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Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Doctorado en Biotecnología
Directora:
PhD. Alia Rodriguez Villate
Codirector:
PhD. Ian R. Sanders
Línea de Investigación:
Biotecnología Agrícola
Agradecimientos
A Alia Rodríguez Villate PhD e Ian R. Sanders PhD, por la dirección del trabajo de tesis,
su apoyo y sus importantes y permanentes aportes a la investigación.
Al Dr. Ewald Sieverding por sus enseñanzas y apoyo en la clasificación taxonómica por
morfología de HFMA.
A los Drs. Maria Isabel Chacón y Juan Carlos Pérez por sus aportes y consejos a través
del comité tutorial.
Resumen
Contenido
Pág.
1. Marco conceptual 7
7. Anexos 130
Bibliografía 228
Contenido X
Lista de figuras
Página
control (H2O). Figuras a y b para el grupo de líneas parentales, c y d para el grupo C3-
Sc1, e y f para el grupo C3-Sc2. 110
Figura 22. Comparación entre las comunidades de HFMA en plantas de yuca de la variedad
MCOL2737, inoculadas con la línea parental C3 y las líneas de primera y segunda
generación, doce meses después de la inoculación. a) Comparación del efecto entre la
línea C3 y sus segregadas, b) Comparación del efecto entre la línea C3, Sc2 y las
comunidades de plantas no inoculadas (H2O). Las letras indican diferencias
significativas para un valor alfa de 0.05. 111
Figura 23. Escalamiento multidimensional no-métrico (NMDS) para el efecto del Glomygel
sobre las comunidades de HFMA , doce meses después de la inoculación. a) variedad
MCOL2737, b) Variedad CM4574-7, c) Análisis estadístico PERMANOVA. Los valores en
la tabla corresponden al valor P de las pruebas estadísticas donde un valor P>α (α
=0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre tratamientos. 113
Figura 24. Comparación de la abundancia relativa de las especies en la comunidad de
HFMA no inoculada versus las comunidades de HFMA inoculadas con Glomygel y
Filtrado en la variedad MCOL2737, 12mds. 114
Figura 25. Diferencias en las comunidades de HFMA a los 3 y 12 meses después de la
inoculación con algunas líneas de R. irregularis. a) variedad MCOL2737 –Glomygel,
b)MCOL2737 – Sc2, c) CM4574-7 – Sc2c, d)CM4574-7 – Glomygel. Barras blancas y
negras representan la proporción de cada especie a los 3 meses y 12 meses después
de la inoculación. 118
Contenido XIII
Lista de tablas
Página
Tabla 1. Asignación taxonómica de morfotipos por sus características morfológicas y por el
análisis filogenético RaxML-EPA 43
Tabla 2. Análisis estadístico para los datos de diversidad de HFMA en el suelo rizosférico, basado
en el recuento de esporas de HFMA. Diferencias significativas para valores P<0.05. 46
Tabla 3. Efecto de los tratamientos sobre las comunidades de HFMA en plantas de Manihot
esculenta Cranz bajo condiciones de campo. En la tabla se muestran los resultados del valor
P para los índices de diversidad alfa calculados. 55
Tabla 4. Líneas de Rhizophagus irregularis con genoma secuenciado organizadas por grupos
genéticos. Se indica el número de réplicas utilizadas en el secuenciamiento RAD-seq y
utilizadas para calcular el polimorfismo entre grupos. *ND= no determinado 73
Tabla 5. SNPs identificados para cada grupo genético 75
Tabla 6. Cebadores seleccionados para amplificar R. irregularis del grupo genético #6 en
muestras de raíces de yuca. Los cebadores llevan la misma nomenclatura de la región
genómica donde fueron ubicados. Ta-calc: Ta calculada. Ta-grad: Ta por gradiente de
temperatura. 76
Tabla 7. Tratamientos en el experimento #2. Tres factores fueron incluidos: tiempos de muestreo
(3 y 12 mds), variedades de planta y la inoculación con diferentes líneas de Rhizophagus
irregularis. El número dentro de cada casilla corresponde al número del tratamiento. 87
Tabla 8. Análisis estadístico para los índices de diversidad alfa, en la comunidad de HFMA
asociadas a dos variedades de yuca (MCOL2737 y CM4574-7) a los 12 meses después de la
siembra. 99
Tabla 9. Grupos de aislados de Rhizophagus irregularis según su origen, de acuerdo con la
información suministrada por el grupo de Ecología y Evolución de Organismos simbiontes
de la Universidad de Lausanne, Suiza (Comunicación personal, datos no publicados).103
Tabla 10. Análisis estadístico para el índice de Shannon agrupando tratamientos de acuerdo a la
informacíon de grupos genéticos de Rhizophagus irregularis, en las dos variedades de yuca.
XIV Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Los valores en la tabla corresponden al valor P de las pruebas estadísticas donde un valor
mayor al valor alfa (0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre tratamientos104
Tabla 11. Análisis multivariado (PERMANOVA) para medir el efecto de la variedad de la planta y
las líneas de R. irregularis inoculadas sobre las comunidades de HFMA que colonizan las
plantas de yuca, 12 meses despues de la inoculación. El asterisco muestra las diferencias
significativas (* para un α=0.01, ** para un α=0.05). 105
Tabla 12. Análisis multivariado PERMANOVA, para evaluar diferencias entre tratamientos para
cada una de las variedades de yuca. El asterisco muestra las diferencias significativas (* para
un α=0.05). 106
Tabla 13. Comparaciones uno a uno, entre comunidades de HFMA inoculadas con diferentes
líneas de Rhizophagus irregularis versus las comunidades de HFMA no inoculadas en la
variedad MCOL2737, doce meses después de la inoculación. 107
Tabla 14. Resultados del análisis PERMANOVA agrupando tratamientos por grupos genéticos,
para las comunidades de HFMA en plantas de yuca a los doce meses después de la
inoculación. Los valores en la tabla corresponden al valor P de la prueba estadística
PERMANOVA, donde un valor P >α (α =0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre
tratamientos. 109
Tabla 15. Comparación de Pearson para las variables: peso seco de la planta, porcentaje de
colonización intraradical, Riqueza de OTUs e índice de Shannon para las dos variedades de
yuca. 116
Tabla 16. Cambios en la comunidad de HFMA en el tiempo después de la inoculación con líneas
de R. irregularis. 117
XV
Lista de anexos
Anexo 1. Análisis físico-químico de los suelo del experimento No. 1 antes de la siembra. 130
Anexo 2. Diseño experimental, experimento 1. 131
Anexo 3. Proceso metodológico para el análisis filogenético. Todos los árboles se procesaron
calculando 1000 bootstrap y con el modelo de sustitución GAMMAGTR. 132
Anexo 4. Figura del árbol filogenético RAxML básico para las secuencias de HFMA blanco
utilizando las secuencias de referencia. 133
Anexo 5. Arbol filogenetico de referencia (blackbone) para el análisis EPA en HFMA. Construido
con secuencias de referencia de la región larga SSU-ITS-LSU rDNA. 135
Anexo 6. Arbol filogenético RaxML-EPA para las secuencias de HFMA utilizando la región SSU
rDNA obtenidas en este estudio. En negro las secuencias de referencia, en azul las
secuencias provenientes de morfoespecies y en rojo las secuencias provenientes de raíces.
Los números sobre las ramas representan los valores bootstrap calculados en el árbol de
referencia. Los números en parentesis corresponde al número de morfotipos identificados
para la especie. 137
Anexo 7. Esquema representativo de la región SSU rDNA en el filo Glomeromycota. Las fechas
representan los sitios de unión de los cebadores utilizados en el análisis de la diversidad de
HFMA (Van Geel et al., 2014). La tabla contiene las secuencias de los cebadores utilizados en
este estudio. 140
Anexo 8. Lista de secuencias cortas (barcodes) adicionadas al extremo 5' del cebador NS31, para
la construcción de las librerías de ADN. 141
Anexo 9. Estandarización del algoritmo DBC454 para los datos de este estudio. 142
Anexo 10. Análisis estadístico para diversidad alfa de la comunidad de HFMA en el suelo
rizosférico, basado en la información de esporas. 143
Anexo 11. Diferencias estadísticas entre especies de HFMA en el suelo rizosférico de plantas de
yuca en campo, basado en los datos de esporas. Las letras diferentes indican diferencias
significativas con un α=0.05. 144
XVI Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Anexo 12. Análisis estadístico PERMANOVA para las comunidades de HFMA inoculadas con
Glomygel ®, experimento 1. 146
Anexo 13. Análisis SIMPER para evaluar las especies que influyen en los cambios de las
comunidades inoculadas. Experimento 1. 147
Anexo 14. Selección de cebadores para la amplificación de regiones con polimorfismos (SNPs) en
cada grupo genético de R. irregularis. 148
Anexo 15. Alineamiento de secuencias amplificadas con los cebadores Scaffold1268 para el
grupo genético #6 de Rhizophagus irregularis. 160
Anexo 16. Diagrama para la obtención de líneas de R. irregularis de primera y segunda generación
en cultivo in-vitro. Imagen modificada de (Koch, 2006). 161
Anexo 17. Análisis fisico-químico para el suelo del experimento 2. 163
Anexo 18. Esquema de la distribución de los tratamientos en campo. 164
Anexo 19. Análisis estadístico para evaluar las diferencias entre las comunidades de HFMA
intraradicales en las dos variedades de yuca sin inocular (Tratamiento control-H2O).166
Anexo 20. Comparaciones entre la comunidad de HFMA presente en suelo rizosférico antes de la
siembra y en las raíces de plantas de yuca sin inocular a los 3 y 12 meses después de la
inoculación, para las dos variedades de yuca. 168
Anexo 21. Análisis multivariado para medir el efecto de la variedad y la inoculación con R.
irregularis sobre las comunidades de HFMA a los 12 meses después de la inoculación.172
Anexo 22. Diferencias en las comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis para cada una
de las variedades de yuca. 174
Anexo 23. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis
versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad MCOL2737. 176
Anexo 24. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis
versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad CM4574-7. 188
Anexo 25. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de distancia
(ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos genéticos de
aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la inoculación, para la
variedad MCOL2737 202
Anexo 26. Análisis de varianza multivariado (ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con
diferentes grupos de aislados de Rhizophaugus irregularis, en la variedad MCOL2737
incluyendo el control (plantas no inoculadas). 207
Anexo 27. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de distancia
(ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos genéticos de
XVII
Ciertos grupos de microorganismos edáficos han sido objeto de estudio, debido a que
participan en los ciclos biogeoquímicos, movilizan nutrientes y consecuentemente
favorecen la nutrición y salud de las plantas terrestres (Bloem et al., 2005). El uso de
estos microorganismos como inóculo, se ha convertido en una alternativa para
incrementar la biomasa vegetal y por lo tanto mejorar la productividad de los cultivos
agrícolas en suelos con deficiencias nutricionales (Faye et al., 2013).
En los suelos del trópico, una tercera parte ha sido clasificada como suelos ácidos con
pH menor a 4.5. Esta condición de acidez, sumada a la alta pluviosidad y la consecuente
lixiviación de cationes como Ca+2, K+ y Na+, aumentan las concentraciones de aluminio
soluble (tóxico) y disminuyen la concentración de nutrientes disponibles para la planta
(especialmente fósforo), lo cual limita la productividad de los cultivos (Koyama et al.,
1995).
En los suelos ácidos del trópico, los microorganismos movilizadores de fosfato como los
Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA), se convierten en una
alternativa biotecnológica para el sector agrícola. Estos hongos, que conforman el filo
Glomeromycota (Schüβler et al., 2001), desarrollan una red de micelio en el suelo que se
extiende más allá de la zona de depleción formada alrededor de las raíces, donde los
nutrientes poco móviles como el fósforo son rápidamente agotados. Este micelio absorbe
los fosfatos solubles en la solución del suelo, y luego son transportados y entregados a la
planta con la cual el hongo establece una simbiosis benéfica para ambos organismos
(Smith & Read, 2008).
Los HFMA son habitantes naturales del suelo y ubicuos en la mayoría de los biomas
terrestres (Brundrett, 1991; Öpik et al., 2006), establecen simbiosis con el 80% de las
plantas (~ 250.000), incluyendo la mayoría de las plantas de interés agronómico (Smith
& Read, 2008). En los sistemas agrícolas, la inoculación con especies previamente
seleccionadas de HFMA, debe realizarse cuando se buscan incrementos nutricionales en
las plantas hospederas y por lo tanto un efecto positivo en el sistema agrícola.
Para entender cada uno de estos aspectos, se debe conocer en detalle la biología de la
asociacion, la genética de estos hongos y el comportamiento de las comunidades de
HFMA.
