deben leer a las 24 hs y porqué.
8- ¿ Cuál es la importancia de las pruebas I.M.V.I.C. ?
9- ¿ En qué consiste la prueba de la oxidasa ?
10- ¿ Cuáles de esta lista eligiría como pruebas definitorias para incluir las bacterias Gram
(-) dentro de la familia de las Enterobacterias ? Descarboxilasas – Movilidad – Oxidasa –
Reducción de nitratos – Reacción de indol – Gelatina. Si faltara alguna prueba importante,
incluirla en la lista que elija.

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 Trabajo Práctico N°° 2

Urocultivo

Introducción:
Las infecciones urinarias comprenden una gran variedad de entidades clínicas cuyo
común denominador es la invasión bacteriana de la orina, la misma puede quedar limitada
a la vejiga o ascender por el árbol urinario y llegar al parénquima renal. La mayoría de
las infecciones son adquiridas por vía ascendente y la vía descendente es muy poco
frecuente.
Los microorganismos que se aíslan más a menudo en los pacientes son: E.coli ,
Klebsiella sp., otras enterobacterias y Stafylococcus saprophyticus.

Objetivos:
Analizar muestras de pacientes con sintomatología de infección urinaria. Tipificar hasta
género y especie las bacterias que desarrollen y determinar la sensibilidad antibiótica de
las mismas.
Aprender técnicas semicuantitativas para estimar el nº de UFC/ml en un fluido biológico.

Toma de muestra:
Pacientes que controlan esfínteres.
La orina debe tener 3 horas de retención miccional.
Higienizar los genitales del paciente con jabón y agua hervida, previamente entibiada,
enjuagar bien y no secar. Descartar el primer chorro de orina y juntar el chorro medio en
un frasco estéril. Nunca usar bolsita colectora.

Transporte y conservación:
La muestra beberá enviarse inmediatamente al laboratorio para su procesamiento, de no
ser así, podrá conservarse como máximo 24 horas en la heladera.

Materiales y metodos:
- Placa de CLDE
- Placa de agar Levine.
- Tiras reactivas para orina ( análisis físico químico )
- Portaobjetos y cubreobjetos.
- Microscopio óptico.
- Centrífuga (15 minutos, 2000 rpm).
- Tubos de centrífuga.

Procedimiento:

1. Sembrado de la muestra.
Se siembra la orina en tres estrías con ansa calibrada ( 5 microlitros ) para efectuar un
recuento de colonias sin centrifugación previa.
Recuento de colonias:
Primera estría completa 10 4
Primera estría incompleta < 10 4
Segunda estría 10 4 - 10 5
Tercer estría completa > 10 5
Tercer estría incompleta 10 4 - 10 5

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2. Análisis físico - químico:
Impregnar con la muestra una tira reactiva y leer de acuerdo con las instrucciones del
envase. Es de suma importancia el pH, la densidad, así como la presencia de
hemoglobina o proteínas.

3. Examen microscópico:
Sedimento:
La muestra mínima a procesar es de 10 ml.. En caso contrario informar muestra
insuficiente.
Observar 10 campos e informar promediando, leucocitos, hematíes, piocitos, gérmenes,
células, de la siguiente manera.
De 0 a 5 contar /// de allí en adelante como múltiplo de 5 /// campo cubierto, informar 100
por campo.

Interpretación de los resultados:

Evaluar el resultado del cultivo de acuerdo al pH, densidad, examen microscópico,
recuento de colonias y otros datos clínicos del paciente.

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 Trabajo Práctico N° 3

Identificación de Estreptococos β - hemolíticos del grupo A

Introducción:
Los Estreptococos productores de faringitis, son los llamados Estreptococos pyógenes,
que se encuentran en el tracto respiratorio del ser humano y siempre se lo considera
patógeno potencial. Sin embargo, algunas personas especialmente niños, albergan el
microorganismo sin sufrir signos de enfermedad (portadores asintomático).

Objetivo:
Aprender a identificar Streptococcus pyogenes a partir de muestras provistas por el
docente.

