Leishmaniasis DX PDF

Laboratorio Nacional de Parasitologa y Entomologa
(LANPE) Pgina 1 07/12/2003

Elaborado por::
Dr. Sergio MOLLINEDO PEREZ
Jefe de la Unidad de Parasitologa y Entomologa del INLASA
Patlogo Clnico, Medico Tropicalista, Master en Parasitologa

COLABORADORES: Laboratorio de Parasitologa y Entomologa INLASA
Dr. Edwing HOLGUIN
Lic. Lourdes ZEGARRA
Lic. Wilson GIRONDA
Lic. Boris BARROSO
Tec. Walter DELGADO
Tec. Victor DIAZ
Tec. Roberto ARANDA
Tec. Victor BALBOA
Tec. Hugo SELAEZ
Tec. Enzo GAMARRA

IRD
Dr. Laurent BRUTUS
Ing. Dominique SHCNEIDER

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PUBLICACION TECNICA N- 9

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

DE LABORATORIO PARA EL

DIAGNOSTICO DE

LAS LEISHMANIOSIS

UNIDAD DE PARASITOLOGIA Y ENTOMOLOGIA
INLASA

Primera Edicin / La Paz 2.002

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CONTENIDO
Leis mana y Leishmaniosis
A) Introduccin

B) Mtodos de Diagnstico:

B.1. Introduccin al diagnstico de las Leishmaniosis
B.2. Frotis de la lesin
B.3. Cultivo de Leishmania
B.4. Inoculacin a hmster
B.5. Diagnstico histopatolgico
B.6. Intradermoreaccin de Montenegro (IDR)
B.7. Prueba Inmunoenzimtica (ELISA)
B.8. Inmunofluorescencia indirecta (IF)
B.8. Envi de muestras y resultados

Merito fotogrfico
Bibliografa
Anexos
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A) INTRODUCCIN:
Las Leishmaniosis son un complejo de Enfermedades que pueden infectar al humano que
vive o tiene actividades laborales en las reas tropicales y sub tropicales del planeta; las
transformaciones ecolgicas principalmente en los pases en vas de desarrollo, suelen
condicionar la aparicin de nuevos focos de la enfermedad, situacin que hoy en da permite
a que estas enfermedades se presenten cada vez ms expandidas y cobren mayor importancia
en la Salud Pblica de los pueblos.

Se han descrito alrededor de 29 diferentes especias de Leishmanias, de las que 21 se han
aislado de humanos y son responsables de producirles diferentes formas clnicas de la
enfermedad con manifestaciones muy variadas: las formas viscerales pueden tener un
comportamiento epidmico, endmico u holoendmico, con formas inaparentes o sub clnicas
a casos graves mortales; las formas tegumentarias (que afectan a tegumentos: piel y mucosas)
presentan un largo espectro clnico que van desde la forma cutnea que curan
espontneamente, hasta las formas incurables cutneo difusas o formas cutneo mucosas que
producen graves destrucciones faciales.

Para fines del siglo XX, segn la Organizacin Mundial de la Salud (Desjeux, 1993), las
Leishmaniosis tiene una distribucin mundial, estn presentes en 4 de los 5 continentes del
planeta (frica, Asia, Amrica y Europa); extendindose por 88 pases, (21 de Amrica); la
poblacin en riesgo es de aproximadamente 350 millones de habitantes y anualmente un
milln y medio de personas (adultos y nios) enferman de Leishmaniosis en todas sus
formas; estas cifras son de difcil evaluacin debido a que su distribucin es focal en zonas
alejadas y dispersas, existiendo casos no diagnosticados, casos asintomticos, y por que los
Sistemas de Salud generalmente no consideran la declaracin obligatoria de la enfermedad.

Bolivia, con una poblacin de casi 8.350.000 (INE: censo 2001) de habitantes repartidos en
forma irregular en un territorio muy grande y geogrficamente diverso (1.098.581 Km2); el
rea endmica de la Leishmaniosis se extiende por ms del 70 % del territorio, solamente
en 3 departamentos de los 9 (Oruro, Potos y Chuquisaca) no se han reportado casos
autctonos (17, 28, 30); el nmero de casos oficialmente reportados por ao han aumentado
de 120 (1982) a 2310 (1996); por lo tanto podemos inferir, que las Leishmaniosis al igual
que otras enfermedades transmitidas por vectores (Malaria, Enfermedad de Chagas), tiende a
aumentar por influencias diversas, algunas de las cuales son las siguientes:

Lucha qumica anti vectorial no integrada y dependiente de financiamiento
externo.

Mltiples asentamientos (colonizadores) en zonas endmicas de los Valles
(Yugas), Amazona y Chaco, antiguamente no poblada.

Desarrollo de importantes Proyectos Agrcolas, Ganaderos, Industriales,
Aurferos, Petrolferos, Gasferos, de vinculacin caminera, etc., en zonas
endmicas.

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Migraciones temporarias a gran escala de la poblacin Andina (Altiplnica)
debida a sequas, cierre de las Minas y bsqueda de mejores condiciones socio
econmicas.

Calentamiento global y fenmenos climticos El Nio oscilacin sur (ENOS).

Urbanizacin rpida y no planificada de estos nuevos pueblos.

Modificaciones ecolgicas producidas por la poblacin.

En Bolivia a pesar del conocimiento ancestral de estas enfermedades, las medidas para
enfrentar los requerimientos de investigacin, diagnstico oportuno, tratamiento precoz y
completo y educacin para la Salud; las Leishmaniosis se estn extendiendo, (Cochabamba,
Santa Cruz, Beni, Pando, La Paz) re-emergiendo (Tarija) y adaptndose al medio urbano
antropizacin del ciclo.

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B) MTODOS DIAGNSTICOS:
Los procedimientos de laboratorio utilizados para el diagnstico de las Leishmaniosis han
sido y siguen siendo exhaustivamente revisados por diferentes autores (1, 12, 25, 26, 55,
62, 63), en el presente resumen pretendemos citar las partes ms importantes de estas
tcnicas y la relacin con nuestra propia experiencia en la utilizacin de las mismas.

El diagnstico acertado de un proceso infeccioso como son las Leishmaniosis, es la
demostracin del agente patgeno (parsito) o de sus productos en los tejidos o fluidos del
husped (anticuerpos), esta deteccin no siempre es posible. La deteccin de los parsitos
(amastigotos) agentes de la Leishmaniosis es frecuentemente complicado, en particular
cuando se trata de parsitos del complejo Leishmania (V.) braziliensis, (importante en
nuestro pas), donde el nmero de amastigotes presentes en las lesiones es escaso; en
nuestra experiencia sobre terreno y tomando en cuenta las caractersticas e idiosincrasia de
nuestra poblacin que recurre al centro mdico rural solo despus de haber fracasado en sus
mtodos de curacin empricos, solamente en el 40% o menos de los casos con lesiones de
diferentes estadios se puede demostrar el parsito (Mollinedo S., datos no publicados),
similares observaciones fueron sealadas por Furuya et al. (20) y Mardsen, (34); sin
embargo se debe hacer notar que cuando se realizan exmenes en pacientes con lesiones de
corta evolucin, sin infeccin agregada, sin tratamiento, la sensibilidad sube hasta el 90%;
debido a que las Leishmaniosis son enfermedades rurales los investigadores estn
proponiendo alternativas de mtodos de diagnstico con mayor sensibilidad y
especificidad, recomendndose que sean simples, de corta ejecucin y bajo costo
operacional.

El conocimiento de las tcnicas de diagnstico y su correcta interpretacin, son
fundamentales para orientar las acciones de los mdicos generales, tropicalistas,
dermatlogos, epidemilogos, que asocian estos resultados a la signo sintomatologa clnica
que presenta el paciente. La mayor parte del territorio de Bolivia es endmica a estas
enfermedades, en la actualidad el diagnstico de las Leishmaniosis es realizado en base a
las manifestaciones clnicas; el frotis es deficientemente realizado y no se realizan
exmenes serolgicos, que a su vez no son capaces de discriminar las infecciones recientes
de las antiguas y pueden ser falsos positivos, al presentar reactividad cruzada con la
enfermedad de Chagas, malaria, tuberculosis, lepra y brucelosis; por lo anotado es
imperioso mejorar estos con el estudio y la precisa realizacin de las tcnicas descritas en el
presente manual.

En el diagnstico de las Leishmaniosis se pueden presentar las siguientes situaciones
clnico epidemiolgicas, para las cuales se deben tener en cuenta diferentes estrategias de
diagnstico:
Confirmacin de un caso clnico sospechoso
Descarte de un caso atpico
Seguimiento de tratamiento
Encuesta sero epidemiolgica
Investigacin

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B.1. Introduccin al Diagnstico de las Leishmaniosis:

METODOS PARASITOLOGICOS:

Mtodos Parasitolgicos Directos: Con estos exmenes se observa el agente
etiolgico directamente, por lo que constituyen la base fundamental del diagnstico
biolgico de confirmacin de la enfermedad, los principales son:
- Frotis: El parsito se lo detecta en forma amastigote en la muestra obtenida de la
lesin (lcera) del paciente.
- Biopsia: El parsito tambin esta en forma amastigote en los tejidos y requiere
un proceso clsico histopatolgco.