El disturbio, definido como la suma de todas las perturbaciones por unidad de tiempo
(Miller, 1982), se ha considerado como uno de los factores que más influye sobre la
composición de las comunidades terrestres (Sousa, 1984; Molino & Sabatier, 2001).
Sin embargo, debido a que no se posee la suficiente información para predecir cuál será
el comportamiento de la comunidad local de HFMA después de la inoculación, en este
estudio se planteó una hipótesis nula y una alterna. Por lo tanto:
hongo entrega los minerales absorbidos del suelo y a cambio recibe entre el 4 y el 20%
del carbono fijado a través de la fotosíntesis (Read et al., 1998).
Los HFMA producen esporas de origen asexual, caracterizadas por contener un gran
número de glóbulos lipídicos y de núcleos. La presencia de esporas multinucleadas es
una particularidad de los HFMA, donde a la fecha, no es claro si los diferentes núcleos
son portadores de la misma información genética (homocariosis), o si contienen
información genética diferente (heterocariosis) (Pawlowska & Taylor, 2004; Rodriguez et
al., 2004; Hijri & Sanders, 2005; Wyss et al., 2016).
Si esto fuera cierto, se abre la posibilidad de manipular esta variación genética en los
HFMA, para desarrollar nuevas líneas que sean capaces de colonizar eficientemente la
rizósfera de las plantas de interés y con un óptimo efecto en la respuesta fisiológica de la
planta hospedera (Sanders, 2010).
clasificados inicialmente en el orden Glomales, dentro del filo Zygomycetes (Morton &
Benny, 1990).
En los años 90’s las herramientas moleculares para el análisis taxonómico comenzaron a
estar disponibles y ayudaron en el establecimiento de una nueva taxonomía. En
particular el análisis de secuencias de la subunidad pequeña del gen ribosomal, 18S
rDNA, ha permitido ubicar a los HFMA en una nueva clasificación: el filo Glomeromycota
(Morton & Redecker, 2001; Schüβler et al., 2001).
El uso de las herramientas moleculares permitió identificar la diversidad en los HFMA que
había sido subestimada por análisis morfológicos, es así como el género Glomus sp., fue
escindido en tres grupos: Glomus A, B y C (Schwarzott et al., 2001). Los dos primeros
grupos están englobados en el orden Glomerales, mientras que Glomus C pertenece a
los Diversisporales (Schüβler et al., 2001).
con base en la filogenia de los genes ribosomales (rDNA), están más estrechamente
relacionados a la familia Acaulosporaceae (Schwarzott et al., 2001). Un representante de
este grupo es Glomus fulvum que se caracteriza por formar grandes esporocarpos
(Redecker et al., 2007).
Las esporas presentes en la rizósfera aportan información sobre las especies que están
conformando la comunidad de HFMA (Robinson-Boyer et al., 2009). Pero se debe tener
en cuenta que las esporas son estructuras de resistencia que pueden no representar las
especies fisiológicamente activas, es decir aquellas que están estableciendo una
simbiosis con la planta (Clapp et al., 1995; Renker et al., 2005). Es por esto que la
extracción e identificación de esporas se ha considerado un análisis indirecto de la
comunidad de HFMA (Robinson-Boyer et al., 2009).
De forma complementaria, se planteó un estudio directo, identificando los hongos del filo
Glomeromycota que están colonizando las raíces de las plantas. Para identificar estos
hongos, es necesario el uso de herramientas moleculares como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), donde los productos obtenidos de la PCR son clonados y
secuenciados. Posteriormente, se realiza el análisis de los clones con el objetivo de
cuantificar e identificar las especies de HFMA que están colonizando un fragmento de
raíz. Para la evaluación de los clones, diferentes técnicas han sido empleadas:
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción -RFLP- (Helgason et al., 1998;
Mummey & Rillig, 2006; Lekberg et al., 2007), polimosfismo de conformación de cadena
simple –SSCP- (Kjøller & Rosendahl, 2000), electroforesis de gel con gradiente de
denaturación –DGGE- (de Souza et al., 2004) y secuenciación (Lekberg et al., 2012).
Capítulo 1 13
Estudios sobre las comunidades HFMA en campo fueron iniciados por Clapp y cols,
(1995) y continuados por Helgason y cols (1998; 1999; 2002), donde compararon la
diversidad en la secuencia de la subunidad pequeña de la región ribosomal rRNA de
HFMA, aislados desde un suelo arado en Yorkshire, UK. En el año 2006, Öpik y cols.,
(Öpik et al., 2006), publicaron un análisis compilado de diferentes estudios de diversidad
en HFMA realizados en diferentes ambientes, encontrando que el bosque tropical, con 18
taxones, es el hábitat con mayor número de taxones por planta hospedera.
estudios ecológicos (Öpik et al., 2006; Öpik et al., 2008). Sin embargo, tampoco amplifica
para las familias Archaeosporaceae y Paraglomeraceae, y tampoco para Glomus del
grupo B.
Otra pareja de cebadores (AML1-AML2) ha sido diseñada sobre la región SSU rDNA
donde las familias Ambisporaceae y Paraglomaceae, si logran ser amplificadas, porque
la región blanco incluye la región central más variable de este gen, lo que permite una
mayor resolución en el análisis de datos. Además el fragmento generado incluye la
región amplificada con los cebadores NS31-AM1, por lo tanto es posible el uso de bases
de datos anotadas para este filo y este gen. Otra ventaja de estos cebadores es la baja
amplificación de otros hongos que no sean HFMA (Lee et al., 2008).
Otros grupos de investigación han construido cebadores marcando la región LSU rDNA
(Kjøller & Rosendahl, 2001; Gollotte et al., 2004). Igual como ocurre con el par
AM1/NS31, estos cebadores tampoco amplifican todos los taxones dentro del filo
Glomeromycota. Redecker y cols (2000). (Redecker et al., 2000), diseñaron un set de
cebadores para el extremo 3’ de la región SSU hasta incluir la región ITS. Este proceso
permitió detectar las familias Archaeosporaceae y Paraglomeraceae. Una posterior
extensión de la región amplificada, donde se incluye el extremo 5’ de la región LSU, ha
sido posible con el uso de los cebadores SSUmCf/LSUmBr diseñados por Stockinger y
cols., con los cuales se obtiene un amplicón de 1.5 kb y cubre 240 bp de SSU, 400-526
bp de la región ITS y 800 bp de la región LSU (Stockinger et al., 2010).
Definición de filotipos
El número de taxa de HFMA por planta puede diferir entre hábitats. Se han identificado
entre 7 y 22 taxa colonizando una planta en la selva tropical (Öpik et al., 2006). Sin
embargo, la composición de la comunidad puede ser más importante que el número de
taxa per se, porque se ha observado que las diferentes familias de HFMA presentan una
Capítulo 1 17
estrategia de vida diferente que puede aportar mayor estabilidad de la comunidad frente
a cualquier disturbio (Maherali & Klironomos, 2007; Öpik et al., 2010).
Para que los cambios en las comunidades puedan ser medibles, diferentes índices de
diversidad han sido diseñados. Estos índices adaptados de la macro-ecología han sido
utilizados con éxito en la descripción de las comunidades de microorganismos.
Uno de los acercamientos estadísticos que ha sido utilizado para estimar la riqueza de
las comunidades de HFMA corresponde a la generación de curvas de rarefacción y
curvas de acumulación de especies donde se normalizan los datos para poder comparar
entre muestras y se asume la riqueza total como el número de especies que se
encontraría en un esfuerzo infinito de muestreo (Gotelli & Chao, 2013). Otra
aproximación es el uso de estimadores no paramétricos, que se utilizan cuando no se
conoce la distribución estadística de los datos o no se ajustan a ningún modelo
determinado (Chao, 1984). Entre estos, se encuentran los estimadores basados en la
incidencia de especies (Colwell & Coddington, 1994; Leitner & Turner, 2001; Chao et al.,
2005) y los métodos basados en remuestreo, como los estimadores tipo Jackknife y las
técnicas Bootstrap (Palmer, 1990). Estos métodos no paramétricos son aplicables al
18 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
2.1 Introducción
Los HFMA son un elemento fundamental en los agroecosistemas, porque colonizan las
plantas de interés agronómico mas importantes para la nutrición humana y se ha
demostrado que el uso de HFMA como inóculo (por ejemplo plantas de yuca, Manihot
esculenta Cranz), incrementa la biomasa y el rendimiento del cultivo (Sieverding &
Howeler, 1985; Ceballos et al., 2013).
La simbiosis microrrícica toma una mayor importancia si se tiene en cuenta que las
fuentes de fertilizantes fosfatados se están agotando y aproximadamente para el año
2050, se convertirán en un recurso limitante para la producción de alimentos (Gross,
2010). De esta forma, la aplicación biotecnológica de HFMA en la agricultura, se puede
considerar como una solución para contribuir a la seguridad alimentaria (Rodriguez &
Sanders, 2015), mas aún cuando hay estudios de campo que señalan que con el uso de
22 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
los HFMA se puede disminuir la cantidad de fertilizante fosfatado aplicado al cultivo sin
afectar la productividad (Ceballos et al., 2013).
A pesar de que se conoce que los HFMA conforman el 50% de la biomasa microbiana en
el suelo (Olsson, 1999) y que son organismos ubicuos en todos los biomas terrestres
(Öpik et al., 2010), los estudios de los HFMA como inóculo se han enfocado en la
respuesta de la planta, pero los eventos biológicos que ocurren en la rizósfera después
de la inoculación, han sido poco explorados.
De igual forma, el conocimiento sobre la diversidad de los HFMA en suelos ácidos del
trópico, con uso agrícola es limitado, pues se ha centrado en la descripción de las
comunidades por métodos morfológicos en el espacio extraradical, pero poco se ha
indagado sobre las comunidades intraradicales (Senés-Guerrero et al., 2014, 2015; Leon,
2015) y cómo estas se ven afectadas por la fertlilización fosfatada y la inoculación con
HFMA.
1988; Jansa et al., 2008; Pellegrino et al., 2011) es una especie resilente frente a
prácticas de manejo agronómico (Oehl et al., 2010). Además se ha demostrado que R.
irregularis aplicado como inóculo se establece exitosamente en las raíces de las plantas
inoculadas (Alkan et al., 2006; Janoušková et al., 2013; Köhl et al., 2016).
2.2 Metodología
El campo experimental utilizado, no había sido cultivado en los últimos 14 años, y era
una pastura en rastrojo. Se preparó el terreno en caballones para el cultivo de yuca. La
variedad de yuca (Manihot esculenta Crantz) MCOL2737 se seleccionó por ser una de
las variedades mas utilizadas por los agricultores de la zona.
Múltiples razones explican la razón por la que se utilizó Rhizophagus irregularis como
inóculo en este experimento: es el hongo modelo para el estudio de Glomeromycota
porque se puede cultivar in-vitro y su genoma ha sido secuenciado (Bécard & Fortin,
1988; Tisserant et al., 2013), es una especie de HFMA ampliamente distribuida, que se
encuentra en todos los biomas terrestres (Öpik et al., 2006), coloniza rápida y
eficientemente las raíces de la mayoría de las plantas (Hepper et al., 1988; Jansa et al.,
2008; Pellegrino et al., 2011) es una especie resilente frente a prácticas de manejo
agronómico (Oehl et al., 2010), se establece exitosamente en las raíces de las plantas
inoculadas (Alkan et al., 2006; Janoušková et al., 2013; Köhl et al., 2016) y es el hongo
mas comúnmente usado como biofertilizante a nivel comercial (Faye et al., 2013), El
producto comercial denominado Glomygel Hortalizas® (http://www.mycovitro.com) fue
producido en condiciones de laboratorio usando técnicas de cultivo in-vitro.
Capítulo 2 25
Los seis tratamientos se organizaron en un diseño factorial en bloques con dos factores y
parcelas subdivididas, donde la inoculación con HFMA fue el tratamiento principal y la
adición de fosfato conformaba la subparcela. El control del experimento fueron plantas no
inoculadas. Se establecieron cuatro bloques, cada uno contenía tres réplicas por
tratamiento, para un total de 12 plantas (réplicas) por tratamiento (Anexo 2).
El material vegetal para la siembra, fue seleccionado usando el tercio medio del tallo de
plantas parentales que tenían dos o tres yemas vegetativas y un grosor de 2 cm
aproximadamente. Estas estacas se sembraron con una inclinación de 30º a 20 cm de
profundidad. En el momento de la siembra los cangres se inocularon, y se realizó una
una re-inoculación a los 45 días. El fertilizante fosfatado se aplicó a los 45 días después
de la siembra. No se realizó ningun riego artificial y el manejo del cultivo fue convencional
sin la aplicación de fungicidas, debido a la ausencia de enfermedades en el cultivo.