Materiales:
- Placas de petri con agar sangre de carnero al 5%.
- Discos conteniendo droga bacitracina.
- Equipo de serología por el método de coaglutinación para Estreptococos A, B, C y G.
- Discos de PYR

Procedimiento:
Se siembra en media placa de agar sangre realizando 3 estrías sin volver a cargar el
ansa, haciendo 2 incisiones entre las estrías. Se incuba en lata con vela 24 hs. a 37°C.
A los positivos β - hemolíticos se les hace bacitracina y la prueba de PYR
A los negativos se los incuba en estufa 24 hs. y se realiza una segunda lectura.

Interpretación de resultados:
Bacitracina Halo Realizar prueba de pyr, si da + Informar: Grupo A

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 Trabajo Práctico N° 4

Salmonella y Shigella

Introducción:
Estas dos enterobacterias son las principales causantes de enfermedad diarreica no solo
en nuestro país sino en la mayoría de los llamados paises subdesarrollados de nuestro
planeta. Las infecciones causadas por estos dos agentes se adquieren por vía oral fecal.
Existen distintos y muy complicados mecanismos por los cuales causan enfermedad.

Objetivo:
Aislar colonias sospechosas de Salmonella y Shigella de muestras de estas dos especies
sembrados en C.L.D.E. y SS. Identificarlas bioquímicamente y serológicamente.

Toma de muestras:
Siempre colocar la muestra a analizar cualquiera sea su origen en frasco estéril. La
muestra a analizar será suministrada por el docente.

Transporte:
Medio Stuart: en este medio se puede conservar hasta 12 horas luego de recolectada la
muestra a temperatura ambiente.
Medio de Cary Blair: en este medio se conservan las muestras hasta 24 horas luego de
recolectadas, a temperatura ambiente y hasta 7 días en heladera.

Materiales:
- Placas de Petri
- Agar C.L.D.E.
- Agar SS
- Caldo Selenito
- Tubos con agua estéril
- Medio Stuart con hisopo conteniendo muestra extraída de paciente.

Procedimiento:

1. Sembrado de la muestra

a) Si se parte de una muestra con alta carga bacteriana (por ejemplo materia fecal) se
coloca la muestra en S.F. (solución fisiológica), para disminuir el inóculo.
b) Tomar con ansa y sembrar en estrias por agotamiento de inóculo en Agar C.L.D.E. y
Agar S.S.
c) Colocar parte de la muestra en Caldo Selenito.
d) A las 6hs. de incubación del Caldo Selenito, se retira el hisopo, se toma muestra con
ansa y se siembra en Agar S.S.

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2.Pruebas de identificación

- Búsqueda de grupos no fermentadores de LACTOSA SIN SULFHIDRICO (Shigellas)

TSI (Alc/Ac) UREA (-) SIM (---)
XILOSA(-) ACETATO(-) CITRATO(-) LIA (-)

- Búsqueda de grupos no fermentadores de LACTOSA CON SULFHIDRICO(Salmonella)

LIA (+) UREA (-) CITRATO (+)
SIM (+-+) ONPG (-)

3.Reacciones Serológicas

Existen distintas variedades de Shigella:

-Shigella flexneri (somático B)
-Shigella sonnei (somático D)
-Shigella boydii (somático C)
-Shigella dysenteriae (somático A)

También se realiza antibiograma.

Existen diferentes variedades de Salmonella

-Salmonella Typhi
-Salmonella Paratyphi A
-Salmonella Paratyphi B
-Salmonella Paratyphi C
-Salmonella Choleraesuis
-Salmonella Typhimurium
Se somete a serología para antígenos somáticos y antibiograma.

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 Trabajo Práctico N°° 5

Antibiograma por difusión en agar

Introducción:
Consisten en enfrentar discos de papel impregnados con determinada cantidad de
antibióticos a un inóculo bactriano de densidad establecida (108 ufc/ml) distribuida sobre
agar MH. Luego de una incubación adecuada se miden los halos de inhibición.
Permite determinar la sensibilidad de ciertas bacterias a algunos antibióticos. Para que los
datos obtenidos puedan ser comparables es necesario controlar exhaustivamente cada
una de las etapas y materiales empleados en la técnica:
a) medio de cultivo
b) inóculo bacteriano
c) carga de los discos
d) siembra
e) tiempo y temperatura de incubación
f) lectura de los halos.