Mtodos Parasitolgicos especiales: La ejecucin de estos exmenes en el caso del
cultivo y Xenodiagnstico es limitada a laboratorios especializados (II y III Nivel),
debido a que no son mtodos parasitolgicos especiales y se los utiliza generalmente
para investigacin.
- Cultivo: Generalmente se realiza de tejido cutneo o mucoso (biopsia), aspirado
de lesin, material obtenido por puncin de mdula sea o bazo.
- Xenodiagnstico: Laboriosa tcnica que requiere la crianza en laboratorio de
especies de Lutzomyias, con las que se hace picar al paciente sospechoso de la
enfermedad, presenta mltiples inconvenientes.
- Intradermoreaccin de Montenegro (IDRM) o Leishmanina. Revela la respuesta
a mediacin celular y se la emplea principalmente en I nivel.

METODOS SEROLOGICOS:

Mtodos Serolgicos: Constituyen una herramienta valiosa para el diagnstico de la
infeccin, se basan en la respuesta del organismo frente al parsito (antgeno
generalmente en forma promastigote); lo ideal de estos mtodos es que sean fciles de
realizar, que se obtengan resultados rpidos y confiables y que su lectura sea objetiva:
- Las pruebas Inmunoenzimticas (ELISA), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI);
Aglutinacin Directa (AD); revelan la respuesta a mediacin humoral

Mtodos serolgicos especiales: Son aquellas pruebas que no han tenido una
validacin suficientemente amplia, utilizan diferentes reactivos y mezclas de antgenos
que pretenden aumentar la especificidad del diagnstico; se han propuesto diferentes
matrices para la inmovilizacin del antgenos como tiras reactivas (Dipstick); Westwern
blot, etc.

Algunas de estas pruebas han mostrado alta sensibilidad y especificidad, debindose
estandarizarlas como pruebas de rutina en los laboratorios regionales; la especificidad suele
variar considerablemente por lo que se recomienda que los lmites de positividad deben
definirse localmente; sin embargo es necesario indicar que en la actualidad la prueba
serolgica ideal no existe; las curvas de distribucin de frecuencias de ttulos en una
poblacin dada se superponen, vale decir que vamos a encontrar un porcentaje de falsos
positivos y otro de falsos negativos, que no nos permiten diferenciar claramente entre los
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individuos infectados de los no infectados y discriminar las personas enfermas (que pueden
desarrollar la enfermedad) de las no enfermas (que no desarrollaran la enfermedad). Para
que haya confiabilidad, estas tcnicas deben estandarizarse y tener un estricto control de
calidad en base a una Red de Laboratorios, que permita constantes intercambios de
experiencias y muestras de referencia y muestras problema.

El cuadro anterior resume las principales situaciones para utilizar estas tcnicas y tambin
observamos en el Flujograma N- 1 y 2 las responsabilidades de realizacin de estas
tcnicas por niveles :

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TEJIDO SUERO
RASPADO BIOPSIA
FROTIS FROTIS
- IFI
- ELISA
- DOT-ELISA
IDRM
LESHMANINA
INMUNOPATOLOGIA
PCR
- ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS
- ANTICUERPOS MONOCLONALES
- REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
CARACTERIZACIN
AISLAMIENTO
DEL GERMEN
PACIENTE CON SOSPECHA
CLNICO EPIDEMIOLOGICA
TOMA DE MUESTRA
EXUDADO
- ASPIRADO
- MICROPIPETA
- CULTIVO
- INOCULACIN EN
HAMSTERS
HISTOPATOLOGIA
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ENVIO MUESTRAS PARA
- CONFIRMACIN
- DIAGNOSTICO
- CONTROL DE CALIDAD

ENVIO DE MUESTRAS PARA
- ENTIFICACION
- DIAGNOSTICO

ENVIO DE MUESTRAS PARA
- VERIFICACIN

LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

LABORATORIO DE ENDEMIAS PARASITARIAS
TRANSMITIDAS POR VECTORES

- INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
- DIAGNOSTICO HISTOPATOLGICO
- INOCULACIONES EN HAMSTERS O RATONES
- CARASCTERIZACIN DE CEPAS (ISOENZIMAS)
- SUSCEPTIBILIDAD DEL PARASITO A LAS DROGAS
ANTILEISMANIASICAS
- ANTICUERPOS MONOCLONALES
- REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
LABORATORIO LOCAL
- FROTIS
- INTRADERMORREACCIN (LEISHMANINA)
- CAPTURA DE Lutzomyia
LABORATORIO INTERMEDIO
- AISLAMIENTO PARASITO MEDIANTE CULTIVO
- ASPIRADO
- BIOPSIA
- RECONOCIMIENTO DEL VECTOR
LABORATORIO REGIONAL

- ELISA Y/O DOT ELISA
- PCR
- MANTENIMIENTO DE CULTIVOS DE LEISHMANIA
- IDENTIFICACIN TAXONOMICA DE Lutzomyia
- MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE Lutzomyia
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B.2. Frotis de la Lesin:

Fundamento:
Es el examen rpido, fcil, econmico y de certeza, todos los dems exmenes son
complementarios; puede ser implementado inclusive a nivel de los recolectores de
muestras (Nivel I) para ser enviado a lectura donde exista un microscopio; consiste en
reconocer por examen microscpico las formas amastigotes teidas dentro de los
macrfagos o fuera de estos, obtenidas de una muestra de sustancia intercelular de las
lesiones extendida en un portaobjeto (ver fotografas), la sensibilidad es variable del 30 al
90% y depende de la forma clnica; tcnica empleada para la toma, procesamiento y lectura
de la muestra; tiempo de evolucin de la lesin, tratamientos previos, existencia de
infeccin sobre aadida y experiencia del examinador.

Muestra requerida:
El frotis puede ser tomado de diferentes tejidos, dependiendo el tipo de leishmaniosis:
Frotis directo del borde de la ulcera (puncin extendida con palito)
Frotis halo inflamatorio o rodete de la lesin cutnea (con bistur)
Frotis de la lesin secundaria activa
Frotis de medula sea

Equipo, materiales y reactivos:
Laminas porta objetos
Hoja de Bisturi 20 o 21 o palillos de maderas
Gasa estril
Alcohol al 70 %
Lpiz marcador
Jeringa estril de 1cc
Anestsicos
Giemsa
Buffer pH 7.2
Microscopio
Aceite de inmersin

E.2.A. Procedimiento:
Frotis directo del borde de la lesin (lcera):
Seleccin del rea de muestra. Si hay varias lesiones, debe escogerse la que tenga
menor tiempo de evolucin y los bordes ms indurados.
Con una mano enguantada, lavar la zona de la lesin con abundante agua corriente. De
existir una costra deber ser retirada; si existe pus se debe limpiar minuciosamente; si
existe sangrado se debe realizar una buena hemostasia.
La muestra debe ser tomada de tres lugares diferentes, de la misma lcera y escogiendo
reas activas representativas o ms sospechosas.
Producir isquemia, presionando sostenidamente con el dedo un rea adyacente al borde
de la lesin.
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Con un palillo de madera (escarba dientes) previamente esterilizado se procede a
pinchar en el borde de la lesin y se hace girar (rotar) el mismo, evitando el excesivo
sangrado (1).
La muestra obtenida se extiende en tres lugares diferentes, en un porta objetos, rotando el
palillo, evitando pasar dos veces por el mismo sitio (2).

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Se repite el proceso en dos o tres lugares de la misma lesin
Identificar la lamina con el cdigo e iniciales del paciente y dejar secar a medio
ambiente.
Fijar la muestra con alcohol corriente de 70 % y secar al medio ambiente
Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y
en el formulario de remisin de lminas.
Isquemia:
Producir isquemia presionando sostenidamente en el borde de la lesin y lugar exacto
escogido.
Dadas las caractersticas de nuestros servicios de Nivel I, recomendamos esta tcnica por su
sencillez, escasos requerimientos de material y buenos resultados, cuando se respetan
minuciosamente todos los pasos descritos.

E.2.B. Halo inflamatorio de la lesin:
Se siguen las dos primeras citas descritos en F.2.A.
Escoger un rea representativa del borde de la ulcera (halo inflamatorio o rodete)

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Presionar con firmeza el borde escogido de la lesin, hasta que se vuelva plida
(isquemia)
En la parte central del borde activo (paralelo a la lcera) con la hoja de bistur realizar
una pequea incisin de 3 mm de longitud con 3 mm de profundidad.
Secar la sangre con gasa seca y estril
Con la punta del bistur raspar los bordes de la incisin tratando de obtener tejido
Con el pequeo material sero hemtico obtenido en la hoja de bistur, hacer un frotis
delgado en una lmina porta objetos, evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
ambiente.
Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y en
el formulario de remisin de lminas.

Esta tcnica es desconocida en nuestro medio pero con ella se suelen obtener mayor
nmero de parsitos.