2.2.3 Muestreo
Las muestras de suelo rizosférico (50 gramos) y raicillas de cada planta de yuca fueron
colectadas en el momento de la cosecha (Mayo del año 2012). Estas muestras fueron
transportadas dentro de las 24 horas siguientes a los laboratorios de la Facultad de
Ciencias – Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá .
Las muestras de raíces se utilizaron para análisis moleculares con el objetivo de describir
la comunidad de HFMA que se encontraba dentro de las raíces de yuca y que muy
posiblemente eran las que estaban estableciendo una relación simbiótica en el momento
del muestreo. Las raíces fueron lavadas con el fin de retirar las particulas de suelo
adheridas y luego fueron rotuladas y almacenadas a -80ºC. Para el análisis molecular,
las 12 plantas por tratamiento fueron agrupadas en 4 muestras compuestas, para tener al
final cuatro replicas por tratamiento.
Capítulo 2 27
En el análisis por morfología se tuvo en cuenta que las esporas de HFMA no representan
individuos, son unidades discretas que pueden ser asignadas a morfotipos y usadas para
cuantificar la diversidad de una comunidad de HFMA en suelo (Smith & Read, 2008). Por
lo tanto se cuantificó el número de morfotipos y la abundancia de cada morfotipo por
muestra. Estos datos se utilizaron para calcular diferentes índices de diversidad como se
describe a continuación.
Índices de diversidad
AAx100
Abundancia Relativa(AR) =
DE
28 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Los siguientes índices fueron calculados para el análisis de esporas HFMA en el suelo
rizosférico, usando como unidad de medida los morfotipos:
Si una comunidad exhibe una máxima uniformidad (E=0), no hay morfotipos dominantes.
individuos)
Análisis estadístico:
Previo a detectar diferencias significativas entre tratamientos, se comprobó que los datos
cumplieran los supuestos de igualdad de varianza y normalidad requeridos para pruebas
paramétricas.
La diferencia significativa para los datos de riqueza fue evaluada por un análisis de
varianza (ANOVA) de dos vías o Kruskall-Wallis para pruebas no-paramétricas. Las
Capítulo 2 29
Debido a que el suelo que se utiliza para el montaje del cultivo trampa, debe tener las
condiciones físico-químicas similares al suelo problema, se transportó suelo desde el
campus experimental Utopía en Yopal, Casanare.
Se utilizaron macetas de 300 g para colocar una mezcla de suelo:arena (1:1) esterilizada
por calor (121ºC por 40 minutos). Sobre éstas se colocaron 200 g del suelo problema y
se sembraron de dos a tres plántulas de A. porrum previamente germinadas en semillero.
Las plántulas fueron regadas con 200 ml de agua cada dos o tres días. Transcurridos dos
30 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Entre 2 a 5 esporas de cada morfotipo, fueron procesadas: lavado tres veces por pipeteo
con agua destilada desionizada estéril (H2O-dde), para eliminar partículas que estuvieran
adheridas a la pared de la espora. El protocolo de extracción de ADN de esporas de
HFMA, se estandarizó adaptado de Sanders y cols., (1995), sin la necesidad de
sonicación ni el uso del Chelex®. Brevemente, las esporas se suspendieron en 20 µl de
H2O-dde, se colocaron en tubos de polipropileno de 0,2 ml y se mantuvieron en hielo. Las
esporas fueron presionadas con mini pistilos estériles (Eppendorf®) hasta romperlas y
liberar su contenido; 2µl de esta suspensión fueron colocados como templete
directamente en la reacción de PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).
Las secuencias fueron filtradas por calidad del electroferograma. También se eliminaron
las secuencias que, por similitud con secuencias en las bases de datos (BLASTn), no
correspondían a Glomeromycota. Las secuencias filtradas fueron utilizadas para el
análisis filogenético con el fin de realizar una asignación taxonómica apropiada para cada
morfotipo y comparar con los resultados del estudio morfológico.
Análisis filogenético
Secuencias del gen ribosomal del filo Glomeromycota (1.5 kb, SSU-ITS-LSU),
disponibles online (http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/) y publicadas por Krüger
y colaboradores (2012), representan la taxonomía mas reciente para este filo y fueron
utilizadas como referencia con el objetivo de determinar la posición filogenética de las
secuencias SSU rDNA obtenidas en este estudio.
Para todos los análisis filogenéticos se calcularon 1000 bootstrap y se utilizó el modelo
GTR+GAMMA que se ha demostrado se ajusta para esta region genómica (Krüger et al.,
2012). En la estrategia RAxML-básico, un total de 1077 secuencias (incluídas las
secuencias de referencia, secuencias HFMA provenientes de esporas y secuencias
HFMA provenientes de raíces) fueron alineadas en un mismo archivo y procesadas para
el análisis filogenético. Este proceso requirió un tiempo computacional mayor y se obtuvo
un soporte de bootstrap menor a nivel de familias taxonómicas comparado con la
estrategia RAxML-EPA. Además separó secuencias de referencia con un bootstrap de
100, indicando que son secuencias diferentes, cuando por conocimiento previo
pertenecen a la misma especie (Por ejemplo Funneliformis sp). Algunas secuencias de
esporas fueron ubicadas en el género Scutellospora, resultado no era concordante con lo
observado en la morfología (Anexo 4).
para nuevas ramas del árbol. (Carolina Senes, comunicación personal). Se identificaron
especies. Se identificó la especie a la cual pertenecía cada secuencia blanco y se
asignaron especies denominadas “putativas” para los nuevos clados en el árbol.
La extracción de ADN de raíces de yuca se realizó siguiendo el protocolo del kit Power
Soil® (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), utilizando 100 mg del material vegetal
Capítulo 2 35
que fue previamente lavado para eliminar partículas de suelo y se almacenó a -80ºC
hasta su procesamiento. Las raíces colocadas en un tubo plástico de 1.5 ml fueron
trituradas manualmente utilizando nitrógeno líquido y pistilos de plástico pequeños
estériles. La eficiencia de la extracción se evaluó por espectrofotometría (NanoDrop®
1000 Thermo Scientific) y se seleccionaron muestras con >10 ng/µL. Para aumentar el
éxito de la amplificación, el ADN fue utilizado el mismo día de la extracción. Se guardaron
alícuotas de ADN a -20ºC.
Posteriormente, para todas las muestras de ADN de raíz, los productos de PCR de la
primera reacción fueron utilizados en una segunda amplificación con la pareja de
cebadores AM1-NS31*, donde el cebador NS31* tenía una secuencia de 5 nucleótidos
(nt) adicionales, que se añadieron para ser utilizados como código de identificación o
“barcode” (Anexo 8). Los “barcodes” fueron generados usando el programa “Barcode
36 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Generator”, http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/Barcode_generator)
(Luca Comai & Tyson Howell), utilizando los siguientes parámetros: longitud del barcode
5 nt, mínima distancia genética entre barcodes 2 nt, contenido de GC entre 0 y 50%.
Para esta segunda amplificación se utilizaron las mismas condiciones de PCR descritas
previamente. Los productos de PCR se separaron por electroforesis de agarosa 1.0%
(p/v) con tinción SYBR® safe (ThermoFisher Scientific). Las bandas de 550 bp fueron
eluídas usando el kit de purificación QIAquick® Gel Extraction® kit (Qiagen). La cantidad
de ADN purificado se evaluó en gel de electroforesis, para asegurar la presencia del
amplicón.
obtenido, que debía corresponder a 670 nt (550 bp del fragmento de PCR, más 120 bp
de los adaptadores).
Los resultados del secuenciamiento fueron almacenados en la pagina web del centro de
tecnologías genómicas de la Universidad de Lausanne (Lausanne Genomic Technologies
Facility – LGTF) y descargados en el servidor “vital-it”( http://www.vital-it.ch) del Instituto
Suizo de Bioinformática (Swiss Institute of Bioinformatics - SIB), plataforma en la cual se
realizó todo el proceso de análisis bioinformático.
Para la delimitación de OTUs (clustering) se utilizó el programa DBC 454 (Pagni et al.,
2013), diseñado por el Instituto Suizo de Bioinformática para el análisis de comunidades
de hongos en muestras ambientales (Pellissier et al., 2013). La estandarización de este
proceso, se realizó con el fin de calcular el valor ideal para cada uno de los parámetros
exigidos por el programa, que son intrínsecos para cada grupo de datos (Anexo 9). En
este estudio, se utilizó un profuso número de secuencias de hongos SSU rDNA, que
fueron obtenidas por la amplificación de diferentes muestras de raíces de plantas de yuca
38 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Como resultado final del análisis bioinformático se obtuvieron los siguientes productos: (i)
la tabla de abundancias usada en los análisis estadísticos para determinar la diversidad
alfa y beta; y (ii) las secuencias consenso utilizadas para identificar cuáles OTUs
pertenecían al filo Glomeromycota y para el análisis filogenético.
Capítulo 2 39
Para confirmar que las secuencias consenso de cada OTU correspondían al filo
Glomeromycota, éstas se evaluaron en la herramienta BLASTn del NCBI para aislar las
secuencias que pertencen a secuencias de plantas, otros hongos uo animales del suelo.
d) Análisis filogenético
Las secuencias consenso de cada OTU, fueron alineadas con las secuencias de los
morfotipos con el fin de estimar la posición filogenética utilizando la estrategia RAxML-
EPA. El proceso se realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (numeral
2.2.4, Anexo 3)
e) Índices de diversidad
Para calcular los índices de diversidad se utilizaron dos bases de datos. La primera fue la
tabla de abundancia relativa de cada OTU en cada muestra. En la segunda base de
datos, siguiendo los resultados el análisis filogenético RaxML-EPA, los OTUs fueron
agrupados en especies, entonces los datos de abundancia relativa de OTUs de la misma
especie fueron sumados.
1977) aplicando la función “diversity()” en el paquete “Vegan” (Oksanen et al., 2015). del
programa estadístico R version 2.15.0 (R Development Core Team, 2012).
En estas ecuaciones, “s” es el número total de OTUs o especies y “Pi” (la abundancia
relativa de cada OTU o especie) es medida como: “Pi=ni/N”, donde ni representa el
número de secuencias que representan un OTU y N el número total de secuencias que
representan la comunidad HFMA. La uniformidad de especies (“evenness” en ingles), fue
estimada utilizando la ecuación E=H/logS (Pielou, 1977), donde H es el valor para el
índice de Shannon.
f) Análisis estadístico
Para evaluar las diferencias estadísticas entre los índices de diversidad alfa causadas
por la inoculación con R. irregularis y la fertilización fosfatada, se realizaron análisis de
varianza (ANOVA) de dos vías utilizando el paquete ‘stat’. Se realizó prueba de Tukey
para encontrar diferencias entre medias.
esto se siguió la metodología propuesta por Bainard y col (2014) donde el número de
secuencias de un OTU en una muestra se dividió en el número total de secuencias para
la misma muestra.
2.3 Resultados
El suelo rizosférico recolectado de cada planta de yuca, fue utilizado para la identificación
taxonómica de los morfotipos que conformaban la comunidad de HFMA y para evaluar la
42 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Para algunos morfotipos no se logró obtener una secuencia de ADN (Tabla 1), debido a
su baja frecuencia en el suelo y/o no amplificaron, se aislaron esporas viejas o
parasitadas que no eran apropiadas para el estudio genético, no lograron clonarse o
dieron un resultado en la secuenciación que no correspondía a Glomeromycota.
Capítulo 2 43
Los análisis estadísticos mostraron que la densidad de esporas de HFMA fue la variable
mas afectada por la interacción de los dos factores (Tabla 2, Anexo 10). En este estudio,
factores como la inoculación y la aplicación de fertilizante fosfatado generan una
disminución de aproximadamente el 50% en la esporulación de especies de HFMA, en el
suelo rizosférico de plantas de yuca en campo (Figura 3).
*Las letras sobre las barras muestran las diferencias encontradas para cada género, según el factor responsable de estas
diferencias. Entonces para Acaulospora sp fue la inoculación y para los demás géneros, excepto Rhizophagus sp, fueron
las dosis de fertilizante fosfatado.
Figura 5. Curva de rarefacción para todas las secuencias SSU rDNA obtenidas en este
estudio por medio de secuenciación Illumina MiSeq® para el filo Glomeromycota.
48 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Un análisis filogenético inicial, alineando todas las secuencias OTUs-HFMA, sin el uso de
secuencias de referencia (Anexo 3) mostró la agrupación de los OTUs a nivel de familia.