Para que una cepa sea considerada sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) a un
determinado antibiótico, se deben medir halos de inhibición y se cotejan con tablas de
organismos internacionales (NCCLS) ó locales (Sociedad Argentina de bacteriología
clínica).
Las categorías (S, I, R) sugen de curvas de regresión que relacionan valores de halos con
su correspondiente equivalencia en valores de CIM para cada ATB.
Esta técnica se aplica a gérmenes aerobios o anaerobios facultativos de crecimiento
rápido:
Enterobacterias, Pseudomonas Staphylococcus y Enterococcus. Para otro tipo de
gérmenes se deben realizar modificaciones o bien desarrollar otro tipo de técnicas.

Objetivo:
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos grupos de antibióticos de acuerdo al
germen a estudiar (Enterobacterias, Estafilococos y Pseudomonas.)

Materiales:
- Placas de agar MH
- Hisopos estériles
- Solución fisiológica
- Discos de 6 mm de diámetro con la carga adecuada según el antibiótico a ensayar.
- Estufa de 35º
- Regla o calibre
- Tablas para interpretación de resultados

Procedimiento:
A partir de un cultivo puro de 24 horas, suspender en solución fisiológica 2-3 colonias de
igual morfología y ajustar la turbidez a 0,5 de la escala de Mc Farland.
(Tener en cuenta que no deben pasar más de 15 minutos desde la preparación del
inóculo hasta la siembra de las placas).
Inocular con hisopo (escurriendo bien sobre las paredes del tubo) placas de agar MH, en
tres direcciones, para lograr un distribución homogénea del inóculo y obtener un

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crecimiento confluente. No se deberán emplear placas que estén mojadas, ni deberán
quedar luego de inoculadas mojadas.
Colocar los monodiscos de antibióticos de acuerdo al listado correspondiente a cada tipo
de germen. Los discos que se sacan de la heladera deberán dejarse por lo menos 15
minutos a temperatura ambiente antes de ser utilizados.
No deben pasar más de 15 minutos desde que se colocó la placa hasta la colocación de
los discos.
Incubar en estufa a 35º las placas con los discos, colocándolos de manera invertida.

Importante:
- Antes de comenzar a trabajar sacar las placas de MH de la heladera y los dispenser que
contienen los monodiscos para que tomen temperatura ambiente.
- La altura del agar MH en las placas debe ser de 4 mm.
- No dejar los discos sobre la mesada luego de usarlos.

Interpretación de los resultados:

- Leer el diámetro de la zona de inhibición hasta donde no se observe crecimiento
bacteriano.
- Buscar el valor obtenido en las tablas de la NCCLS, reportar el valor en mm y la
interpretación correspondiente de acuerdo a la tabla.

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 Trabajo Práctico Nº 6

Cim y CBM

Introducción:

Relación Antimicrobiano-Huésped-Germen:
El éxito ó fracaso del tratamiento del paciente infectado con los antimicrobianos depende
de la relación existente entre el huésped, el germen y el antimicrobiano. Estos factores
constituyen la triada ecológica del triángulo de Davis.
La relación entre el antimicrobiano y el huésped busca ser definida por los parámetros
fármaco-cinéticos, que estudia la velocidad para alcanzar una concentración dada de
suero y en el sitio de infección, y los factores que afectan a dichas velocidades.
La relación entre el antimicrobiano y el gremen busca ser definida por la cinética de la
actividad antimicrobiana ó farmacodinámica. Mientras que la farmacocinética estudiará
cómo se logra una concentración dada de antimicrobiano en el sitio de infección, la
farmacodinámica estudiará cómo el crecimiento bacteriano es afectado por dicha
concentración.
Finalmente, el germen se relaciona con el huésped a través de su infectividad ó
capacidad de producir daño, y el huésped se relaciona con el germen a través de sus
defensas inmunes humorales y celulares.

Cinética del crecimiento bacteriano sin antimicrobiano:

Crecimiento bacteriano en un tubo de ensayo:

El crecimiento bacteriano en un medio de cultivo nutritivo presenta un cierto número de
fases sucesivas, siendo las más características las que se ilustran en la figura.