E.2.C. Frotis de la lesin secundaria activa:
Si las lesiones estn en las fosas nasales, se invita al paciente a limpiarse la nariz para
retirar el mucus
Con la mano enguantada se lava cuidadosamente la lesin secundaria con agua
corriente, retirando costras, evitar el sangrado, y si el mismo se produce, hacer una
buena hemostasia.
Escoger un rea activa (rea ulcerada) de la lesin.
Con un escarba dientes (palillo de madera) realizar un raspado fino y cuidadoso
Con el escaso material obtenido, hacer un frotis delgado en una lmina porta objetos,
evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
ambiente.
Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y en el
formulario de remisin de lminas.

E.2.D. Frotis de Mdula sea (sospecha de Leishmaniosis visceral):
La toma de muestra debe realizarse de preferencia por personal capacitado en ambiente
hospitalario, con previo recuento de plaquetas (no inferior a 40.000 x mm3)
Para garantizar la seguridad del examen y rapidez, debe prepararse al personal (1
operador y 2 asistentes que sujeten al paciente) y aadir al material mencionado lneas
arriba, lo siguiente:

- Aguja (tricar) 0,8 mm con jeringa de 5 mL (estril)
- Medios de cultivo
- Una caja de curaciones
- Alcohol yodado
- Xilocaina al 2% con jeringa de 5 mL.
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Al paciente en decbito lateral, inmovilizado, tras el reconocimiento y palpacin del
operador, se le realiza asepsia a nivel de la cresta iliaca antero superior.
Se inyecta anestesia intradrmica en forma de abanico en el lugar escogido.
Despus de esperar entre 3 a 5 minutos, se hace un pequeo corte (1 cm), que facilite el
acceso a la cresta iliaca, realizando la hemostasia correspondiente.
Con la herida abierta, se introduce el trocar al hueso y se aspira.
El escaso material aspirado (de media a dos gotas) debe ser sembrado en medios de
cultivo inmediatamente, con el restante se realizan frotis (mnimo 3 lminas por
paciente).
Obtenida la muestra, se procede a suturar la herida (1 o 2 puntos de sutura)

Procesamiento de la Muestra: La muestra obtenida por cualquiera de los mtodos se la
procesa de la siguiente manera:
Se procede a fijar la muestra con alcohol metlico (en nuestro pas por costos se utiliza
alcohol etlico 96) durante por lo menos 3 minutos; descartar el alcohol y secar a
temperatura ambiente.
Cubrir la lmina con solucin de trabajo Giemsa (una gota de solucin Giemsa madre
por cada ml de solucin buffer pH 7,2 a 7,4 por 30 minutos. Se pueden utilizar otros
colorantes: May Grundwald Giemsa, Wright.
Descartar el colorante y lavar suavemente con agua corriente
Secar al medio ambiente
Observar a inmersin con microscopio

Envo de la muestra:
En el puesto de salud, el RPS, o el sanitario en su recorrido deben realizar este examen
y debido a que NO cuenta con microscopio, deber remitir la muestra (frotis) al
laboratorio ms cercano de la red, teniendo el siguiente cuidado:
- Envolver la lmina (fijada y secada) en un papel en forma individual,
debidamente rotulada y envuelta en paquetes de no ms de 10 lminas.
- El paquete debe ser colocado en una caja de cartn y adicionar las ficha
epidemiolgicas respectivas.
- Cubrir la caja con un papel, rotular este y enviarlo al laboratorio de referencia
ms cercano.
- Los laboratorios de mayor complejidad debern enviar sus muestras en cajas
porta placas, debidamente identificadas y numeradas

Lectura e interpretacin de resultados:
Por medio del microscopio con objetivo 100 X y aceite de inmersin se debe observar
la lmina por no menos de 30 minutos.
De encontrar elementos sospechosos de ser parsitos, lo primero que tenemos que hacer
es verificar su forma y tamao.
Los amastigotes generalmente estn dentro de los macrfagos, tambin se los puede
encontrar fuera de estos (fotografas); se los reconoce por que tienen forma redondeada
u ovalada, miden de 2 a 6 micras de dimetro y dentro del citoplasma se observa 2
estructuras bien coloreadas al contener ADN:
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- El Ncleo, de forma redondeada, que ocupa 1/4 a 1/5 de la clula, esta pegada a
la membrana citoplasmtica.
- El Kinetoplasto o Kinetonucleo, formacin pequea de forma de bastn,
ubicada a un costado del ncleo, se tie ms intensamente que el ncleo
En caso de que el resultado sea negativo y exista una fuerte sospecha de la enfermedad,
se recomienda repetir el examen de un sitio diferente de la misma lesin o de otras
lesiones.

Los resultados de laboratorio deben consignar obligatoriamente la densidad parasitaria que
observa segn la siguiente escala propuesta por la OMS (45):

Resultado Negativo: (-) No se observan formas parasitarias en 1.000 campos
observados, o en un mnimo de 30 minutos de observacin.
Resultado Positivo: (+) observacin de ocasionales o escasos amastigotes solos o en
pequeos grupos en forma intracelular (Macrfagos) o extracelular,
Negativo escaso mltiple: (-) 1 a 10 parsitos en 1.000 campos observados.

Fuentes de error limitacin de procedimientos, interferencias y precauciones:
Nuestros pacientes primero utilizan farmacopea emprica en sus enfermedades, por lo
que las lesiones frecuentemente estn contaminadas con bacterias y/u hongos, despus
que fracasan en su curacin emprica, recin recurren al sistema de salud por lo que
recomendamos un buen lavado con agua corriente o agua y jabn, de acuerdo a criterio
mdico se puede realizar tratamiento previo antimicrobiano.
las lceras que evolucionan mucho tiempo (crnicas), presentan un menor nmero de
parsitos.
El frotis del lecho ulceroso sin limpieza previa, frecuentemente permite solo observar
detritus celular y no parsitos
El uso de agua oxigenada, alcohol Iodado en la limpieza previa de las ulceras, tambin
elimina los parsitos por lo que no se recomienda su utilizacin

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E.3. Cultivo de Leishmania:
El material obtenido a partir de la Biopsia o aspirado de la lesin primaria o secundaria, se
incorpora al medio de cultivo in vitro, tradicionalmente se usa el medio bifsico con base
de agar sangre Medio Novy-Mac Neal-Nicolle (NNN); en la actualidad existen otros
medios, agar sangre, Drosophila de Schneider, RPMI, LIT, Seneckjie); el cultivo se utiliza
para identificar la especie del parsito, tambin puede emplearse para investigacin de
mamferos reservorios (roedores, perros), para potenciales vectores y como fuente de
antgeno para pruebas inmunolgicas (Ver anexos).

El medio de Cultivo con relacin al frotis, tiene la facilidad de que se observan
generalmente un nmero mayor de promastigotes mviles, mientras que en el frotis existen
generalmente escasas formas amastigotes; el inconveniente es que se requiere la instalacin
de estufas de cultivo y un procedimiento con tcnicas de asepsia rigurosas debido a la fcil
contaminacin bacteriana de los medios.

CULTIVO DE ASPIRADO
Muestra: biopsia, aspirado de mdula sea
Material y Equipos requeridos:
- Jeringa de tuberculina (1 mL) con aguja 25 o 26
- Alcohol al 70%
- Suero fisiolgico estril
- Antimicrobianos en viales (Sulfato de Estreptomicina 1g y Penicilina Sdica
1000.000 de Unidades).
- Tubos de medio de Cultivo NNN (2 a 4 por paciente)
- Gasa estril
- Mechero de alcohol
- Microscopio de Luz
- Estufa de cultivo

Procedimiento:
El material es obtenido de acuerdo al mtodo descrito en 1.979 por Hendricks y Wright,
sigue los siguientes pasos:
- Lavar la lesin con abundante agua
- Elegir una zona representativa y desinfectar esta con el alcohol al 70%
- Se carga la jeringa de tuberculina con 0,2 ml de solucin salina estril ms los
antimicrobianos; estando lista la jeringa, se escoge un rea decolorada de la
ppula o del borde no necrotizado de la lcera, procedindose a punzar e
inyectar suavemente el contenido de la jeringa
- Inmediatamente se aspira, haciendo girar suavemente la aguja en abanico, la
obtencin de escasas gotas debe manejarse cuidadosamente tratando de no
contaminarlas
- Se procede al sembrado en los tubos de cultivo, con la proteccin del mechero,
una gota por tubo con tapa rosca, a la cual se le aade 0,1 ml de solucin salina
con antimicrobianos

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- Los tubos se cultivan a 24 C, revisndolos cada da, en caso de no contar con
una estufa de cultivo, se puede mantener los tubos a temperatura ambiente,
remitindolos a la brevedad posible al laboratorio ms cercano de la red.