Utilizando la información generada en el árbol filogenético RAxML-EPA, dentro del
género Rhizophagus solo la especie R. irregularis pudo identificarse claramente. Las
demás especies en el género Rhizophagus quedaron sin clasificación, sin embargo la
estrategia metodológica utilizada permitió separar especies putativas dentro del género,
denominadas Rhizophagus sp1 hasta Rhizophagus sp7 (Figura 7). Dos OTUs
Capítulo 2 49
0.23
0.3 consensus_cluster118
0.65 consensus_cluster68
0.84 consensus_cluster109
0.41
consensus_cluster100
consensus_cluster110
0.84
0.68
0.5
consensus_cluster112
consensus_cluster67
0.23 consensus_cluster97
0.32 consensus_cluster130
consensus_cluster34
0.16 consensus_cluster41
0.32 0.95 consensus_cluster39
0.48
consensus_cluster40
0.09 consensus_cluster64
consensus_cluster42
0.78
consensus_cluster38
0.61 consensus_cluster32
0.35
consensus_cluster92
0.16 consensus_cluster43
0.1 0.39 consensus_cluster123
0.55 consensus_cluster189
0.85
0.56
consensus_cluster133
consensus_cluster167
0.88
consensus_cluster180
consensus_cluster69
0 0.95 consensus_cluster70
0.85 consensus_cluster46
0.31 consensus_cluster45
0.28
consensus_cluster44
consensus_cluster47
0 0.22 consensus_cluster173
1
consensus_cluster129
0.6 consensus_cluster134
0.8
0.54
consensus_cluster29
consensus_cluster31
0.27 consensus_cluster87
0.38 consensus_cluster195
0.38
0.49
consensus_cluster175
consensus_cluster145
consensus_cluster171
0.86 consensus_cluster160
0.17 0.47
0.49
consensus_cluster24
0.13 0.87
consensus_cluster26
consensus_cluster27
consensus_cluster33
0.52
consensus_cluster182
consensus_cluster192
0.43
consensus_cluster194
0.15 0.45 consensus_cluster66
0.94 consensus_cluster81
consensus_cluster65
0.38 0.21
0.83
consensus_cluster128
consensus_cluster28
0.25 consensus_cluster37
1 0.43
0.99
consensus_cluster117
consensus_cluster35
0.49 consensus_cluster36
consensus_cluster228
0.91
consensus_cluster217
consensus_cluster209
consensus_cluster210
0.3
0.75 0.43 consensus_cluster22
0.93 consensus_cluster63
0.9 consensus_cluster30
consensus_cluster23
consensus_cluster193
0.67
1
0.44 consensus_cluster119
0.98 consensus_cluster121
0.54
consensus_cluster140
consensus_cluster141
0.85 consensus_cluster120
0.36 consensus_cluster116
0.82
0.78
consensus_cluster101
consensus_cluster21
1
consensus_cluster25
consensus_cluster169
consensus_cluster170
gi_Schizosaccharomyces_pombe
Los colores en la Figura 6 indicaron la familia a la cual pertenecen las secuencias: azul
para Glomeraceae, verde para Claroideoglomeraceae, amarillo para Acaulosporeaceae,
rosado para Gigasporaceae).
50 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Rhizophagus
irregularis
Rhizophagus sp7
Rhizophagus sp6
Rhizophagus sp1
Rhizophagus sp5
Capítulo 2 51
Rhizophagus sp4
Rhizophagus sp3
Glomus sp
Rhizophagus sp2
Claroideoglomus sp
Acaulospora sp2
Acaulospora sp1
Acaulospora sp3
52 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Scutellospora
cerradensis
Capítulo 2 53
Con los datos agrupados a nivel de especie, el índice de Shannon no mostró diferencias
debidas a la inoculación. Los diferentes niveles de fertilizante fosfatado no afectaron la
diversidad de las comunidades intraradicales de HFMA (Tabla 3).
Interacción Fertilizante
ANÁLISIS POR OTUs Inoculación
(Fertilizante*Inoculación) fosfatado
Indice de Shannon 0.618 0.167 *0.014
Uniformidad 0.786 0.050 *0.001
Riqueza 0.455 0.253 *0.010
ANÁLISIS POR Interacción Fertilizante
Inoculación
ESPECIES (Fertilizante*Inoculación) fosfatado
Indice de Shannon 0.190 0.243 0.119
Uniformidad 0.524 0.834 *0.038
Riqueza 0.225 0.070 *0.046
Utiizando los datos de especies, se realizó el análisis SIMPER para identificar cuales
especies estaban generando las diferencias en el análisis multivariado. Se encontró que
los cambios significativos en la abundancia relativa de Rhizophagus sp1, Rhizophagus
sp4, Rhizophagus sp 6 y Acaulospora sp3, aportan el 79% de los cambios de la
comunidad de HFMA (Figura 10, Anexo 13).
Figura 10. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de plantas
de yuca. Solo se incluyeron especies con frecuencia promedio mayor al 1%. Los
porcentajes indican la influencia de cada especie sobre la diferencia entre comunidades
de HFMA inoculadas (AMF+) y no inoculadas (AMF-) con una línea comercial de R.
irregularis.
2.4 Discusión
Este es el primer estudio en donde se utiliza metagenómica para evaluar los cambios que
pueden ocurrir en la estructura de la comunidad de HFMA causados por la inoculación
con un hongo alóctono (Rhizophagus irregularis, contenido como línea comercial en el
producto utilizado), en plantas de interés agronómico y en condiciones de campo. La
descripción de la diversidad también se utilizó para evaluar el efecto de otra práctica
agronómica tradicional como es la fertilización fosfatada.
Los métodos utilizados en este estudio presentan diversas ventajas en comparasión con
los estudios publicados a la fecha que describen la diversidad de HFMA (Öpik et al.,
2006; Bainard et al., 2014; Colombo et al., 2014; Davison et al., 2015). En primer lugar,
para la comunidad intraradical se realizó secuenciamiento masivo utilizando Illumina
MiSeq®, que puede amplificar regiones de ADN de hasta 600 bp y producir un total de
30 millones de secuencias, mientras que para la tecnología 454-GLX, utilizada en la
mayoria de estudios a la fecha, se amplifican secuencias de la misma longitud pero con
una menor profundidad de secuenciamiento, máximo 1.5 millones de secuencias en cada
corrida (Lindahl et al., 2013). Un mayor número de secuencias obtenidas con el uso de
Illlumina MiSeq®, se traduce en un mayor esfuerzo de muestreo y en el análisis de un
58 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
En tercer lugar, el uso de la región genómica SSU rDNA es una ventaja en estudios de
diversidad del filo Glomeromycota, porque la base de datos existente para esta región es
extensa y permite un primer acercamiento a la identificación taxómica por medio de la
similitud de las secuencias, donde un valor del 97% de similitud es aceptable para incluir
secuencias en este filo, lo que no sucede con otras regiones como por ejemplo con LSU
rDNA (Lee et al., 2008). Sin embargo, se debe tomar en cuenta que la región SSU rDNA
también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo: subestima la diversidad del filo
Glomeromycota porque no amplifica linages basales (Lumini et al., 2010), puede
amplificar al mismo tiempo ADN de plantas (Alguacil et al., 2011) y hongos de otros filo
(Lee et al., 2008). Las dos últimas limitaciones fueron resueltas en el análisis
bioinformático donde secuencias de plantas u otros organismos diferentes a HFMA
fueron eliminadas. La primera continua siendo una limitación sin superar, inclusive con
las herramientas metodológicas actuales y es una limitante que enfrentan actualmente,
todos los grupos de investigación dedicados al análisis de la diversidad de los
Glomeromycota.
Finalmente, cuando se amplifica la región SSU rDNA para los morfotipos encontrados en
el suelo rizosférico de plantas de yuca, y tambien se utiliza la misma región para describir
la comunidad intraradical en la planta hospedera, es posible identificar cuales
morfoespecies lograron establecer simbiosis. En teoría, esta estrategia tambien favorece
la asignación taxonómica de secuencias que no han sido anotadas en las bases de datos
(Figura 7).
Los resultados obtenidos en este estudio aportan información para entender la dinámica
de las comunidades de HFMA despues de la inoculación con R. irregularis, sin embargo
no son extrapolables a ningún otro estudio, debido a que las condiciones del suelo, el
inóculo o la planta pueden afectar la respuesta. Sin embargo, como sugieren (Rodriguez
& Sanders, 2014), se deben realizar estudios donde se incluyan diferentes tipos de líneas
de R. irregularis, diferentes tipos de suelo y variedades de plantas.
En este estudio se observó una comunidad de HFMA resilente al disturbio causado por la
adición del fertilizante fosfatado (Tabla 3). La mayoría de los estudios donde se involucra
la adición de fosfatos en el suelo, demuestran que al aumentar las concentraciones de P
en la rizósfera se genera una disminución en la riqueza intraradical de especies de HFMA
(Alguacil et al., 2010; Camenzind et al., 2014). Este cambio en la diversidad es explicado
posiblemente porque al incrementar los nutrientes disponibles en el suelo para la planta,
esta reduce el volumen de exudados carbonatados, por lo tanto se limita el crecimiento
de los HFMA (Johnson, 2010; Olsson et al., 2010). En teoría, cuando se disminuye la
cantidad de carbono entregado por la planta, entonces las especies con una mayor
habilidad de competencia, serán las que finalmente permanezcan asociadas (Hepper et
al., 1988; Johnson, 1993).
Aún así, en este estudio la fertilización fosfatada causó diferencias entre tratamientos,
afectando la la densidad total de esporas de HFMA. Se encontró un mayor número de
esporas en los suelos donde no se adicionó fertilizante fosfatado. Resultados similares
fueron obtenidos por Toro (1984), quien utilizando la misma metodología de el presente
estudio (Recuento de esporas de HFMA en suelo rizosférico), analizó el suelo rizosférico
de yuca en la región del Valle del Cauca, Colombia y observó diferencias significativas
en la densidad de esporas, causada por la aplicación de fertilizante fosfatado.
de un 80% por esporas de Acaulospora sp. De forma contrastante, en este estudio, las
esporas de Acaulospora sp representaron solamente el 3% de la comunidad.
Lo anterior puede explicarse ya sea porque no todos los propágulos de HFMA están
activos al momento del muestreo y/o durante un ciclo de observación, por las diversas
estrategias de vida de los HFMA (Sýkorová et al., 2007), la habilidad de habitar los
espacios en el suelo (suelo y raíces) y acumular biomasa intra o extraradicalmente (Hart
& Reader, 2002).
Por ejemplo se ha encontrado que las especies de Glomus del grupo A, al cual pertenece
Rhizophagus sp presente en la comunidad intraradical, tienen como propagulos infectivos
esporas, hifas en el suelo o raíces colonizadas, mientras que otros géneros como
Acaulospora, Scutellospora y Gigaspora necesitan de la germinación de una espora para
colonizar la raíz (Gazey et al., 1993; Brundrett et al., 1999).
66 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Lo anterior se podría explicar por procesos de selección dirigidos por alguno de los dos
simbiontes (planta u hongo). También se ha reportado que existen procesos de selección
dirigidos por alguno de los dos simbiontes (planta u hongo). Estos procesos de selección
no han sido descritos completamente para la simbiosis micorrícica. Una interacción
especie-específica se ha descartado, sin embargo se sugiere que la selectividad del
simbionte puede ocurrir a nivel de grupos ecológicos, por especies generalistas que se
asocian con un gran número de organismos o por especialistas que se asocian con un
número selecto de organismos (Davison et al., 2011; Öpik Maarja & Moora, 2012). En
este caso, la planta de yuca se pudo comportar como especialista que se asocia con un
número selecto de géneros. Se ha reportado que la planta selecciona especies de HFMA
que le generan un mayor beneficio, generalmente nutricional, durante su interaccion
(Vandenkoornhuyse et al., 2003; Veresoglou & Rillig, 2014).
2.5 Conclusiones
Adicionalmente, los resultados de este estudios demuestran que no existe una relación
directa entre las morfoespecies mas abundantes en la rizósfera y la colonización
intraradical.
Rhizophagus sp establece una asociación simbiótica con la planta de yuca y ocupa mas
del 60 % de la comunidad intraradical. Los resultados mostrados en este experimento
solo serían aplicables a la línea comercial de R. irregularis utilizada y no se pueden
extrapolar y afirmar que todos los aislados de esta especie de hongo tendrán el mismo
efecto sobre cultivos de yuca en campo. Rodriguez & Sanders (2014) sugieren que para
comprender un poco más sobre la ecología de las comunidades de HFMA, se deberían
realizar estudios a gran escala que incluyan diferentes tipos de suelo, aislados
geneticamente diferentes y diferentes hospederos.
Diferentes OTUs reportados, fueron clasificados a nivel de género como Rhizophagus sp,
pero no se pudieron clasificar a nivel de especie debido a la alta diversidad que presenta
este género y es una evidencia de que la diversidad en este género no ha sido
completamente descrita.