La fase de latencia es la expresión de los fenómenos que no están ligados al crecimiento

propiamente dicho, sino que se deben a razones eventuales del ambiente. Así, por
ejemplo, una transferencia de bacterias de un medio A a otro B, aún estando éstas en
fase exponencial, puede originar un tiempo de latencia si la utilización de sustratos
carbonados del medio B exige la síntesis de una ó varias enzimas inducibles. El mejor
ejemplo de la eventualidad del tiempo de latencia, es su ausencia cuando las bacterias en
fase exponencial de crecimiento se transfieren a un medio idéntico al medio de origen,
permaneciendo iguales en todas las condiciones. Cuando todos los elementos necesarios
están presentes en exceso, el cultivo crece a velocidad constante, y es proporcional a la
densidad del cultivo. La curva de crecimiento es por lo tanto exponencial. Si un alimento
esencial desaparece durante el crecimiento, si la oxigenación del medio llega a ser una
limitante, o si el medio se acidifica ó alcaliniza demasiado, la velocidad de crecimiento
disminuye y acaba por anularse y se entra en la fase estacionaria. Esta fase esta poco
definida. Sus características y su duración depende de la causa que ha limitado el

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crecimiento. Si la limitación se debe a la desaparición de un elemento esencial, las células
viables y la masa bacteriana se mueren inmediatamente. Por el contrario, la acumulación
de desechos tóxicos puede impedir que las células se dividan (número de células viables
constante), pero la densidad óptica puede continuar aumentando al formarse largos
filamentos bacterianos que no pueden dividirse.
Esto es lo que ocurre in vitro pero poco se sabe acerca de lo que ocurre in vivo.

Cinética de la actividad antimicrobiana:

Medición Global: CIM y CBM
Los antimicrobianos pueden producir inhibición (actividad inhibitoria) ó muerte (actividad
bactericida) del crecimiento bacteriano.
Los ensayos de la CIM y la CBM se basan en los estudios del comportamiento de una
cepa bacteriana frente a concentraciones decrecientes de un ATB (antibiótico) para
determinar la mínima concentración del mismo que inhibe el crecimiento bacteriano (CIM)
y la mínima concentración que provoca la muerte bacteriana (CBM).
La CIM se puede determinar en caldo y en agar. La técnica en caldo a su vez puede ser
por macrodilución ó microdilución.
En caso de realizarse en caldo, se deben colocar concentraciones decrecientes de
antimicrobiano. Luego se agrega una suspensión standard de gérmen equivalente a la
escala 0,5 de McFarland. Se incuba 18-24 hs. A 35-37ºC. El tubo de menor concentración
de antimicrobiano que no presenta crecimiento visible (turbidez), es la CIM. La CBM se
determina sub-cultivando los caldos que no presentan crecimiento, mediante repiques a
medio sólido (agar). La CBM se define como la menor concentración de antimicrobiano
que reduce en un 99,9% al inóculo inicial dentro de las 24 horas.
Las CIM yCBM son determinaciones que cuantifican la actividad inhibitoria y bactericida
de los antimicrobianos, respectivamente, y nos dan una idea básica sobre la cinética de la
actividad antimicrobiana.

Correlación entre CIM y Antibiograma:

La relación entre la CIM y el Antibiograma se basa en las curvas de correlación. A cada
valor de CIM corresponde un valor del diámetro de inhibición del antibiograma. Se debe
determinar la CIM de corte (breakpoint), por encima de la cual se considerará la cepa
resistente y por debajo de la cual se considerará sensible. Normalmente esta CIM de
corte presenta un rango y no un solo valor.
De todo lo visto surge que las bacterias en el Antibiograma se dividen en sensibles y
resistentes, según la actividad inhibitoria y no según la actividad bactericida.

Procedimiento:

Determinación de las CIM y CBM para un microorganismo frente a un determinado

antibiótico:

-Preparación del antibiótico:

• 10 mg + 5 ml H2O (estéril) = 2.000 µg/ml SOLUCION MADRE
• 2,56 ml SOLUCION MADRE +1,44 ml H2O (estéril) = 1.280 µg/ml SOLUCION B
• 1 ml SOLUCION B + 9 ml H2O (estéril) = 128 µg/ml SOLUCION C
• 5 ml SOLUCION C + 5 ml H2O (estéril) = 64 µg/ml SOLUCION D
• 5ml SOLUCION D + 5 ml H2O (estéril) = 32 µg/ml SOLUCION E (sol.de trabajo)

-Preparación del inóculo:

A partir de un cultivo puro de no más de 24hs. de incubación, realizar una suspensión