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CULTIVO DE BIOPSIA:
Muestra: Tejido
Material y Equipo requerido: Todo el material requerido para el aspirado y adems:
- Punch sacabocados estriles de 2 y 4 mm, (de preferencia desechables, se
utilizara el ms pequeo en lesiones de cara o partes nobles).
- Bistur con hoja 20 o 21
- Dos Pinzas estriles
- Una tijera de punta estril
- Xilocaina al 2%
- Papel filtro
- Mortero o caja Petri
- Viales

Procedimiento de la realizacin de la Biopsia:
- Lavar generosamente la lesin con agua
- Escoger un borde representativo y activo de la lcera.
- Desinfectar con alcohol al 70%
- Inyectar 1 mL. de anestsico (Xilocaina al 2%), en la zona escogida en forma de
abanico.
- Introducir el punch, en el borde de la lesin (tomando tejido sano y necrtico)
haciendo rotar suavemente.
- Retirar el punch y pinzar en fragmento, para que con el bistur o tijera se corte la
base del fragmento y se desprenda la muestra.
- La herida sangrante debe ser presionada con gasa por un mnimo de 5 minutos,
el operador evaluar si existe la necesidad de realizar un o dos puntos de sutura
y cubrir la herida con apositos.
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- El fragmento de tejido se lo deposita en papel filtro para absorber la sangre,
evitar cualquier contaminacin.
- Se deposita el fragmento en una caja Petri o un vial que contenga solucin salina
ms antimicrobianos, se espera 2 horas para continuar el proceso.
- Se tritura la muestra en un mortero estril (mortero de tubo) aadiendo 0,5 mL
de solucin salina con antimicrobianos. De no contar con mortero, se puede
utilizar una caja Petri en la que ayudado por el bistur se tritura la muestra en 0,5
mL de solucin salina y antimicrobianos.
- El resultado del triturado es un homogeneizado rosado que se lo recoge con una
jeringa estril o pipeta de Pasteur, para luego inocular 2 a 3 gotas por tubo de
medio de cultivo
- El procedimiento debe estar rodeado de medidas para evitar la contaminacin
bacteriana y mictica, utilizando campana de flujo laminar o mechero, de
acuerdo a las caractersticas del centro donde se procese la muestra.

Lectura e Interpretacin de Resultados:
Si se cuenta con microscopio invertido se puede leer los tubos de cultivo diariamente sin
temor a contaminarlos en el proceso; si se cuenta con microscopios normales se utiliza la
proteccin del flujo laminar o mechero y con una asa de platino se revisan los tubos cada
48 horas a partir del tercer da (un tubo a la vez por das); se toma una gota del
sobrenadante para su observacin al microscopio en bsqueda de promastigotes, la
presencia de formas mviles indica positividad, debindose informar detalladamente en la
hoja de resultados (Ver fotografas).
- (+) Presencia de promastigotes.

Los cultivos que permanecen negativos, se los descarta a los 30 das.

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E.4. Inoculacin a hmsters (Mesocricetus aureatus):
Este procedimiento se puede realizar de preferencia en trabajo sobre terreno, o bsqueda
activa (en la zona rural) con la finalidad de aislar la cepa; al no existir medidas que
garanticen un aislamiento en tubos de cultivo se utiliza este procedimiento que es ms
sencillo si se toman todas las medidas recomendadas.

El material homogeneizado obtenido de la lcera por medio de la aspiracin o biopsia, se lo
inocula al animal de laboratorio por medio de una jeringa de insulina (de 1 mL), inoculando
intradermicamente en el rea de la nariz o dorso de las patas traseras.
Se utiliza Hmster dorados (de preferencia machos) de 150-200 g de peso y mayores a
11 semanas de edad.
Los animales inoculados deben ser enviados a un bioterio, debidamente identificados,
con atencin especial, se los revisa cada semana tratando de detectar en las zonas donde
se ha inoculado, generalmente la presencia de inflamacin (enrojecimiento) o la
aparicin de una ppula, constituyen evidencia de infeccin por Leishmania (Ver
fotografas).
En el Hmster positivo, para excluir una inflamacin con la contaminacin del proceso
se procede a la confirmacin del caso y recuperacin de la cepa por medio de:
- frotis de la lesin
- aislamiento por aspiracin y resembrado en medios de cultivo
- sacrificio del animal y procesamiento de sus patas
Al animal negativo, s lo sacrifica a los 3 meses para proceder a la necropsa para
realizar cultivos de bazo e hgado.

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E.5.Diagnstico Histopatolgico:
El estudio histopatolgico de una muestra (biopsia de lesin), solo confirma el diagnstico
cuando el patlogo reporta la existencia de amastigotes, su sensibilidad es menor al examen
directo y frecuentemente solo se informa como reaccin inflamatoria de tipo
granulomatosa compatible con Leishmaniosis.

Material:
- bistur
- viales (frascos) conteniendo formol al 10%
- etiquetas y ficha de envo de muestras

Procedimiento:
- Se toma la muestra de una regin representativa previamente identificada (borde
de una lcera en piel o lesin secundaria activa de mucosas).
- Con el bistur se procede a realizar un corte mnimo que nos permita obtener
parte de tejido sano y borde de la lcera o lesin activa.
- La fraccin de tejido es introducido inmediatamente al frasco que contiene
formol al 20%
- Se rotula la muestra con el nombre del paciente y datos importantes de su
enfermedad y se enva la muestra al laboratorio Regional ms cercano
- En el laboratorio de referencia, se procede a la inclusin del pedazo de tejido en
parafina, para su posterior corte con micrtomo, los cortes montados en un porta
objetos, se tien con Tincin Universal (hematoxilina Eosina) y se observan al
microscopio.

Lectura e Interpretacin de Resultados: La histopatologa es muy variable en funcin
a la especie parasitaria, evolucin clnica de la enfermedad, etc., por lo que es difcil
sealar parmetros estndar.

Los procesos de Inmunohistopatologia, con la utilizacin de anticuerpos policlonales
(53) o monoclonales, permiten un diagnstico especfico y sensible aunque ms
costoso.

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E.6.Intradermoreaccin de Montenegro (IDR), Leishmanina:
Fundamento :
Es una prueba de hipersensibilidad retardada(inmunidad celular) que pone en evidencia la
presencia o contacto con el parsito, Al introducir antgeno en la cara anterior, tercio
medio del antebrazo, se produce una reaccin tisular a las 48 a 72 hs. Que se manifiesta por
induracin en el sitio de la inoculacin.
Es una herramienta complementaria para el diagnostico

Fundamento principio del procedimiento:
Se recomienda utilizarla en centros de I nivel perifricos o sobre terreno en los siguientes
casos:
- En pacientes con sospecha de la enfermedad
- En pacientes con duda diagnstica, con lesin activa de ms de 4 semanas de
evolucin.
- Pacientes con lesiones trpidas o atpicas.
- Pacientes en estadio latente con enfermedad antigua o cicatrizada, que presenten
signo sintomatologa cutnea mucosa.

Material y reactivos:
- Leishmanina de 30 ug?ml (Ag obtenidos a partir de promastigotes)
- Jeringa estril de 1 ml (insulina o tuberculina)
- Alcohol al 70%
- +Algodn
- Regla graduada en mm
- Bolgrafo

Procedimiento:
- Desinfectar con alcohol al 70% la regin de la cara anterior, tercio medio del
antebrazo.
- Inyectar va intradrmica 0.1 ml de la leishmanina en la superficie escogida.
- Llenar la ficha epidemiolgica y el cuaderno de registro con los datos del
paciente y marcar el permetro de la zona de inoculacin con el bolgrafo
poniendo la fecha.
- Recomendar al paciente las siguientes observaciones: No tocar ni rascarse la
zona, no emplear cremas, alcohol u otras sustancias en la zona, no frotarse en el
rea de la puncin, no beber bebidas alcohlicas

El paciente que esta infectado, presenta una reaccin de hipersensibilidad al antgeno de la
leishmanina, que se manifiesta con induracin, edema y enrojecimiento.

Lectura e interpretacin del resultado:
Se debe leer entre las 48 a 72 horas de inyectado el antgeno
El paciente que esta infectado, presenta una reaccin de hipersensibilidad al antgeno de la
Leishmanina, que se manifiesta con induracin, edema y enrojecimiento.

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Lectura:
- Se delimita el rea de induracin utilizando un bolgrafo, marcando la periferia o
borde de la induracin determinado con la yema de los dedos en los cuatro
cuadrantes; tambin se puede buscar con el bolgrafo un rea de resistencia en
un trazado de la periferia hacia el punto de inoculacin.

- Se procede a medir el dimetro solamente del rea indurada (ppula) por medio
de una regla graduada en mm; debe evitarse confusin con el rea eritematosa
que generalmente es ms amplia.

Si el dimetro de la induracin es de 5 mm o mayor se considera la IDRM positiva.
Algunas veces la reaccin es tan fuerte que puede haber necrosis en el punto de inoculacin
(9-33-35-36).

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E.7.Prueba Inmunoenzimtica (ELISA):
La prueba de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es una prueba sensible que
nos permite detectar y cuantificar anticuerpos en fluidos biolgicos, principalmente suero
sanguneo (20, 26, 46, 63).

El antgeno (Ag) se lo fija (adsorbe) a una superficie slida (placa de poliestireno); es
reconocido por el anticuerpo especfico (Ac) existente en el suero del paciente, esta
reaccin antgeno-anticuerpo de revelado por un conjugado que esta constituido por una
anti-inmunoglobulina humana marcada por una enzima (ej: peroxidasa); posteriormente se
adiciona el sustrato no cromtico (ej:perxido de hidrogeno), el cual, por accin de la
enzima es transformado en un producto coloreado y soluble que se puede leer en forma
visual o con un fotocolorimetro para determinar la densidad ptica.