Debido a que los experimentos en campo pueden tener una alta variabilidad, se sugiere
que repeticiones biológicas de este experimento sean realizadas con el fin de observar la
reproducibiliadd de los cambios reportados.
3. Diseñar una estrategia metodológica para
evaluar la diversidad poblacional del hongo
Rhizophagus irregularis en simbiosis con
plantas de yuca en campo
3.1 Introducción
Algunos estudios han demostrado que R. irregularis es una especie ubicua en los suelos
agrícolas (Davison et al., 2015) y que la población de R. irregularis tiene una alta
variabilidad genética (Börstler et al., 2008, 2010; Croll et al., 2008b; Wyss et al., 2016).
Una población local de R. irregularis esta conformada por un número indeterminado de
individuos. En este documento, se denominan líneas o aislados de R. irregularis cuando
una espora ha sido recuperada del suelo y a partir de esta, se han obtenido generaciones
del hongo a partir de una “unica espora” mediante la técnica de cultivo in-vitro (Bécard &
Fortin, 1988). Por lo tanto, para las líneas de R. irregularis utilizadas en este estudio, se
conoce información sobre su biología y genética (Koch et al., 2006; Croll et al., 2008b;
Croll & Sanders, 2009; Wyss et al., 2016).
70 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Sin embargo, a la fecha no se tiene información sobre las diferencias genéticas entre
individuos de una población de R. irregularis en un suelo agrícola del trópico. Tampoco
se conoce si las líneas de R. irregularis utilizadas como inóculo tienen una información
genética diferente a la población ya establecida en el suelo.
Para resolver esta pregunta de investigacion, el objetivo de este capítulo fue plantear una
estrategia metodológica que permita describir la población local de R. irregularis en un
suelo agrícola. La información genética de diferentes líneas de R. irregularis aisladas de
diferentes regiones alrededor del mundo, fue utilizada como una base de datos, para
identificar regiones polimórficas que permitieran la clasificación de grupos genéticos
(aislados que comparten información genética). Para cada grupo genético se identificaron
SNPs, inserciones y deleciones con el fin de generar marcadores moleculares que
permitan detectar la presencia o ausencia de un grupo genético en una población de R.
irregularis.
Capítulo 3 71
3.2 Metodología
Los amplicones fueron purificados utilizando el kit comercial (The Wizard® SV Gel y PCR
Clean-Up System, Promega) y enviados a secuenciación por Sanger en Macrogen Inc
(Corea). Las secuencias fueron alineadas en el programa MEGA6 (Tamura et al., 2013) y
comparadas contra la secuencia del genoma de referencia (R. irregularis DAOM197198)
para comprobar la presencia del polimorfismo en las muestras
3.3 Resultados
Para cada SNP se obtuvieron entre 1 y 3 pares de cebadores, los cuales fueron
descartados cuando no cumplían con las características deseadas (Tm, %CG, formación
de dímeros y/o amplificación en otras partes del genoma de R. irregularis u otros
organismos). Para algunos SNPs se eliminaron todos los cebadores con lo cual se
eliminaba tambien la posibilidad de usar ese SNP en la caracterización de la población
de R. irregularis.
Para el grupo 5, que estaba compuesto por un mayor número de aislados comparado
con los otros grupos, se seleccionaron 4 SNPs. Mientras que en otros grupos con 4 y 5
aislados, como es el caso de los grupos 1, 2 y 3, se seleccionaron entre 14 y 15
polimorfismos (Tabla 4 y 5).
Después de filtrar los cebadores de acuerdo con las características requeridas, se redujo
el número de potenciales SNPs en aproximadamente el 50% (Tabla 5, Anexo 9).
Número inicial de
Grupo genético SNPs eliminados SNPs finales*
SNPs identificados
1 14 7 7
2 14 7 8
3 15 6 9
4 - - -
5 4 1 3
6 4 2 2
Para el grupo 5 se identificó un subgrupo que incluye los aislados C1, C2, C5 y FL707B,
que fue denominado grupo 6. Independientemente de los SNPs identificados para el
grupo 5, se identificaron cuatro SNPs para el grupo 6 y se diseñaron cebadores que
fueron filtrados bajo los parámetros mencionados anteriormente. Dos parejas de
cebadores fueron seleccionadas (Tabla 6, Anexo 9) y se utilizaron para evaluar la
presencia de R. irregularis del grupo genético 6, en las raíces de yuca de campo.
76 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Figura 11. Polimorfismo de un solo nucleótido en el aislado del grupo genético #6 (R.
irregularis C2) ubicado en el Scaffold23.
3.4 Discusión
Estudios de la diversidad poblacional en los hongos del filo Glomeromycota han sido
limitados por tres factores. Primero, la incapacidad de distinguir aislados de la misma
especie con base en las características morfológicas, por lo tanto el estudio poblacional
en los HFMA se ha enfocado en el desarrollo de herramientas moleculares que permitan
medir la variabilidad genética. En segundo lugar, la dificultad de cultivar los HFMA en
sistemas eficientes (por ejemplo sistemas in-vitro) y tener suficiente biomasa del hongo
para el aislamiento de ADN, sin extraer al mismo tiempo el ADN de la planta. Este
problema fue solucionado solamente hasta el año 1996, donde St Arnaud y
colaboradores utilizaron una caja de petri con dos compartimentos para separar la
biomasa del hongo de las raíces transformadas. Una vez se logró estandarizar el cultivo
in-vitro se pudo obtener suficiente ADN para el secuenciamiento del genoma de
referencia (Tisserant et al., 2013).
En tercer lugar, la falta de conocimiento sobre la biología y genética del hongo. En el año
2015 solo se había secuenciado el genoma de un aislado de R. irregularis, conocido
como DAOM 197198 (Tisserant et al., 2013; Lin et al., 2014). Recientemente, el grupo del
profesor Sanders en la Universidad de Lausanne publicó el genoma de diescinueve
aislados de R. irregularis secuenciados con RAD-seq (Wyss et al., 2016), una técnica
Capítulo 3 79
que amplifica regiones del genoma con alta profundidad (más de 50x) lo que favorece la
confiabilidad en los polimorfismos encontrados.
Por otra parte, algunas regiones del genoma se han utilizado para diferenciar individuos
de R. irregularis. Por ejemplo, la región mitocontrial ribosomal mtLSU rDNA se puede
usar para diferenciar multiples cepas de R. irregularis (Börstler et al., 2010; Sýkorová et
al., 2012). Otras regiones del genoma mitocondrial tambien han sido utilizadas para
describir la diversidad poblacional de R. irregularis. Por ejemplo, Croll y colaboradores
(2008) evaluaron la diferencia genética de la población de R. irregularis, utilizando 48
aislados y los intrones 1 y 2 de la region mtLSU, donde se clasificó la población de R.
irregularis en 3 grupos genéticos, lo cual parece subestimar la variabilidad en esta
especie.
Otra estrategia para describir la población de R. irregularis puede ser el uso de la región
completa del operon rDNA de 1.5 kb de longitud (Krüger et al., 2012; Schlaeppi et al.,
2016) para diferenciar aislados, y con el uso de nuevas técnicas de secuenciamiento
masivo como el secuenciamiento de una molécula simple en tiempo real (single molecule
real-time, SMRT) de la compañía Pacific Biosciences, se pueden amplificar fragmentos
largos de hasta 20 kb (Carneiro et al., 2012). Esto permitiría el analisis no solo de la
población de R. irregularis sino tambien de la comunidad de HFMA.
80 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
3.5 Conclusiones
Los SNPs identificados en el genoma de R. irregularis podrán ser utilizados para describir
la diversidad poblacional de esta especie en suelos agrícolas y también para evaluar las
diferencias alélicas entre los aislados inoculados y los aislados locales.
Estudios posteriores deben establecer el número de SNPs que deben ser confirmados
para clasificar los aislados en los grupos genéticos.
4. Evaluar el efecto de diferentes líneas de
Rhizophagus irregularis introducidas como
inóculo sobre la comunidad de HFMA
asociadas a plantas de yuca en campo.
4.1 Introducción
Diversas investigaciones han reportado que existe una alta variabilidad genética entre los
diferentes aislados de la especie R. irregularis (Koch et al., 2004), causada posiblemente
por fenómenos de segregación y anastomosis (Croll et al., 2009; Angelard et al., 2010).
Estos mecanismos se han utilizado en el grupo de investigación del Profesor Ian Sanders
82 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
(Universidad de Lausanne, Suiza), para generar nuevas líneas de R. irregularis que son
genéticamente diferentes de sus parentales. Inicialmente, tres líneas fueron aisladas de
suelos de praderas en Tanikon, Suiza (Koch et al., 2004), introducidas en el sistema in-
vitro, donde raíces transformadas de zanahoria fueron utilizadas como hospedero
(Bécard & Fortin, 1988). Estas tres líneas (tres aislados diferentes), conocidas como
“líneas parentales” fueron utilizadas en experimentos in-vitro donde el proceso de
anastomosis (fusión de hifas) fue favorecido para producir nuevas esporas (Croll et al.,
2008a) que serán denominadas en este documento como “líneas de primera generación”.
Cuando una espora de una línea de primera generación fue colocada en un nuevo medio
de cultivo in-vitro, se produjeron nuevas esporas por medio de segregación (Croll et al.,
2010 las identifica como líneas segregadas), de esta forma se generaron lo que se
denominaran en este documento como “líneas de segunda generación” (Anexo 16). En
ambos casos los cultivos in vitro fueron iniciados con una única espora cada vez y por lo
tanto se conocen como “single spore culture” de primera o de segunda generación. A
pesar que originalmente se habían establecido estas líneas genéticas sobre la base de
que existían procesos de cruce y segregación, recientes estudios llevados a cabo por el
grupo del profesor Sanders han demostrado que no es posible determinar la existencia
de líneas cruzadas por cuanto no hay un aporte en proporción adecuada, por parte de
ambos parentales (Estudios no publicados, comunicación personal Ian Sanders).
Una vez detectadas estas diferencias funcionales, es importante analizar el efecto que
puede tener la inoculación de las líneas de R. irregularis sobre la comunidad de HFMA
local, porque es posible que: i) también puedan generar cambios medibles en la
diversidad de la comunidad local de HFMA, y que ii) las líneas que son genéticamente
relacionadas, por ejemplo la línea de primera generación y sus líneas de segunda
generacion, pueden tener el mismo efecto sobre las comunidades locales de HFMA.
4.2 Metodología
Quince líneas de Rhizophagus irregularis utilizadas para inocular las plantas de yuca en
el experimento en campo, fueron suministradas por el grupo de Ecología y Evolución de
Organismos simbiontes de la Universidad de Lausanne en Suiza. Entre estas líneas se
encontraban líneas parentales, de primera y segunda generación (Anexo 16).
Capítulo 4 85
Con todas las líneas de R. irregularis en cultivo in-vitro, se realizó una formulación
comercial, de acuerdo al procedimiento establecido en la empresa Mycovitro, España
(Cano & Bago, 2007. Patente CSIC WO/2007/014974: 343425), donde los propágulos
fueron mantenidos en una suspensión gelatinosa. Se incluyó una línea de R. irregularis
adicional que correspondió a la línea comercial “Glomygel”, producida por la compañía
Mycovitro®, donde los progágulos de R. irregularis tambien se encuentran suspendidos
en el mismo gel.
Los componentes de este gel no se conocen debido a que esta información se encuentra
protegida por la patente en mención. Con la intención de utilizar el gel como un control y
ante la imposibilidad de obtener este gel libre de hongo, se realizó un “Filtrado” del
Glomygel en condiciones de asepsia, utilizando filtros de hasta 35 µm. Este “filtrado” se
se utilizó como un tratamiento adicional en el experimento.
El campo experimental utilizado, no había sido cultivado y fue clasificado como una
pastura en rastrojo. Se preparó el terreno en caballones para el cultivo de yuca.
86 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Se establecieron nueve bloques, cada uno contenía una repetición de cada tratamiento.
Los bloques fueron dispuestos en posición perpendicular a la pendiente del campo. Dos
hileras de plantas de la variedad MCOL2737, se plantaron alrededor de cada tratamiento
para reducir el efecto borde y evitar contaminación cruzada de inóculos, es decir que los
hongos inoculados crecieran en el suelo lo suficiente para alcanzar otra unidad
experimental (Anexo 18).