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0,5 de McFarland , en caldo BHI ó similar.
Staphylococcus spp, a partir de la McFarland, se realizará una dilución 1/100 (0,1 ml /
9,9ml)
Enterobacterias, a partir de la McFarland, se realizará una dilución 1/200 (0,05 ml / 9,95
ml)
(las diluciones se realizaran con caldo BHI ó similar)

-Recuento:
Se realiza para verificar el inóculo de trabajo.
• 0,5 ml inóculo + 4,5 ml caldo BHI = 1/10
• 0,5 ml 1/10 + 4,5 ml caldo BHI = 1/100
• 0,5 ml 1/100 + 4,5 ml caldo BHI = 1/1000

De cada dilución se sembrarán 100 µl en superficie, en agar C.L.D.E. Desparramar sobre

toda la superficie con espátula de Drigalsky. Incubar 18-24 hs. a 37ºC .

Orden de agregado de las soluciones: 1º caldo estéril, 2º antibiótico y 3º inóculo.

Los tubos se incuban durante 24hs. a 37ºC.(rotular cada tubo: 1,2, 3,...,n)
El último tubo sin crecimiento (turbidez), nos dará la CIM.
Se repican 100µl de todos los tubos límpidos. Incubar 24hs. a 37ºC.
Determinar la CBM

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 Trabajo práctico nº 7

Control higiénico de productos farmacéuticos

Introducción:
En la Farmacopea, generalmente se utiliza la Americana ó Europea, se encuentran
tabulados los ensayos que determinan si una sustancia ó producto cumple con los
requerimientos microbiológicos especificados para ella. Los ensayos cubren el control de
materias primas, graneles y productos terminados, ya sea de productos estériles y no
estériles sólidos, líquidos, cremas, ungüentos e inyectables.
Las determinaciones se deben llevar a cabo bajo condiciones que eviten la contaminación
accidental del producto a analizar. Sin embargo dichas precauciones no deben afectar a
los microorganismos que serán revelados en el ensayo.

Recuento de viables totales:

Para determinar el recuento de viables totales se utilizan los métodos de filtración por
membrana ó recuento en placa, superficie ó profundidad.
El método del número más probable (MNP) se reserva para recuentos bacterianos donde
no se puede aplicar otro método.
La elección del método se puede basar en factores como la naturaleza del producto ó el
número esperado de microorganismos. Cualquier método que se elija debe estar validado
apropiadamente para dicho producto ó sustancia.

Búsqueda de patógenos:
Durante el procedimiento se utilizan ciertos medios selectivos. Una característica común
en todos ellos es que los organismos lesionados subletalmente no son detectados. Un
organismo lesionado subletalmente es relevante para la calidad del producto, por lo tanto
se debe incluir una resuscitación (pre-enriquecimiento en un medio apropiado para dicho
microorganismo) en el procedimiento.

Plan de muestreo:
El muestreo del producto debe seguir un plan bien definido, que dependerá de factores
como: tamaño del lote, peligro asociado a la salud, características del producto y nivel
esperado de contaminación.

Dilución de la muestra:
Dependiendo de las características de la misma: productos solubles en agua, productos
no grasos insolubles en agua, productos grasos.
En cada caso se utilizará un diluyente apropiado.
Por otra parte, si el producto a analizar posee actividad antimicrobiana, esta debe
neutralizarse apropiadamente.

Materiales:
- Tubos estériles
- Pipetas estériles
- Placas de petri estériles
- Micropipetas 10-100µl y 100-1000µl
- Tips azules y amarillos estériles
- Ansa rulo
- Buffer NaCl-peptona de carne-polisorbato 20, pH=7.00.*
- Caldo BHI

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- Caldo Selenito
- Caldo Lactosado
- Agar PCA
- Agar Sabouraud
- Agar VRBG (violeta-rojo de metilo-bilis-glucosa)
- Agar SS
- Agar Baird-Parker
- Agar EMB según Levine
- Agar McConkey

Procedimiento:

-Preparación de la muestra:
Se pesarán 10g ó se pipetearán 10ml de la muestra a analizar y se los colocará en un
erlenmeyer que contenga 90ml.del caldo peptona de caseína-lecitina-polisorbato,
realizando una dilución 1/10 de la muestra. Homogeneizar. Dejar reposar unos minutos.
Esta será nuestra solución de trabajo.