Las principales caractersticas de la enzima a usarse son:
- debe ser estable
- debe presentar alta actividad especfica
- debe ser de fcil unin covalente al antgeno o al anticuerpo.

MUESTRA: Suero

MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:

- Antgeno: protenas solubles de promastigotes de Leishmania sp.
- Sueros:
*Sueros control positivo, con ttulo de anticuerpos conocido.
*Sueros control negativo.
*Sueros de muestras problema de los pacientes
- Conjugado: inmunoglobulinas de carnero o cabra anti inmunoglobulinas
humanas marcadas con exima-IgG y anti-IgM humanas, marcadas con la enzima
peroxidasa.
- Tampn fosfato salino (PBS) 0.01 M, pH 7.2
- Tween 20 al 0.05%
- Tampn carbonato-bicarbonato 0.06 m, pH 9.6
- HCL 2 N o H2SO4 2 N
- KOH 0.1 N
- Sustrato soluble: perxido de hidrgeno y ortophenilendiamina OPD) como
cromgeno
- Albmina bovina srica (BSA) al 1% o leche en polvo descremada al 5% para
bloqueo de sitios activos libres de la placa
- Micropipeta multicanal (200 uL)
- Micropipetas (20 a 200 uL)
- Placas de microtitulacin de poliestireno.
- Cmara hmeda (papel absorbente humedecido con agua dentro de un envase
plstico cerrado)
- Puntillas de pipetas para 20, 100 y 200 uL, puntas descartables.
- Refrigerador
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- Estufa a 37grados centgrados
- Lector ELISA para microplacas
- Impresora para lector ELISA

PROCEDIMIENTO:
- Diluir el antgeno en tampn carbonato-bicarbonato 0.06 M, pH 9.6
- Sensibilizar las placas colocando 100 ul del antgeno diluido en cada pocillo de
la placa.
- Colocar las placas en cmara hmeda e incubar a 37C por 2 horas o en
refrigeracin (4C) por 18 horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Adicionar 200 ul de solucin BSA al 1% o leche en polvo descremada al 5%
(diluido en tampn carbonato-bicarbonato 0.06 M. pH 9.6) en cada pocillo e
incubar en cmara hmeda a 37C por una hora. Esto evitar reacciones
inespecficas.
- Lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0.05% por diez minutos cada vez.
- Diluir los sueros problema al doble a partir de 1/10 en PBS-Tween 20 al 0.05%
(1/10, 1/20, 1/40,1/80, ...); colocar 100 uL en cada pocillo e incubar en cmara
hmeda a 37C por dos horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez con una
leve agitacin.
- Adicionar 100 uL de conjugado e incubar en cmara hmeda a 37C por una
hora. Previamente, diluir el conjugado segn su ttulo en PBS-Tween 20 al
0.05% .
- Lavar 3 veces con PBS - Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Colocar rpidamente 100 uL del sustrato recin preparado e incubar en
oscuridad (lejos de la luz), por 30 minutos a temperatura ambiente.
- Detener la reaccin adicionando 100 uL de HCL 2N o H2SO4 2N en cada
pocillo.
- Realizar la lectura utilizando un lector de ELISA con filtro de 492 nm.

LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:
En caso que la muestra sea positiva, se forma el complejo antgeno-anticuerpo especfico,
manifestado por un producto coloreado y soluble.
- Resultado Cuantitativo: Se obtiene midiendo las densidades pticas (grados de
absorbancia) de los productos solubles, mediante el lector de ELISA
(espectrofotmetro).

=el blanco debe dar una lectura inferior a 0.100
=los sueros negativos dan lecturas menores a 0.200.
=los sueros positivos son mayores a 0.200

FACTORES DE ERROR:
Los resultados falsos positivos y falsos negativos suelen deberse a reacciones inespecficas:
- Reacciones cruzadas con otros tripanosomideos, principalmente Trypanosoma.
- Bloqueo inadecuado de las placas.
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- Antgenos y/o conjugados mal titulados.
- Solucin cromgena preparada con demasiada anterioridad (ms de 15 min).
- Paciente con factor reumatoide (FR) positivo anticuerpos antinucleares
(ANAS).
- Placas de microtitulacin inadecuadas.

OBSERVACIONES: Esta tcnica debe ser estandarizada por cada laboratorio
- Las concentraciones ptimas de los antgenos y los conjugados debern ser
determinadas por titulacin en bloque.
- Las muestras de sueros debern ser trabajadas por duplicado y diluidas en serie a
partir de 1/10.
- En la realizacin de cada prueba se utilizarn tanto los sueros controles positivos
de ttulo conocido como los sueros negativos diluidos en serie. Esto permitir
determinar los ttulos de las muestras en estudio.
- El volumen de los componentes, as como los tiempos de incubacin de las
distintas etapas de la tcnica de ELISA, pueden variar de acuerdo a la
estandarizacin que realice cada laboratorio.

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E.8.Inmunofluorescencia indirecta (IFI):
Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos especficos anti Leishmania (IgG e
IgM) en suero de pacientes, donde los promastigotes de Leishmania (antgenos) son
adheridos a un portaobjetos. El complejo Ag Ac revelado con isotiocianato de fluorescena
es visualizado al microscopio de inmunofluorescencia.

Con promastigotes de Leishmania (antgenos), adheridos en un. En caso de ser positiva la
reaccin antgeno-anticuerpo es revelado con isotiocianato de fluorescena es visualizada
con el microscopio de inmunfluorescencia por medio de la adicin de una anti-
inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de fluorescena, la reaccin
fluorescente da un color verde manzana brillante a los promastigotes (ver fotografa).

Muestra suero sanguneo de un minimo de 2ml de sangre.

MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:
- Antgeno: promastigotes de Leishmania sp. Fijado en placa
- Sueros:
*Sueros control positivo con ttulo conocido de anticuerpo.
*Sueros control negativo
*Sueros problema de pacientes con sospecha de Leishmaniosis
- Conjugado: anti-Inmunoglobulinas humanas marcada con isotiocianato de
fluorescencia.
- Tampn fosfato salino (PBS) pH 7.2
- Tampn fosfato salino (PBS) pH 7.2 Tween 80 a 1%
- Azul de Evans.
- Glicerina tamponada, pH 8.5
- Placas de microtitulacin de poliestireno.
- Tubos de hemolisis para dilucin de suero.
- Papel filtro.
- Cmara hmeda (placa petri conteniendo papel absorbente hmedo).
- Microscopio de fluorescencia

PROCEDIMIENTO PREPARACION DE ANTIGENO:
- Se requiere una lnea constante de cultivo de promastigotes de Leishmania.
- Micropipetas / tips descartables
- Jarros couplin
- El momento de mximo crecimiento (7 a 8 das), se toma la parte liquida del
medio y se la centrifuga a 2500 rpm/10 minutos.
- Se descarta el sobrenadante y se lava el sedimento con PBS, dos veces, por
medio de la centrifugacin a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con PBS-formalina al 2%
y se deja reposar durante 24 horas.
- Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento con PBS, dos veces, por medio
de la centrifugacin a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y diluir el sedimento de la centrifugacin final en PBS
hasta obtener de 25 a 30 parsitos por campo microscpico (objetivo de 40 X).
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- Se depositan 10 uL de la solucin obtenida en cada campo en que estn
divididas las lminas de microscopa; dejar secar a temperatura ambiente.
- Se guardan los porta objetos (lminas con Ag) en cajas porta-lminas y se
almacenan a 70C a 20C, hasta su uso.

PROCEDIMIENTO
- Descongelar las placas necesarias, dejndolas a temperatura ambiente por una
hora.
- Se retiran un nmero de lminas con antgeno del congelador de acuerdo a los
requerimientos y se las deja a temperatura ambiente por una hora.
- Hacer las diluciones correspondientes con PBS en tubos de hemlisis (1/20,
1?40, 1/80, 1/160)
- Se colocan 20 uL de cada dilucin del suero sobre las reas de la lmina que
contiene el antgeno fijado; es necesario llevar un protocolo (anotacin) de la
localizacin de los sueros problema y controles en los pocillos.
- Se incuban las lminas en cmara hmeda y estufa a 37C, por 30 minutos.
- Se retiran las lminas de la estufa y se lavan 3 veces con PBS:
Primer Lavado: con una pizeta que contiene PBS se lavan las lminas evitando
que el chorro caiga directamente sobre las muestras.
Segundo Lavado: colocar las lminas en recipientes (Koplin o caja Petri)
cubrindolas con PBS por 10 minutos, luego descartar el PBS.
Tercer Lavado: se procede como en el segundo lavado.
- Utilizando papel filtro retirar cuidadosamente el exceso de PBS del contorno de
las preparaciones.
- Colocar sobre cada rea que contiene el antgeno, 20 uL del conjugado e incubar
en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. Previamente se diluye el conjugado
segn su ttulo en tampn PBS-Tween 80 al 1% o azul de Evans al 0.2%
- Lavar como se indica en prrafos anteriores.
- Se seca la lmina cuidadosamente con papel filtro (como se indica
anteriormente), luego se coloca glicerina tamponada e inmediatamente se cubre
con laminilla cubre objetos.
- La lectura en microscopio de inmunofluorescencia se realiza inmediatamente
con objetivo de 40 X.

LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:

REACCION POSITIVA:

- La presencia de anticuerpos contra las leishmanias en el suero dan lugar a la
formacin del complejo antgeno-anticuerpo especfico revelado por la
coloracin fluorescente color verde manzana.
- El suero es titulado considerando el valor mayor de dilucin que presente
fluorescencia ntida en toda la superficie del parsito.
Se reporta el titulo de anticuerpos considerando la mayor dilucin que presente dilucin
ntida en la superficie del parsito.

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REACCION NEGATIVA:
- En las reacciones negativas no hay fluorescencia, el parsito presenta una
coloracin caf rojiza.
- El umbral de reactividad para anticuerpos totales generalmente es una dilucin
de 1/40.

FACTORES DE ERROR:
Las reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ser causadas por:
- Reacciones cruzadas con Tripanosoma cruzi.
- Conjugados de ttulo inadecuado.
- Mezcla de distintos sueros.
- Conjugados y sueros control mal conservados.
- Iluminacin deficiente del microscopio (lmpara de iluminacin gastada).

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E.9. ENVIO DE MUESTRAS Y RESULTADO:

ENVIO DE LAMINAS:
En el caso de tener un paciente con sospecha de Leishmaniosis (lesin primaria) en Nivel I,
deber hacerse un mnimo de 2 lminas por lesin:
- Una se procesar en el Nivel I
- La segunda se remitir con el diagnstico presuntivo y la ficha clnica -
epidemiolgica respectiva al laboratorio de referencia regional para su control
de calidad.

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ENVIO DE MATERIAL CULTIVADO Y SUEROS:
La muestra, tomada siguiendo las recomendaciones de la presente gua debe envirsela
tomando todas las medidas de bioseguridad debido a que el material es altamente riesgoso,
solo se recomienda el manejo en investigacin o en laboratorios de Nivel III y IV.

El tubo conteniendo la muestra debe ser colocado en forma vertical, envuelto al algodn
dentro de una cajita de cartn, en cuyo exterior se colocar una flechita indicando la
posicin en que se debe mantener la caja. Incluir ficha con datos clnicos y epidemiolgicos
del paciente, la efecha y asegurarse que llegara a su destino en el menor tiempo posible; no
refrigerar.

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INFORME DE RESULTADOS:
El resultado del diagnstico ser remitido en dos copias:
- al Programa de Control de las Leishmaniosis de la Direccin de Vigilancia
Epidemiolgica o Direccin de Control de enfermedades.
- A los remitentes del Nivel I, para el tratamiento del paciente y la
correspondiente inclusin en la Historia Clnica para fines estadsticos y
epidemiolgicos.

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MINISTERIO DE SALUD Y PREVISIN SOCIAL
Red Nacional de Laboratorios de Salud (Leishmaniosis)
Nombre y apellidos: ...............................................................................................
Edad: ...................................... Municipio: ...................................
Distrito: ......................... rea: ................ Sector: ........................................
Servicio de Salud: .................................................................................................
Responsable del Programa: .................................................................................
Examen solicitado.................................................................................................
Fecha: ..................................................................................................................
RESULTADOS
Descripcin de a muestra:

______________________________________________________________
Frotis:
( ) Negativo ( ) Positivo, ................cruces
Interpretacin del frotis:
-Resultado Negativo: (-) No se observan formas parasitarias en 1.000 campos observados, o en un mnimo de
30 minutos de observacin.
-Resultado: (+) observacin de ocasionales o escasos amastigotes solos o en pequeos grupos en forma
intracelular (Macrfagos) o extracelular, 1 a 10 parsitos en 1.000 campos observados.
-Resultado (++) observacin entre 1 a 10 amastigotes en 100 campos observados en forma intra o
extracelular.
-Resultado: (+++) se observan abundantes amastigotes en nidos intra y extra celulares, 1 a 10 amastigotes en
10 campos observados.
-Resultado: (++++) se observan de 1 a 10 parsitos por campo
-Resultado (+++++) se observan de 10 a 100 parsitos por campo
-Resultado (++++++) se observan ms de 100 parsitos por campo
________________________________________________________________
Intradermo reaccin de Montenegro (Leishmanina)
( ) Negativo ( ) Positivo, ........ milmetros

La lectura se realiza a las 48 o 72 horas y se considera positivo si la induracin es mayor a 5
milmetros.
_______________________________________________________________
Biopsia (Histopatologia)

______________________________________________________________
Inmunofluorescencia indirecta: (IFI)

Enzimo inmuno ensayo (ELISA):

_______________________________________________________________
CONCLUSIONES:
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G. MERITO FOTOGRAFICO:

Diseo de la cartula Mollinedo S. y Aranda R.; Formas clnicas de Leishmaniosis
presentes en Bolivia

Fotografa 20.- Dr. Bermdez; Tubos Vacutainer con medio NNN, para realizacin de
cultivo en casos especiales en el I Nivel de atencin.