Variedad Variedad
Línea MCOL2737 CM4574
Origen de la línea inoculada Muestreo Muestreo Muestreo Muestreo
en campo a los 3 a los 12 a los 3 a los 12
mds mds mds mds
Parental D1 - 11 29 41
Parental C2 1 12 30 42
Parental C3 2 13 31 43
Primera generación S4 (C2xC3) - 14 - 44
Segunda generación de S4 S4a - 15 32 45
Segunda generación de S4 S4b - 16 33 46
Primera generación Sc1 (D1xC3) 3 17 - 47
Segunda generación de Sc1 Sc1a 4 18 - 48
Segunda generación de Sc1 Sc1d 5 19 34 49
Segunda generación de Sc1 Sc1e - 20 35 50
Primera generación Sc2 (D1xC3) 6 21 - 51
Segunda generación de Sc2 Sc2a - 22 36 52
Segunda generación de Sc2 Sc2b - 23 - 53
Segunda generación de Sc2 Sc2c 7 24 37 54
Segunda generación de Sc2 Sc2d - 25 - 55
Línea comercial Glomygel 8 26 38 56
n/a Filtrado 9 27 39 57
n/a H2O 10 28 40 58
n/a= no aplica
El fertilizante fosfatado se adicionó en una concentración del 50% de acuerdo con los
requerimientos de cultivo. La mitad de los fertilizantes se aplicaron 45 días después de la
siembra (dds) y la otra mitad 90 dds. Todas las plantas recibieron 233 kg ha-1 de urea,
125 kg ha-1-fosfato di-amónico, 100 kg ha-1 de cloruro de potasio (KCl).
88 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
4.2.4 Muestreo
Las muestras fueron transportadas dentro de las 24 horas siguientes a los laboratorios de
la Facultad de Ciencias – Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia,
sede Bogotá. Las muestras de suelo fueron almacenadas a -80ºC hasta su
Capítulo 4 89
procesamiento. Las raíces fueron lavadas con el fin de retirar las partículas de suelo
adheridas y luego fueron rotuladas y almacenadas a -80ºC.
Cada una de las líbrerías fue analizada siguiendo el esquema propuesto en la Figura 1,
para obtener una tabla de OTUs con las abundancias para cada muestra. En la
identificación taxonómica de los OTUs se utilizó la estrategia RAxML-EPA, como se
explica en el numeral 2.2.4 de este documento y en el Anexo 3.
Para comparar los índices de diversidad alfa entre los diferentes tratamientos, se verificó
que las variables respuesta cumplieran los supuestos de normalidad (prueba Shapiro
Wilk) y homocedasticidad (prueba de Levene) en el programa JMP® versión 9.0. Si se
cumplían los dos supuestos, se realizó la prueba homogeneidad de varianzas (ANOVA).
Cuando solo se cumplía el supuesto de normalidad se utilizó la prueba Welch que no
exige igualdad de varianzas (Horn, 2009). Si el supuesto de normalidad o los dos
supuestos fueron rechazados, se utilizó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. Para
realizar las comparaciones múltiples se utilizó la prueba de Tukey y la prueba de
Wilcoxon, para datos paramétricos y no paramétricos respectivamente.
4.3 RESULTADOS
Después del análisis bioinformático, se utilizó el algoritmo DBC454 (Pagni et al., 2013)
para agrupar las secuencias de acuerdo con su grado de similitud formando clados.
Luego, similitud de secuencia (BLASTn, NCBI) se seleccionaron los OTUs que
correspondían a Glomeromycota (OTUs-HFMA).
Se encontraron 77 OTUs-HFMA, que fueron asignados a especie por medio del análisis
filogenético RAxML-EPA (Figura 7). El 92.8% de los OTUs se ubicaron en el género
Rhizophagus sp, 6.7% de los OTUs se ubicaron el el género Acaulospora sp y solo el
0.17% correspondían a la especie Scutellospora cerradensis. Otros géneros dentro del
orden Glomerales fueron identificados en muy baja proporción: Claroideoglomus sp con
0.19% y Glomus sp con 0.06% (Figura 13).
92 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Figura 13. Distribución de las especies de HFMA que colonizaron las raíces de las planta
de yuca en campo en el experimento 2. Los datos representan la abundancia relativa
promedio (%) para cada especie en todas las muestras de raíces evaluadas. Valores
menores al 1% no fueron incluidos.
La estructura de la comunidad de HFMA en plantas sin inocular fue diferente para cada
una de las variedades de yuca (PERMANOVA, P=0.0009, Anexo 19), representado no en
el número de especies encontradas, pero si en su abundancia (Figura 14). La especie
Rhizophagus sp1, fue la especie más abundante en las dos variedades, sin embargo
ocupó el 50% de la comunidad para la variedad CM4574-7, mientras que para la
variedad MCOL4574 ocupó el 70% en promedio.
Capítulo 4 93
Figura 14. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de las dos
variedades de yuca, incluyendo los datos de 3 y 12 meses después de la siembra. El
asterísco muestra diferencias significativas con un P<0.05.
Con el objetivo de evaluar si las comunidades de HFMA en el suelo rizosférico tenían una
mayor diversidad que las comunidades de HFMA que colonizaron las plantas de yuca, se
realizaron comparaciones entre la estructura de la comunidad de HFMA descrita en el
suelo rizosférico antes de la siembra y las comunidades de HFMA descritas para las dos
variedades de yuca a los 12 mds (Figura 15).
94 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Para cada una de las estas variables se comprobaron los supuestos de normalidad y
homocedasticidad. Para las variables índice de Shannon e índice de Pielou, se encontró
un efecto de la interacción de las variables (inoculación y variedad de la planta), pero
cuando se evaluó el efecto de cada variable por separado, se observó una fuerte
influencia de la inoculación, pero ningún efecto por parte de la variedad de yuca (Tabla
8).
En la variedad CM4574-7 el valor más alto se observó en las plantas no inoculadas (62.3
OTUs) y el más bajo se observó cuando se inoculó la línea S4 (33 OTUs) (Figura 16).
Comparando las dos variedades, en la variedad MCOL2737 el valor promedio de OTUs
encontrados fue menor (37,2 OTUs) que en la variedad CM4574-7 (45,9 OTUs). Sin
embargo al agrupar los OTUs en las especies putativas, de acuerdo con los resultados
del análisis RAxML-EPA, las dos variedades fueron colonizadas por todas las especies
de HFMA.
Analizando los datos independientemente para cada variedad, se demostró que el efecto
de la inoculación de las diferentes líneas de R: irregularis sobre la diversidad de las
comununidad de HFMA, medido en el índice de Shannon, solo fue evidente para la
variedad MCOL2737 (P<0.0001) (Tabla 8).
Capítulo 4 97
Figura 16. Riqueza de OTUs en las raíces de plantas de yuca en campo, después de
inocular diferentes líneas de Rhizophagus. irregularis, en dos variedades de Manihot
esculenta Cranz a los 12 mds.
98 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Figura 17. Índice de Shannon para las comunidades de HFMA en dos variedades de
yuca, después de inocular con diferentes líneas de Rhizophagus irregularis (columnas en
gris). Resultados para la comunidad de HFMA en plantas inoculadas con el inoculante
comercial, el filtrado y plantas no inoculadas tambien son comparados (columnas en
color rojo, verde y azul respectivamente).
RIQUEZA DE OTUs
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA DIFERENCIA
EFECTO
(Test Shapiro-Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Interacción
0.9158 <0.0001 Welch: <0.0001 Si
Variedadx Línea
Variedad 0.9322 0.0191 Welch: 0.2662 No
Línea 0.873 <0.0001 Welch: 0.3109 No
Inoculación en la
variedad 0.4243 <0.0001 Welch: <0.001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.9322 0.046 Welch: 0.0002 Si
CM4574-7
INDICE DE SHANNON
NORMALIDAD
VARIANZA PRUEBA DIFERENCIA
EFECTO (Test Shapiro-
(Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Wilk)
Interacción <0.001
0.5279 Welch: 0.006 Si
Variedad x Línea
Variedad 0.1305 0.5904 ANOVA: 0.3472 No
Línea 0.5279 0.284 Welch: 0.0359 Si
Inoculación en la
variedad 0.9644 0.0007 Welch: <0.0001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.1305 0.0133 Welch: 0.5606 No
CM4574-7
ÍNDICE DE PIELOU
NORMALIDAD
VARIANZA PRUEBA DIFERENCIAS
EFECTO (Test Shapiro-
(Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Wilk)
Interacción
0.4784 0.0087 Welch: <0.0001 Si
Variedad x Línea
Variedad 0.798 0.6028 ANOVA: 0.3122 No
Línea 0.4784 0.0426 Welch 0.0130 Si
Inoculación en la
variedad 0.3880 0.0050 Welch: <0.0001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.7598 0.2273 ANOVA: 0.3399 No
CM4574-7
100 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Figura 18. Índice de Pielou calculado para las comunidades de HFMA asociadas a
plantas de yuca, doce meses después de la inoculación con diferentes líneas de R.
irregularis.
El índice de parentesco neto (NRI-Net Relatedness Index) fue utilizado para medir la
dispersión filogenética de los OTUs en la comunidad de HFMA inoculada con R.
irregularis, basado en la presencia-ausencia de OTUs y también en las abundancias.
Para el primer caso, donde se utilizaron los datos de presencia-ausencia de OTUs para
calcular el índice NRI, se observó que la interacción entre la variedad de la planta y las
líneas de R. irregularis inoculadas tienen un efecto significativo sobre la dispersión
filogenética de las comunidades de HFMA. Además se observó un fuerte efecto de la
variedad de la planta pero no de la línea inoculada (Figura 19). En la variedad CM4574-7,
el control (plantas no inoculadas) presentó valores negativos para este índice, indicando
que la comunidad de HFMA asociada, es filogenéticamente dispersa (NRI<0), al igual
que ocurrió para la comunidad de HFMA en algunos tratamientos: Glomygel, S4c, Sc1a,
Sc2, Sc2a y Sc2b (Figura 19).
Para el segundo caso, donde se calculó el NRI utilizando valores de abundancia (Figura
20), se observó que los tratamientos mostraron valores positivos, lo cual sugiere un
efecto de dominancia, donde ciertos OTUs que son los mas representativos en la
comunidad de HFMA, están presentes en igual abundancia para todos los tratamientos.
Este efecto es posiblemente generado por el OTU 32 (Rhizophagus sp1) que tuvo un
102 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Para evaluar con más detalle los cambios en la diversidad de la comunidad de HFMA,
después de la inoculación en las dos variedades de yuca, los tratamientos fueron
agrupados de acuerdo al origen o grupo genético de la línea de R. irregularis inoculada,
con el fin de establecer si existía alguna relación entre los cambios causados por la
inoculación y la información genética de la línea inoculada. El parental “D1” no se tuvo en
Capítulo 4 103
MCOL2737
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA
EFECTO DIFERENCIAS
(Test Shapiro-Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA
Welch
Grupo C2 0.8065 0.0403 No
0.5488
KW
Grupo C3 0.0086 0.0002 No
0.0821
ANOVA
Grupo C3-Sc1 0.4500 0.1147 No
0.5712
KW
Grupo C3-Sc2 0.0013 <0.0001 Si
0.0375
CM4574-7
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA
EFECTO DIFERENCIAS
(Test Shapiro- Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA
ANOVA
Grupo C2 0.0252* 0.5869 No
0.9765
Welch
Grupo C3 0.0679 0.0190 No
0.7202
ANOVA
Grupo C3-Sc1 0.7375 0.0813 No
0.7095
ANOVA
Grupo C3-Sc2 0.0220* 0.251 No
0.6168
KW= Prueba no paramétrica Kruskall Wallis; * El supuesto de normalidad se evaluó de forma independiente
para cada tratamiento. Se identificó que el supuesto si se cumplía, por esta razón se evaluó la diferencia
entre tratamientos con el estadístico ANOVA (Horn, 2009).
Capítulo 4 105
El análisis PERMANOVA comparando todos los tratamientos indicó que hubo un efecto
significativo de la interaccion (Variedad de la planta y línea de R. irregularis inoculada), y
también de la línea inoculada, con un valor P=0.0009 (α=0.05), además un efecto de la
variedad de yuca (P=0.08, α=0.1) (Tabla 11, Anexo 21). En consecuencia se realizaron
análisis en grupos más pequeños de tratamientos, agrupandolos por (i) variedad de la
planta, (ii) el origen de las líneas inoculadas (Tabla 7) y (iii) evaluando el efecto de los
controles Glomygel y Filtrado.
Efecto F P
Efecto de la inoculación F P
Para determinar específicamente cuáles líneas de R. irregularis fueron las que generaron
un cambio sobre la estructura de la comunidad de HFMA en las plantas de la variedad
MCOL2737, se hicieron comparaciones en pares: una comunidad de HFMA inoculada
con una línea de R. irregularis versus la comunidad HFMA no inoculada (H2O) (Tabla 13,
Anexo 23 y 24).
Tabla 13. Comparaciones uno a uno, entre comunidades de HFMA inoculadas con
diferentes líneas de Rhizophagus irregularis versus las comunidades de HFMA no
inoculadas en la variedad MCOL2737, doce meses después de la inoculación.