-Recuento:
Mesófilos: se sembrará por duplicado, 1 ml de la solución de trabajo en profundidad en
agar PCA. Incubar durante 48hs. a 37º C.
Hongos y levaduras: se sembrará por duplicado, 1 ml de la solución de trabajo en
profundidad en agar Sabouraud. Incubar durante 7 días a 21º C.
Enterobacterias: se sembrará por duplicado, 1ml de la solución de trabajo en profundidad
con capa de anaerobiosis en agar VRBG. Incubar durante 48hs. a 37ºC

-Enriquecimiento:
Para la búsqueda de patógenos, enriqueceremos previamente en caldos selectivos.
E.coli y Salmonella: 9ml. Caldo Lactosado + 1ml.solución de trabajo
Staphylococcus aureus: 9ml. Caldo BHI + 1 ml. solución de trabajo. Incubar overnight.
Salmonella: 9 ml. caldo Selenito + 1 ml. Caldo Lactosado (overnight).

-Siembra:
Salmonella: sembrar 100µl, en superficie, en agar SS. Incubar 24hs a 37ºC.
E.coli: sembrar 100µl, en superficie, en agar EMB y McConkey . Incubar 24hs a 37ºC.
Staphylococcus aureus: sembrar 100µl, en superficie, en agar Baird-Parker. Incubar
24hs. a 37ºC.

Interpretación de los resultados:

- Ausencia de Salmonella, Staphylococccus aureus y E.coli en 10g ó 10ml de producto.
- Recuento de viables totales: no más de 103 bacterias aeróbicas, no más de 102 hongos y
levaduras y no más de 10 2 enterobacterias por cada 1g ó 1ml. de producto.

*Buffer NaCl-peptona de carne-polisorbato 20, pH=7.00

Potasio fosfato monobásico 3.56g
Sodio fosfato dibásico 7.23g
NaCl 4.30g
Peptona de carne 1.00g
Agua destilada 1000ml
Polisorbato 20 1%p/v

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Anexo Control higiénico productos farmacéuticos:

¿ Qué ocurre en el laboratorio de Microbiología de una industria⊗?

Se analizan especialidades de todos los grupos farmacológicos y de todas las formas
farmacéuticas.
Se siguen básicamente técnicas USP, aunque no exclusivamente.
Además se realizan los siguientes controles adicionales:
• Control Ambiental de las áreas donde se almacenan las materias primas,
se elaboran los productos y donde se fraccionan.

• Control higiénico de materias primas.

• Monitoreos de limpieza de equipos.

• Ensayo de desinfectantes.

• Control bacteriológico de aguas, tanto de bebida, potable, almacenamiento

como así también la que se utilizará en la elaboración de un producto.

• Validación de productos y técnicas.

• Validación de medios de cultivo, cada vez que se abra un nuevo envase ó

cuando se cambie de lote de producción del mismo.

• Control de envase.

• Control de aspecto.

• Control de rotulación, según normativas oficiales.

Controles higiénicos productos sólidos (comprimidos, tabletas, cápsulas),

geles, emulsiones, cremas, jarabes, gotas y Materias Primas∞ :(no estériles)

El control de los distintos productos dependerá de su composición.

10 gr o 10ml de muestra + 90ml medio de dilución* SOLUCION DE TRABAJO

*El medio de dilución contendrá alguna sustancia y/o sustancias que inactiven algún compuesto
presente en el producto, que pueda actuar como un agente antimicrobiano. Ejemplo de dichas
sustancias: Tween 80, lecitina de soja, miristato de isopropilo, tiosulfato de sodio.

Estrategia de trabajo:

Recuento de bacterias totales: 1 ml en profundidad en medio TSA por duplicado.

Recuento de hongos y levaduras: 1 ml en profundidad en medio Sabouraud por

duplicado.
⊗
industria farmaceútica, cosmetológica o alimenticia. La información que se entrega en este apunte es a
nivel general. Cada lugar de trabajo desarrolla sus propios protocolos de análisis de sus materias primas,
productos semi-elaborados, elaborados y ámbitos de elaboración y fraccionamiento.
∞
en ciertas materias primas se investigará también la presencia de anaerobios.

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Recuento de enterobacterias totales: 1 ml en profundidad en medio VRBG- violeta, rojo,
bilis, glucosa.

Enriquecimiento para la búsqueda de patógenos:

Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.: 10 ml en 90 ml de caldo TSB.