Todas las restantes fotografas fueron realizadas por el Dr. Sergio Mollinedo.
Fotografa 1.- Toma de muestra por puncin rotacin por medio de palo (escarba
dientes), para realizar frotis en bsqueda de amastigotes, tobillo izquierdo, Hospital Virgen
de Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografa 2.- Toma de muestra por puncin rotacin por medio de palo (escarba
dientes), para realizar frotis en bsqueda de amastigotes, pierna izquierda, Palos Blancos,
La Paz.
Fotografa 3.- Toma de muestra por raspado con borde posterior de lanceta, en borde de
la lcera en codo izquierdo, para realizacin de frotis y bsqueda de amastigotes, Hospital
Virgen de Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografa 4.- Toma de muestra por raspado con borde posterior de lanceta, en borde de
la lcera en pierna, para realizacin de frotis y bsqueda de amastigotes, Hospital Virgen de
Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografa 5.- Presin entre dos dedos del borde de la lcera (halo inflamatorio o rodete),
hasta que se vuelva plida (isquemia), teniendo listo el bisturi
Fotografa 6.- Corte con bistur y raspado en el borde de la lcera en halo inflamatorio o
rodete.
Fotografa 7.- Toma de muestra para frotis por medio de Puncin Aspiracin en borde de
la lcera
Fotografa 8.- Materiales para realizacin de biopsia (punch biopsy descartable y mortero)
Fotografa 9.- Biopsia del borde activo de la lcera
Fotografa 10.- Tubos con medio de cultivo NNN
Fotografa 11.- Tcnico realizando lectura al microscopio de frotis teidos con Giemsa, en
bsqueda de amastigotes, delante de el tiene lminas de referencia.
Fotografa 12.- Rosaceas (grupos de promastigotes unidos por sus flagelos) en medio de
cultivo.
Fotografa 13.- Animal de laboratorio (Hamster) con lesiones en pata delantera y hocico
Fotografa 14.- Patas de animal de laboratorio (Hamster) tras haber sido inoculado con
Leishmania amazonensis con importantes lesiones en guante de boxeador
Fotografa 15.- Nidos de amastigotes en corte de tejido observados al microscopio
Fotografa 16.- Inoculacin de la IDR de Montenegro en tercio medio, cara anterior de
antebrazo, formacin del habon
Fotografa 17.- Medicin de la reaccin cutnea (induracin) de la IDR de Montenegro a
las 72 horas.
Fotografa 18.- Promastigotes observado en microscopio de Inmunofluorescencia, despus
de realizacin de la tcnica de (IFI).
Fotografa 19.- Envo de placas (lminas de frotis), para su lectura o control de calidad
Fotografa 21.- Tincin Giemsa, Tcnicos diluyendo la solucin madre; Riberalta, Beni
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H.BIBLIOGRAFIA:
1. Alvar Ezquerra Jorge; (1997); Las Leishmaniosis de la Biologa al control; Junta de
Castilla y Len; Zamora, Espaa.
2. Angles R.; Le Pont F.; Desjeux P.; (1.982); Visceral canine Leishmaniosis in
Bolivia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 76,
704.
3. Argemiro D.O.; Costa S.; Barbosa A.; Orge M.; Carvalho J.; (1.997) Asymptomatic
Leishmania chagasi Infection in relatives and neighbors of patients with Visceral
Leishmaniosis; Memorias do Instituto Oswaldo Cruz; Vol. 92(1), Jan/Feb.
4. Arias J., Monteiro, P.S., Zicker, F., (1.996), The Reemergence of Visceral
Leishmaniosis in Brazil, Emerging Infectious desease, Vol 2 N 2.
5. Balcazar Juan Manuel, (1.956); Historia de la Medicina en Bolivia, Ediciones
Juventud, La Paz Bolivia.
6. Balcazar Juan Manuel, (1.955); Epidemiologa en Bolivia, Ediciones Juventud, La
Paz Bolivia.
7. Barroso Boris; (2001); Biologa y Ecologa de Leishmania sp. en canes infestados
en el distrito de salud V, Bermejo Tarija; Tesis de Licenciatura, Facultad de ciencias
agrcolas y pecuarias, Universidad Tomas Frias.
8. Bryceson A.D.M., (1.969), Diffuse cutaneous Leishmaniosis in Ethiopia I. The
Clinical and Histological features of the disease. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.,
63, 708-737.
9. Convit J., Pinardi, M.E., and Randon, A.J., (1.972), Diffuse cutaneous
Leishmaniosis: a disease due to an immunological defect of the host. Trans. Roy.
Soc. Trop. Med. Hyg., 66, 603-610.
10. Dario Velez Ivan & Agudelo Sonia; (1996); Leishmaniosis: Manual de
procedimientos para el diagnstico de la Leishmaniosis cutnea americana; editorial
Universidad de Antioquia; Medelln, Colombia.
11. De Arruda W.; Da Costa F.; Nahas S.; Rosenfeld G.; (1.949); Leishmaniose
Visceral Americana: constatacao de dois casos; Brasil Med. 63, 8-9
12. Dedet J.P.; (1.999); Les Leishmanioses; Universites Francophones; Ellipses Aupelf
/ Uref
13. Delgado, O., Feliciangeli M.M., Gomez, B., Alvarado, J., Garcia, L., Bello, C.,
(1.998); The re-emergence of American Visceral Leishmaniosis in an old focus in
Venezuela: present situation of human and canine infections, Parasite, Dec, 5(4):
317-323.
14. Desjeux P.; Le Pont F.; Mollinedo S.; (1.986) Visceral Leishmaniosis in the La Paz
Departement of Bolivia; Mem Inst. Oswaldo Cruz; Rio de janeiro; Vol 81: 96.
15. Desjeux P.; Le Pont F.; Mollinedo S. (1.989); Etude epidemiologique des
Leishmanioses du Departement de La Paz Bolivie; Raports Commisions des
Communautes Europeennes; 248 252.
16. Desjeux P., S. Mollinedo, F. Le Pont, A. Paredes and G. Ugarte, (1.987); cutaneous
Leishmaniosis in Bolivia. A study of 185 human cases from Alto Beni (La Paz
Department) Isolation and isoenzyme characterization of 26 strains of Leishmania
brasiliensis brasiliensis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine
and Hygene. 81, 742-746.
(LANPE) Pgina 40 07/12/2003
17. Desjeux P.; Le Pont F.; Mollinedo S.; Tibayrenc M. (1.986); Les leishmania de
Bolivie. I. Leishmania braziliensis Vianna, 1.911 dans les departements de La Paz
et du Beni. Premiers isolements de souches dorigen humaine. Caracterisation
enzymatique. Coll. Int. CNRS/INSER; IMEEE, Montpellier , pp401-410.
18. Desjeux, P.; Aranda, E.; Aliaga, O.; Mollinedo, S.; (1.983); "Human visceral
Leishmaniosis in Bolivia; First proven autochthonous case from los Yungas"; Trans.
R. Soc. Med. Trop.Hyg.; 77 (6) p: 851-852.
19. Dostrovsky A. & Sagher F.; (1.964); The intracutaneous test in cutaneous
Leishmaniosis; Amm. Trop. Med. Parasit. 40, 265-269.
20. Furuya, M., Mimori T., Gomez E.A.L., De Coronel V.V., Kawabata, M, and
Hashiguchi Y., (1989), Epidemiological survey of Leishmaniosis using skin test and
ELISA in Ecuador. Jpn. J. Trop. Med. Hyg, 17, 331-338.
21. Garret Aillon Jorge (1.983), La espundia en Bolivia, observaciones del Dr. Manuel
Antonio Vaca Diez. Comentario Histrico. Boletin Informativo de CENETROP. IX,
1-5.
22. Gatti G.; Boggino J. & Prieto C.; (1.939); Un nouveau foyer de leishmaniose
viscerale en Amerique du Sud, Bulletin de la Societe de Pathologie Exotique, 67,
387-395.
23. Grimaldi G.; Leishmanioses tegumentareas. Aspectos Clnicos e Inmunopatolgicos;
Mem. Inst. Oswaldo cruz, Rio de janeiro, Vol 77 (2): 195-215, Abr/Jun.
24. Grimaldi, G.Jr. and McMahon-Pratt, D., (1991); Leishmaniosis and its etiologigic
agents in the new worl: and overview. In. T. sun (ed.), Progress in Clinical
parasitology, vol 2. Field and Wood medical Publishers, Inc., New York, 73-118.
25. Golvan Y.J. & Ambroise-Thomas P.; (1.984); Les Nouvelles techniques en
Parasitologie; Flammarion Medecine Sciences, France.
26. Guimaraes M.C.S.; Celeste B.J.; Franco E.L.; (1.992); Rendimiento diagnstico de
la Inmunofluorescencia y el ensayo inmunoenzimtico en sueros de pacientes con
Leishmaniosis del Noreste de Brasil; Bol. Of. Sanit. Panam. 113(4).
27. Hashigushi Y., De Coronel, V.V., and Gomez, E.A.L., (1.987), Andean
Leishmaniosis in Ecuador, Hashiguchi Y. Ed. Studies on New World Leishmaniosis
and its transmission with particular reference to Ecuador. Kochi Japan, Kyowa
printing, Res. Rep. Ser. N 1, 116-131.
28. La Fuente, C., Recacochea, M., Tybayrenc, M., Urjel, R., Darras, C., Cardozo, L.,
(1.986); Leishmaniosis en Bolivia: presencia de dos complejos en los llanos
orientales del departamento de Santa Cruz-Bolivia. Boletin cientfico del
CENETROP, Vol. XII, 1-15.
29. Le Pont F.; Mollinedo S.; Mouchet J.; Desjeux P.; (1.989); Leishmaniose en Bolivie.
IV. Le chien dans les cycles des Leishmanioses en Bolivie; Mem. Inst. Oswaldo
cruz, Rio de Janeiro, Vol 84 (3): 417-421, Jul/Sept.
30. Le Pont F.; (1.990) Les Phlbotomes et les leishmanioses en Bolivie; These de
Doctorat de lUniversit de Paris Sud.
31. Le Pont F. & Desjeux P.; (1.885); Leishmaniosis in Bolivia I: Lutzomyia longipalpis
(Lutz & Neiva, 1.912) as the vector of visceral Leishmaniosis in los Yungas;
Transactions of the Society of Tropical medecine and Hygiene 79, 227-231.
32. Le Ray, D., Bermudez H., (1.986); Leishmanioses en Bolivie. Summaries of the final
reports, Commision of the European Communites, EUR 12 143 EN,: 241- 247 .
(LANPE) Pgina 41 07/12/2003
33. Manson-Bahr, P.E.C., (1987); Diagnosis, In: W. Peters and R. Killick-Kendric (ed),
The Leishmaniosis in biology and medecine, vol 2. Clinical aspects and control.
Academic Press, Inc., New York, 709-729.
34. Marsden, P.D., (1995); Clinical presentations of Leishmania braziliensis
braziliensis, Parasitol. Today, 1, 129-133.
35. Martinez E.; Le Pont F.; Torrez M.; Telleria J.; Vargas F.; Muoz M.; De Doncker
S.; Dujardin J.C.; Dujardin J.P.; (1.998); A new focus of cutaneous Leishmaniosis
due to Leishmania amazonensis in a Sub Andean region of Bolivia; Acta Trpica
71 97-106.
36. Martinez E.; Le Pont, F.; Mollinedo S. and Cupolillo E.; (2001); A first case of
cutaneous Leishmaniosis due to leishmania (Viannia) lainsoni in Bolivia;
Transactions of the Royal society of Tropical Medecina and Hygiene 95, 375-377.
37. Minaya Gloria; (1997); Manual de Procedimientos de Laboratorio para el
Diagnstico de la Leishmaniosis; Serie de Normas Tcnicas N 13; Instituto
Nacional de Salud; Ministerio de Salud; Lima Per.
38. Mita Neida; (2001); Infecciones mixtas: Identificacin de complejos de Leishmania
sp. y clones de Trypanosoma cruzi por PCR hibridacin en pacientes y mamferos
peridomiciliares de los Yungas de La Paz; Tesis de Licenciatura; Facultad de
ciencias farmaceuticas y bioqumicas, Universidad Mayor de San Andres.
39. Molineux D.H. & Killic-Kendrick R. (1987); En: The Leishmaniases in Biology
and Medicine. Vol I. Peters W y Killic-Kendrick R (ed). Academic Press: London
Pgs 121-176.
40. Monteiro de Barroso; (1.942); Leishmaniose visceral americana: Um caso de Bolivia;
Revista Clnica de Sao Paulo ; Volumen XI, Abril, N 4; 91-99.
41. Mollinedo S.; Muoz M.; Hervas D.; Yaksic N.; Torrez M.; (1.992) Leishmaniosis
visceral y tegumentaria en nios en dos zonas endmicas de Bolivia; Parasitologa
al Da; 16: 117 120.
42. Mollinedo S; Desjeux P.; Le Pont F.; (1.985) American Leishmaniosis Shell
international petroleum Maatschappij B.V. Ocupational Health and Hygiene Digest.
23: 14-16.
43. OMS; (1.984) Les Leishmanioses; Rapport technique N 701; Geneve Suisse.
44. OMS; (1.990) Lutte contre les Leishmanioses; Rapport dun Comit OMS
dexperts; rapport technique N 793; Geneve Suisse.
45. OMS; (1992); Mtodos Bsicos de laboratorio en Parasitologa Mdica; Ginebra.
46. Palma, G. and Gutierrez, Y., (1991); Laboratory disgnosis of Leishmania.Clin. Lab.
Med., 11, 902-922.
47. Prado Barrientos L.; (1.948a); Um caso atipico de Leishmaniose cutaneo-mucosa
(Espundia). Memorias do Instituto Oswaldo Cruz; 46, 415-418 82).
48. Prado Barrientos L.; (1.948b); Un caso de leishmaniosis cutaneo-mucosa con
predominio de leishmanides cutneas. Boletin de la Agrupacin Mdica de estudios,
249-257.
49. Pessoa B. Samuel; Viana Martins Amilcar (1.982); Parasitologa Mdica; 11-
Edicao; Edit. Guanabara Kogan; Rio de Janeiro.
50. Quilici M.; Dunan S.; Ranque J.; (1.968); LImmunofluorescence dans les
Leishmanioses. Comparaison avec la Reaction de Fixation du Complement;
Medecine Tropicale Vol 28; N 1.
(LANPE) Pgina 42 07/12/2003
51. Revollo, S., Dimier-David, L., David, P., Lyevre, P., Camacho, C., Dedet, J.P.,
(1.992), Isoenzyme characterization of Leishmania braziliensis braziliensis isoletes
abtained from Bolivian and Peruvian patients, Transactions of the Royal Society of
Tropical Medecine and Hygiene 86, 388-391
52. Rioux Jean-Antoine; (1.986); Leishmania taxonomie Phylogense; Institut
mediterranen dEtudes Epidemiologiques et ecologiques; Montpellier.
53. Salinas G.; Valderrama L.; Palma G.; Montes G.; Saravia N.; (1.989); Deteccin de
amastigotas en Leishmaniosis cutnea y mucocutnea por el mtodo de la
inmunoperoxidasa, usando anticuerpo policlonal: sensibilidad y especificidad
comparadas con mtodos convencionales de diagnstico; Mem. Inst. Oswaldo Cruz,
Rio de Janeiro, Vol. 84(1) 53-60.
54. Servicio Nacional de Antioquia; (1987); Leishmaniosis, Normas Tcnicas y
Administrativas; Antioquia, Colombia.
55. Shaw J.J. & Lainson R.; (1.975); Leishmaniosis in Brazil: X. Some observations
on intradermal reactions to different Trypanosomatid antigens of patients suffering
from cutaneous and mucocutaneous Leishmaniosis; Trans. R. Soc. Med. Hyg.; Vol
69; N 3; 323-335.
56. Simpson, M.H., Mullins, J.F., and Stone, O.J., (1.968), Disseminated anergic
cutaneous Leishmaniosis and autochtonous case in Texas and the Mexican states of
Tumaulipas and Nueva Leon, Arch. Derm. 97, 301-303.
57. Thomaz Soccol Vanete; (1993); Les Leishmania du Nouveau Monde. Analyse
enzymatique. Dmarche progresive phnetique-cladistique. Telation phylognetique
avec les Leishmania de lAncien Monde; These Universite Montpellier I, Facult de
Mdecine.
58. Torrez, M., Lopez, M., Le Pont, F., Martinez, E., Muoz, M., Hervas, D., Yaksic,
N., Arevalo, J., Sossa, D., Dedet, J.P., Dujardin, J.P.(1.998), Lutzomyia nunestovari
anglesi (Diptera Psychodidae) as a probable vector of Leishmania braziliensis in the
Yungas, Bolivia. Acta Trpica 71, 311-316.
59. Valda L.; (1.980); Leishmaniosis Cutneo Difusa: Informe del segundo caso
Boliviano; Cuadernos del Hospital Vol 31, N 1.
60. Velasco J.E. (1.973); The phlebotomine sandflies of the los Yungas region of
Bolivia M.S. Thesis, Louisiana State University, Departament of Tropical Medecine
and Parasitology, 204 p.
61. Vieira, J.B., Lacerda, M.M., Mardsen, P.D., National Reporting of Leishmaniosis:
The Brazilian Experience.
62. Weigle K. A.; Valderrama L.; Arias A.L.; Santrich C.; Saravia N.; (1.991);
Leishmanine skin test standarization and evaluation of safety, dose, storage,
longevity of reaction and sensitization; Am. J. Trop. Med. Hyg. 44(3).
63. Weigle, K.a., Davalos, M., Heredia, P., Molineros, R., Saravia, N.G. and
DAlessandro, A. (1987); Diagnosis of cutaneous and mucocutaneous
Leishmaniosis in Colombia: a comparison of seven methods. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 36, 489-496.
64. Wirth, D. Rogers, W.O., Barker, R., Dourado, H., Suebseang, L. and Albuquerque,
B., (1986); Leishmaniosis and malaria: new tools for epidemiological analysis.
Science, 234, 974-979.