MCOL2737 CM4574-7
En la variedad MCOL2737, cuando las comunidades inoculadas con las líneas de los
grupos genéticos parentales, C2 y C3Sc1 fueron comparadas entre sí, sin incluir la
comunidad de las plantas no-inoculadas (H2O), no se encontraron diferencias
significativas, lo cual sugiere que las comunidades comparadas presentaban los mismos
cambios causados por la inoculación, independiente de la línea inoculada. Por el
contrario, para las comunidades inoculadas con las líneas de R. irregularis del grupo
C3Sc2, mostraron diferencias entre ellas (Tabla 14, Anexo 25).
Cuando las comunidades de HFMA que fueron inoculadas con las líneas de R. irregularis
de los grupos genéticos se compararon con la comunidad de HFMA en plantas no
inoculadas (H2O), se observaron diferencias significativas causadas por la inoculación
(Anexo 26). Análisis gráficos utilizando el ordenamiento multidimensional no métrico,
también mostraron que las comunidades HFMA de plantas no inoculadas (H2O)
aparecen distanciadas de las comunidades HFMA inoculadas (Figura 21c y 21e).
Tabla 14. Resultados del análisis PERMANOVA agrupando tratamientos por grupos
genéticos, para las comunidades de HFMA en plantas de yuca a los doce meses
después de la inoculación. Los valores en la tabla corresponden al valor P de la prueba
estadística PERMANOVA, donde un valor P >α (α =0.05) acepta la hipótesis nula de no
diferencias entre tratamientos.
Los cambios generados por la inoculación de las líneas de R. irregularis del grupo C3Sc2
fueron analizados en más detalle, debido a que fue el único grupo que en el análisis
multivariado mostró diferencias significativas cuando no se incluyó la comunidad de
HFMA de plantas no inoculadas (Tabla 14). Para este análisis, los OTUs fueron
agrupados en las especies putativas identificadas en el capítulo 2 (Figura 7) y los
análisis de varianza fueron realizados utilizando el programa JMP® versión 9.0.1, donde
se comparó la abundancia relativa promedio de cada especie para cada tratamiento.
110 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
a. b.
c. d.
e. f.
Capítulo 4 111
a.
b.
112 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Se evaluó el efecto de los dos controles Glomygel y Filtrado sobre la estructura de las
comunidades de HFMA sin inocular, para cada una de las variedades de yuca. La línea
Glomygel® fue evaluada, comparando las comunidades de HFMA inoculadas y no
inoculadas. No se observaron cambios en la estructura de la comunidad de HFMA para
ninguna de las dos variedades de yuca (Figura 23, Anexo 29).
a. b.
c.
EFECTO DEL DF F P
GLOMYGEL
El efecto del filttrado sobre la comunidad de HFMA es dificil de interpretar, puesto que
este contenía metabolitos desconocidos del hongo R. irregularis presente en el inóculo
comercial Glomygel ®. Por lo tanto se sugiere en futuros estudios identificar los posibles
metabolitos que puedan causar efectos sobre los hongos locales o utilizar como control
un gel que no haya soportado el crecimiento del hongo.
El efecto del filtrado para la variedad CM4574-7 no pudo ser analizado debido a que no
existieron réplicas suficientes para hacer el análisis estadístico, ni a los tres ni a los 12
meses después de la siembra.
Este experimento hace parte del macroproyecto “Cassava for food security and
sustainability in Colombia: Biotechnological application of mycorrhizal fungi. Financiado
por la fundación suiza para el ciencia (Swiss National Science Foundation), cuyo objetivo
también incluía evaluar el efecto de la inoculación de las diferentes líneas de R.
irregularis sobre el crecimiento de la planta hospedera (Ceballos, 2016, Datos no
publicados).
Por lo tanto, se recolectaron datos de biomasa seca de las raíces tuberosas producidas
por las plantas de yuca a los doce meses después de la inoculación. También se calculó
el porcentaje de colonización radical utilizando la técnica tinción de raíces (Vierheilig &
Piché, 1998), que es una de las variables mas frecuentemente utilizadas para evaluar la
presencia de HFMA en las raíces de las plantas (Anexo 32). Estas variables fueron
utilizadas para identificar si los valores de alfa diversidad de las comunidades de HFMA
(índice de Shannon y riqueza de OTUs) tienen alguna relación con el crecimiento de la
planta.
Por medio del estadístico de Pearson, no se observó ninguna relación entre las variables
comparadas para ninguna de las dos variedades de yuca (Tabla 15). Este resultado
sugiere que i) una alta diversidad de HFMA en las raíces de las plantas de yuca no es
directamente proporcional con un mayor crecimiento de la planta ii) una alta colonización
intraradical, medida por los métodos tradicionales de tinción de raíces, no es
directamente proporcional a una mayor riqueza de OTUs ni a una mayor diversidad de
HFMA en las raíces de la planta .
116 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Tabla 15. Comparación de Pearson para las variables: peso seco de la planta, porcentaje
de colonización intraradical, Riqueza de OTUs e índice de Shannon para las dos
variedades de yuca.
Las comunidades de los HFMA que colonizaban las plantas de yuca, después de tres y
doce meses de la inoculación fueron analizadas con el fin de observar los posibles
cambios en la estructura de la comunidad en el tiempo y evaluar si los cambios son los
mismos independientemente del aislado de R. irregularis inoculado.
Para cada variedad de Manihot esculenta Cranz, un número diferente de tratamientos fue
analizado debido a que a los tres meses después de la inoculación se recolectaron tres
réplicas por tratamiento, pero algunas raíces no amplificaron o no se obtuvo número
suficiente de secuencias después de la secuenciación masiva. Para las variedades de
Capítulo 4 117
4.4 DISCUSION
Los resultados de esta investigación sugieren que tanto la genética del hongo a nivel
intra-específico, como la genética de la planta hospedera influyen en la respuesta de las
comunidades de HFMA, a la inoculación (Tabla 10). De forma importante, la perdida y/o
ganancia de OTUs y los cambios en la abundancia no tienen ninguna relación con el
funcionamiento de la simbiosis, medido en biomasa de las raíces de la planta (Figura 20).
Es interesante por lo tanto analizar en detalle cada uno de los factores para entender el
comportamiento de las comunidades HFMA y el impacto ecológico de la práctica de
inoculación, sobre las comunidades del filo Glomeromycota.
120 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Para la variedad CM4574, la comunidad de HFMA inoculada con la línea S4, provocó la
ausencia de la especie Glomus sp. Para los demás tratamientos se observó que
contenían secuencias de todas las especies. La composición de las comunidades en las
dos variedades fueron similiares (Tabla 9), estos resultados sugieren que en el campo
experimental analizado, las plantas de yuca de las dos variedades estuvieron
colonizadas por el mismo grupo de especies, al igual que lo reportado por Senes y cols
(2015), donde se identificaron seis especies que estuvieron presentes en todas las
plantas de papa muestreadas en diferentes latitudes.
(Figura 12 y 17). Estos resultados sugieren, que las comunidades de HFMA en campo,
estan compuestas en su mayoría por una sola especie.
En las comunidades de HFMA que colonizan las plantas de yuca, se observó que el
OTU32 (Rhizophagus sp1) fue el más abundante y estuvo presente en todos los
tratamientos. Las diferencias más significativas entre tratamientos estuvieron marcadas
por la abundancia de los OTUs mas que por la riqueza (Figura 18).
Este estudio es altamente relevante para la ecológía de los HFMA por diferentes
razones. En primer lugar, la secuenciación de la comunidad de HFMA en las raíces de
yuca utilizando Illumina MiSeq, generó una abundante cantidad de secuencias que
aportó robustez y confianza en los resultados presentados en este estudio. Por lo tanto
este se convierte en un estudio de referencia que describe los hongos del filo
Glomeromycota que establecen simbiosis con plantas de interes agronómico en suelos
ácidos del trópico.
Por otro lado, las tecnologías de secuenciamiento masivo han avanzado a una velocidad
muy acelerada en los ultimos años. Es así que en el año 2014, el año en el cual se utilizó
la plataforma de Illumina MiSeq para secuenciar las librerías de ADN de este estudio, era
impensable utilizar Pacific Bioscience debido a la baja profundidad de secuenciamiento y
altos costos (Shokralla et al., 2012). Sin embargo, recientemente Schläppi y
colaboradores (2016) utilizaron esta tecnología para secuenciar un fragmento de 1.5 kb
correspondiente al operon ribosomal rDNA, que tiene una alta resolución de especies
para el filo Glomeromycota. Previamente Camenzid y colaboradores (2014) también
analizaron un fragmento más corto (720 bp) de la misma región genómica pero utilizando
la tecnología de pirosecuenciación Roche FLX 454.
Schläppi y colaboradores (2016) con sus resultados comparativos demuestran que más
que la tecnología utlizada para el secuenciamiento, es importante la región de ADN
seleccionada, pues es la que facilita o no la descripción de la comunidad de HFMA a
nivel de especie. En este estudio con el uso de la región SSU rDNA se amplificaron en
mayor medida secuencias del orden Glomerales. Sin embargo con nuestros resultados,
es difícil deteminar si la estructura de la comunidad de HFMA asociada a plantas de yuca
en campo, está representada en su mayoría por el orden Glomerales o es un sesgo del
marcador molecular utilizado. Para resolver esta pregunta,, será necesario hacer una
comparación amplificando las dos regiones (SSU rDNA y SSU-ITS-LSU rDNA) para la
misma muestra de raíces de yuca y utilizando la misma plataforma de secuenciamiento
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Los resultados de este estudios demuestran que no existe una relación directa entre las
morfoespecies mas abundantes en la rizósfera y la colonización intraradical. Diferentes
OTUs reportados, fueron clasificados a nivel de género como Rhizophagus sp, pero no
se pudieron clasificar a nivel de especie debido a la alta diversidad que presenta este
género.
128 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Rhizophagus sp establece una asociación simbiótica con la planta de yuca y ocupa mas
del 60 % de la comunidad intraradical. Los resultados mostrados en este experimento
solo serían aplicables a la línea comercial de R. irregularis utilizada y no se pueden
extrapolar y afirmar que todos los aislados de esta especie de hongo tendrán el mismo
efecto sobre cultivos de yuca en campo. Rodriguez & Sanders (2014) sugieren que para
comprender un poco más sobre la ecología de las comunidades de HFMA, se deberían
realizar estudios a gran escala que incluyan diferentes tipos de suelo, aislados
geneticamente diferentes y diferentes hospederos.
Los resultados de esta investigación sugieren que tanto la línea inoculada como la
genética de la planta hospedera influyen en la respuesta de las comunidades de HFMA la
inoculación (Tabla 10). Adicionalmente, se pudo establecer que la perdida y o ganancia
de OTUs y los cambios en la abundancia no tienen ninguna relación con el
funcionamiento de la simbiosis, medido en biomasa de las raíces de la planta (Figura 20).
Es interesante por lo tanto analizar en detalle cada uno de los factores del sistema, para
entender el comportamiento de las comunidades HFMA y el impacto ecológico de la
inoculación sobre el filo Glomeromycota.
6.2 Recomendaciones
Las perspectivas de este trabajo están enfocadas a evaluar con más detalle la
interacción HFMA-planta, porque aunque esta simbiosis es ubicua y posible entre 250
especies de Glomeromycota y el 80% de las plantas terrestres (>200.000 especies), no
significa que las interacciones y los procesos metabólicos entre los simbiontes sean
procesos generalizados.
RAxML sin árbol de RAxML sin árbol de RAxML sin árbol de RAxML con arbol de
Tipo de análisis
referencia base referencia base referencia base referencia base
1.Secuencias de
Secuencias consenso Secuencias de referencia 1. OTUs-HFMA
Secuencias identificadas como referencia (Kruger y 2. OTUs-HFMA (77) 2. Secuencias
OTUs-HFMA cols., 2012) 3. Secuencias esporas
esporas (35)
Número de
78 (77 OTUs +
secuencias en 965 1077 112
outgroup)
el análisis
Presencia de
secuencias de
referencia en el No No aplica Si No
alineamiento
MAFFT *
Uso de
alineamiento No aplica, las
base o secuencias de
No Si No
referencia en el referencia ya estaban
MAFFT ** alineadas.
(-add)
Grupo externo Schizosaccharomyces
Geosiphon pyriformis Geosiphon pyriformis Geosiphon pyriformis
(outgroup) pombe
Anexo 4. Figura del árbol filogenético RAxML básico para las secuencias de HFMA
blanco utilizando las secuencias de referencia.
Valores
bootstrap mas
bajos que en
arbol
blackbone
Secuencias de
la misma
especie con
bootstrap alto
134 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Secuencias de
esporas.