Escherichia coli y Salmonella spp.♣: 10 ml en 90 ml de caldo Lactosado.

Aislamiento de patógenos:

Staphylococcus aureus: repique para reaislar colonias, medios Baird- Parker y/o Vogel
Johnson.

Escherichia coli: repique para reaislar colonias, medios Agar Mac Conkey y/o EMB según
Levine.

Salmonella spp.: enriquecimiento en caldos Selenito y Tetrationato. Luego se reaisla las

colonias, medios Agar Verde Brillante, Bismuto Sulfito, Rambach (cromogénico), XLD,
SS.

Pseudomonas aeruginosa♥: repique para reaislar colonias, medios Agar Cetrimide o PIA.

Se debe usar siempre más de un medio de aislamiento.

La aparición de colonias sospechosas características en los medios selectivos y diferenciales no

son prueba definitiva de identificación de los microorganismos patógenos. Deben ser
identificados mediante pruebas bioquímicas y/o API.

Identificación de patógenos:

Staphylococcus aureus: prueba de catalasa, coagulasa, API STAPH.

Escherichia coli y Salmonella spp.: prueba de oxidasa , API 20E o RAPID 20E

Pseudomonas aeruginosa.: prueba de oxidasa, agar F, agar P, API 20NE.

Ensayo de endotoxinas:

Una endotoxina es el lipopolisacárido que forma parte de la membrana externa de la pared

celular de muchas bacterias gram-negativas, liberada cuando estas bacterias se mueren y la
pared celular se lisa. Esto puede causar muchos síntomas como fiebre, debilidad y dolor en el
huésped. Una endotoxina es lo que se denomina un pirógeno ya que causa fiebre.

LAL: limulus amebocito lisado∝

♣
Se buscará Salmonella spp. Solamente en las materias primas naturales (origen animal) o en los productos
que contengan dichas materias primas.
♥
Se buscará Ps. Aeruginosa en todos los productos que posean agua en su composición.
∝
Método muy difundido para la detección de endotoxinas pero no es el único.

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La reacción del LAL se basa en la formación de un gel(coágulo) por la reacción que le ocurre a la
hemolinfa del cangrejo de herradura en presencia de una endotoxina bacteriana. Este ensayo es
específico para las endotoxinas de las bacterias gram-negativas, debido a esto no detecta otras
sustancias pirogénicas. La principal ventaja del ensayo del LAL es la disponibilidad de un
standard de endotoxina que permite medir semi-cuantitativamente y cuantitativamente.

El ensayo del LAL es el método más difundido para la busqueda de pirógenos en un gran número
de productos pero no para todos. Hay ciertas drogas biológicas que interfieren con el ensayo del
LAL y debido a esto todavía hay productos que se analizan mediante el ensayo de pirógenos en
conejos.

Un resultado positivo del ensayo del LAL es prueba suficiente de que el producto es
pirogénico en humanos. Mientras que un resultado negativo no significa que el producto
sea libre de pirógenos puesto que hay endotoxinas que no son detectadas con el ensayo
del LAL.

A cuáles productos le realizaremos este control?

Sólo a los productos inyectables.

Ensayo de esterilidad:

Se le realizará a todos los productos inyectables (vacunas, antiinflamatorios, citostáticos,

etc), soluciones nebulizantes, óticas y oftálmicas.

El método puede ser por inoculación directa o mediante filtración por membrana. De
acuerdo a cada método, variará el tiempo de incubación: inoculación directa 14 días,
filtración por membrana 7 días.

Medios utilizados: Caldo Tioglicolato para la búsqueda de bacterias y TSB para la

búsqueda de hongos.

Siempre poner a incubar también un control negativo para verificar la esterilidad de los
medios de cultivo y un control positivo, Staphylococcus aureus para bacterias y
Aspergillus niger para hongos.

La ausencia de crecimiento se informará como Cumple Ensayo, puesto que no podemos

asegurar que el lote total del producto sea estéril.

Valoración microbiológica de Vitaminas y Antibióticos:

El análisis de la compisición química de un producto se realiza en el laboratorio de control

de calidad fisicoquímico, sin embargo hay ciertos componentes que se pueden valorar a
través de un método microbiológico.

Vitaminas: turbidimetría ó ensayo en agar.

Antibióticos: difusión en placa.

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