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ANEXO 1: REACTIVOS DE COLORACION:

Tincin Giemsa:
Solucin GIEMSA de stock o solucin madre:
- Giemsa, colorante en polvo ............. 0,75 g
- Alcohol metlico puro ...................... 65 mL
- Glicerina pura .................................. 35 mL
Se disuelve el polvo de giemsa en el alcohol y la glicerina y la solucin se la guarda
en un frasco oscuro (color mbar) con perlas de vidrio dentro, bien tapado y deber
agitarse de 6 a 10 veces al da para que se mezcle completamente hasta obtener una
mezcla homogenea; al tercer da podr usarse previa filtracin del preparado.

Solucin de Trabajo o Giemsa diluido :
- Solucin Giemsa de stock .................................. 1 mL
- Agua destilada o Buffer fosfato pH 7,2 a 7,4 ..... 9mL

De acuerdo a la cantidad de placas a procesar se sugiere preparar una cantidad de reactivo
adecuada a cada necesidad, mezclar antes de usar.

Solucin Buffer Fosfato PBS pH 7.2-7.4 ( Agua Mineral):
- Na HPO4 ..................................................... 6.0 g
- Kh2po4 ......................................................... 5.0 g

Mezclar las sales, pesar 1 g de la mezcla y distribuir en pequeos tubos o viales.
Disolver el contenido de cada uno de estos tubos en un litro de agua destilada. Este buffer
tendr un pH de 7.2 a 7.4. Debido al problema que implica la obtencin de solucin Buffer
hemos hecho experiencias con diferentes aguas minerales comerciales , teniendo buenos
resultados cuando esta tiene un pH prximo a 7,2 y 7,4, por lo que recomendamos su
utilizacin.

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ANEXO 2. MEDIOS DE CULTIVO

En nuestro recorrido a nivel nacional, hemos podido apreciar que nuestro personal del
Sistema nacional de Salud tiene notable capacidad para realizar estas pruebas, solamente le
faltaba la gua tcnica, por lo anotado describiremos en detalle las tcnicas de aislamiento
de las Leishmanias.
Para el aislamiento por cultivo de las leishmanias requerimos de 3 componentes:
SOLUCION FISIOLOGICA 0.85%: Si no tiene solucin fisiolgica, prepara tu propia
solucin
- ClNa .................................................. 0.85 g
- Agua destilada ................................... 100 g
Diluir y autoclavar.
SOLUCION STOCK DE ANTIBIOTICOS :
- Sulfato de Estreptomicina ....................... 0.5 g
- Penicilina Sdica ..................................... 0.5 g
- Agua destilada estril ............................... 10 mL
Usar 1 ml de la solucin para 100 ml de solucin salina.

MEDIO NNN:
- Bacto agar ............................................. 1.4 g
- Cloruro de sodio .................................... 0.6 g
- Agua destilada ....................................... 90 mL
- Sangre defibrinada de conejo ................. 13.5 mL
- Solucin stock de antibiticos ............... 1 mL
La sangre de conejo se obtiene por puncin cardiaca, esta se vierte en un matraz o
baln estril, el cual, contiene perlas de vidrio. Para desfibrinar la sangre se agita
suavemente con movimientos rotatorios, durante 10 minutos. Separar 15 mL en una
probeta estril.
PREPARACION :
- Diluir el agar y autoclavar a 121C por 20 minutos.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente; cuando alcance los 56C
aproximadamente, agregar los 15 mL de sangre desfibrada y 1 mL de la
solucin stock de antibiticos.
- Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mL del medio en tubos de cultivo
de 13 x 100 con tapa rosca.
- Colocar los tubos en plano inclinado y dejar al medio ambiente por 2 horas.
- Controlar si hay contaminacin bacteriana en estufa a 37C por 24 horas
- Conservar los tubos en refrigeracin (4C) hasta el momento de uso.

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