No corresponde
con la morfología
135
Rhizophagus
irregularis (5)
Rhizophagus
intraradices (2)
Rhizophagus sp1
138 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Parte II. Continuación anexo 6. Arbil filogenético RAxML-EPA. Familia Glomeraceae (azul
y verde), Familia Claroideoglomeraceae (aguamarina) y Familia Acaulosporaceae
(Amarillo).
Redeckera sp (1)
Tamaño del
Cebadores Secuencia (5’-3’) Referencia
fragmento
AML1 ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA 800 bp Lee et al., 2008
AML2 GAACCCAAACACTTTGGTTTCC 800 bp Lee et al., 2008
NS31 TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC 550 bp Simon et al., 1992
AM1 GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA 550 bp Helgason et al 1998
141
Anexo 8. Lista de secuencias cortas (barcodes) adicionadas al extremo 5' del cebador
NS31, para la construcción de las librerías de ADN.
Anexo 9. Estandarización del algoritmo DBC454 para los datos de este estudio.
143
DENSIDAD
RIQUEZA
UNIFORMIDAD
144 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
INDICE DE SHANNON
INDICE DE SIMPSON
Glomus
145
Claroideoglomus
Rhizophagus
Diversispora
146 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Acaulospora
Anexo 12. Análisis estadístico PERMANOVA para las comunidades de HFMA inoculadas
con Glomygel ®, experimento 1.
147
Anexo 13. Análisis SIMPER para evaluar las especies que influyen en los cambios de las
comunidades inoculadas. Experimento 1.
148 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Número Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dímer Amplifi Seleccion
de fold otros genomas disponibles os ca ado
cebador otros
microo
rganis
mos
1 11- No No Si
0
11- No No Si
1
11- No No Si
2
2 21 Se identificó SNP pero no se logró diseñar
cebadores
3 73 Se identificó SNP pero no se logró diseñar
cebadores
4 14 Se identificó SNP pero no se logró diseñar
5-0 cebadores
5 14 No Si No
5-1
6 15 No No Si
3-0
15 No No Si
3-1
15 No No Si
3-2
7 31 Si No Si
1-0
31 No Si No
1-1
31 No No Si
1-2
149
8 36 Si Si No
3-0
36 Si No No
3-1
36 Si No No
3-2
9 44 Se identificó SNP pero no se logró diseñar
2 cebadores
10 63 No No Si
6-0
63 No No Si
6-1
63 No No Si
6-2
11 81 Si No No
5-0
81 Si No No
5-1
12 14 No No Si
64-
0
Si.
14 No Oryza No
64- sativa
japonica
1
14 Si No No
64-
2
13 23 No No Si
63-
0
23 No No Si
63-
1
23 No No Si
63-
2
14 30 Si No No
64-
0
30 No Si No
64-
1
150 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Parásito de aves
30 No Si No
64-
2
Cianobacteria
Self-Dimers:
5-scttggaaggaggatcatgctca->
|| | |||| | ||
<-actcgtactaggaggaaggttcs-5
5-tggaaggaggatcatgctcataa->
| || | |||| | || |
<-aatactcgtactaggaggaaggt-5
| |||| |||| |
<-aggtattatactttagctagggact-5
Núm Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dím Amplifica Selecci
ero fold otros genomas disponibles eros otros onado
de microorga
ceb nismos
ador
1 2 Se identificó SNP pero no se logró diseñar - - -
cebadores
2 2 Se identificó SNP pero no se logró diseñar - - -
cebadores
3 88 Se identificó SNP pero no se logró diseñar - - -
cebadores
4 88- No No Si
0
88- No No No
1
88- Si No No
2
5 160 No No Si
-0
160 No No Si
-1
160 No No Si
-2
6 177 Si No No
-0
7 192 No No Si
-0
192 No No Si
-1
192 No No Si
-2
8 200 No No Si
-0
9 258 Se identificó SNP pero no se logró diseñar - - -
cebadores
152 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
10 334 No No Si
-0
334 No Si No
-1
11 599 No No Si
-0
599 Si Si No
-1
599 Si No No
-2
12 996 No No Si
-0
996 No No Si
-1
996 No No Si
-2
13 146 No No Si
4-0
146 No Si No
4-1
146 Si No No
4-2
14 172 Si No No
3-0
172 No Si No
3-1
Haemonchus placei
153
172 No Si No
3-2
Self-Dimers:
1 dimer for: 5
5-tgtgtgacagaattcatataggca->
| | |||| | |
<-acggatatacttaagacagtgtgt-5
1 dimer for: 13
5-acgcgaatctctaacaattgatatt->
|| |||||| ||
<-ttatagttaacaatctctaagcgca-5
1 dimer for: 32
5-cccttcagaagagcgactaact->
| |||| |||| |
<-tcaatcagcgagaagacttccc-5
1 dimer for: 34
5-agcgactaactcaggtgatcaa->
||||||
<-aactagtggactcaatcagcga-5
1 dimer for: 46
5-tcagggatcgatttcatattatgga->
| |||| |||| |
<-aggtattatactttagctagggact-5
1 dimer for: 48
5-tgcctgattttcctgatgatatcg->
||||||
<-gctatagtagtccttttagtccgt-5
27 with 28
27
5-cctcttcttcttcctcctcttca->
|||||| |
154 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
<-ggaggacagcatacaaggactg-5
Nú
Ampli
mer
fica Sele
o
Scaff Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre otros ccio
de Dímeros
nad
old otros genomas disponibles micro
ceb o
organ
ado
ismos
r
1 1-0 No Si No
Stegastes partitus
Candida dubliniensis
Echinostoma caproni
Brugia pahangi
1-1 No No Si
1-2 Si No No
2 10- Si Si No
0
10- Si No No
1
10- No No No
2
3 16 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores
4 32- No Si No
0
Anaerostipes hadrus
32- No No Si
1
32- No No Si
2
5 57- No No Si
0
57- No No Si
1
155
57- No No Si
2
6 278 No No Si
-0
278 No No Si
-1
278 Si No No
-2
7 316 Si No No
-0
316 No No No
-1
8 406 No No Si
9 554 No Si No
-0
Heligmosomoides polygyrus
554 No Si No
-1
Vitis vinifera
554 No No No
-2
10 601 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores
11 638 Si No No
-0
638 No No Si
-1
638 Si No Si
-2
12 658 No No Si
-0
658 No No Si
-1
658 Si No Si
-2
13 121 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores -
3
14 146 No No Si
4-0
156 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
146 No Si No
4-1
15 211 No No Si
7-0
Self-Dimers:
1 dimer for: 5
5-gtcaagtggtaaaggtgaaatttga->
| |||||| |
<-agtttaaagtggaaatggtgaactg-5
1 dimer for: 10
5-agtaaaacgtaatccaaaagctgt->
| |||| |
<-tgtcgaaaacctaatgcaaaatga-5
1 dimer for: 29
5-tgaagagggaattgtaccattgc->
| ||| |||| ||| |
<-cgttaccatgttaagggagaagt-5
1 dimer for: 31
5-tctgctggcattgacacatatct->
| |||| |
<-tctatacacagttacggtcgtct-5
1 dimer for: 32
5-gaaactacaacactatcccaattgt->
||||||
<-tgttaaccctatcacaacatcaaag-5
2 dimers for: 44
5-gacgtccatcctctatcgatcg->
||||||
<-gctagctatctcctacctgcag-5
5-gacgtccatcctctatcgatcg->
| |||||| |
<-gctagctatctcctacctgcag-5
2 dimers for: 48
5-tccatcctctatcgatcgaacc->
| |||| |
<-ccaagctagctatctcctacct-5
157
5-tccatcctctatcgatcgaacc->
|| |||||| ||
<-ccaagctagctatctcctacct-5
7 with 8
7
5-cgcaaataacggtttaactgaga->
||||||
<-ttgactacctcctaaacagcct-5
53 with 54
53
5-tgagtgcaaatgatgatgacaca->
|||||| || |
<-acgtttgagtgaccttttgaga-5
# Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dím Amplifica Selecci
SN fold otros genomas disponibles eros otros onado
Ps microorga
nismos
1 38- Si Si No
0
38- No Si* Si
1
38- No Si* Si
2
2 636 No No Si
-0
636 No No Si
-1
158 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
636 No No Si
-2
3 815 Si No No
-0
815 Si No No
-1
4 172 No No Si
3-0
172 No Si No
3-1
Caenorhabditis elegans
Haemonchus placei
172 No No Si
3-2
23- No No Si
2
2 29 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores
9
3 12 No Si Si
68-
0
Lichtheimia ramose
Bipolaris oryzae
12 No Si No
68-
1
159
Pseudogymnoascus destructans
Lichtheimia ramosa
12 No Si No
68-
2
Wallemia ichthyophaga
Lichtheimia ramose
Scedosporium apiospermum
Metarhizium brunneum
4 21 No No No
17-
0
No hay formación de dímeros para ninguna pareja de cebadores ni para ningun cebador analizado independientemente.
160 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
yuca no inoculadas. Los cuadros blancos numerados representan las plantas tratamiento,
donde aleatoriamente se distribuyeron los 36 tratamientos.
166 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Anexo 19. Análisis estadístico para evaluar las diferencias entre las comunidades de
HFMA intraradicales en las dos variedades de yuca sin inocular (Tratamiento control-
H2O).
a) PERMANOVA
Resultado= SI hay un efecto de la variedad de yuca sobre la estructura de las
comunidades de HFMA que colonizan las raíces a los 12 meses despues de la siembra.
167
b) Diferencias entre la comunidad de HFMA a nivel de especie, entre las dos variedades
de yuca utilizadas en este estudio.
Anexo 21. Análisis multivariado para medir el efecto de la variedad y la inoculación con
R. irregularis sobre las comunidades de HFMA a los 12 meses después de la inoculación.
173
174 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Anexo 22. Diferencias en las comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis para
cada una de las variedades de yuca.
Anexo 23. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R.
irregularis versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad MCOL2737.
Línea D1
LINEA C2
Linea C3
177
Línea S4
178 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea S4b
Línea S4c
179
Línea C3Sc1
180 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea C3Sc1a
Línea C3Sc1d
181
Línea C3SC1e
182 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2
183
Línea Sc2a
184 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2b
185
Línea Sc2c
186 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2d
187
188 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Anexo 24. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R.
irregularis versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad CM4574-7.
Línea D1
Línea C2
189
Línea C3
190 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea S4
191
Línea S4b
192 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Linea S4c
193
Línea Sc1
194 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc1a
Línea Sc1d
195
Línea Sc1e
196 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2
197
Línea Sc2a
198 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2b
199
Línea Sc2c
200 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
Línea Sc2d
201
202 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
varianza
Anexo 28. Comparación entre las comunidades de HFMA inoculadas con la línea
parental C3, la línea de primera generación Sc2 y sus segregadas (Líneas de segunda
generación), para la variedad MCOL2737 a los 12 mdi.
Test
Prueba
Especie putativa Test Normalidad Homocedastici Diferencias
estadística
dad
icidad
SC2 C3 H2O
Anexo 29. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con GLOMYGEL
y FILTRADO versus las comunidades de HFMA no inoculadas (H2O) para las dos
variedades de yuca MCOL2737 y CM4574
Anexo 30. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con FILTRADO y
la comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, solo para la variedad MCOL2737, a los
12 mdi.
220 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
221
Anexo 31. Comparación entre las comunidades HFMA inoculadas con Filtrado y
Glomygel y las comunidades HFMA no inoculadas a los 12 mdi, para la variedad de yuca
MCOL2737.
Test
Especie Test Prueba
Homocedast Diferencias
putativa Normalidad estadística
icidad
Anexo 32. Datos de biomasa de la planta de yuca inoculada con las líneas de R.
irregularis. Análisis estadístico.
DATA FOR CASSAVA VARIETY CM4574, 12 MONTHS AFTER INOCULATION
Treatment DryWeightAverage (Kg) %COLONIZATION Average(Kg)
H2O 0.34597743 35.5
Fil 1.000782139 35.3
Glo 1.432014082 72.93333333
D1 0.941158006 25.55
C2 1.136923624 87.23333333
223
C3 1.313862283 44
S4 1.475698809 68.13333333
S4b 1.147050136 73.66666667
S4c 1.084718161 76.7
Sc1 1.392028668 82.85
Sc1a 1.270750104 57.16666667
Sc1d 0.832451893 57.7
Sc1e 0.809489082 77.53333333
Sc2 1.090477294 78.06666667
Sc2a 0.993988862 89.33333333
Sc2b 0.93724654 66.1
Sc2c 1.126674037 58.9
Sc2d 0.961679133 50.3
CM4574:Riqueza Vs Colonizacion
225
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