“MICROBIOLOGÍA”

Práctica 1.
Elaboró: Dr. Jesús Hernández Romano.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

PRELABORATORIO:
1. Indique la clasificación de los medios de cultivo en base a su consistencia y a los componentes que contienen.
2. ¿Qué tipo de organismos crecen preferentemente en el agar dextrosa papa? ¿Por qué?
3. ¿Qué tipo de organismos crecen preferentemente en el agar EMB? ¿Por qué?
4. ¿Qué tipo de organismos crecen preferentemente en el agar MacConkey? ¿Por qué?
5. ¿Qué tipo de organismos crecen preferentemente en el agar Sal manitol? ¿Por qué?
6. ¿Cuál es la función del agar en los medios de cultivo? ¿Qué tipo de compuesto es y de dónde se obtiene?
7. ¿Qué significa que los medios en polvo sean muy higroscópicos?
8. ¿Qué condiciones de presión, temperatura y tiempo debe manejarse en la esterilización de medios?
9. ¿Por qué no usa agua de la llave para preparar los medios de cultivo?

INTRODUCCIÓN
La sobrevivencia y crecimiento de los microorganismos depende de los nutrientes disponibles y de condiciones
ambientales favorables. En el laboratorio, las preparaciones de nutrientes que se usan para cultivar a los
microorganismos se denominan medios de cultivo. Los microorganismos pueden cultivarse utilizando medios
químicamente definidos, para los cuales se conocen las cantidades exactas de los compuestos que los integran, o bien
medios complejos, los cuales incluyen materiales cuya composición exacta se desconoce, como extracto de levadura,
de carne, peptonas, etc. Estos componentes son ricos en vitaminas y nutrientes, pero se desconoce su composición
exacta. Los medios complejos son los que se emplean rutinariamente en laboratorios de bacteriología.
La preparación de medios a partir de productos comerciales deshidratados es simple y directa. Cada bote trae
en su etiqueta las instrucciones para la preparación del medio. Siempre que vaya a preparar medio, utilice un recipiente
de una capacidad de al menos lo doble del volumen de medio que va a usted a preparar.
La esterilización se lleva a cabo utilizando el autoclave, sin embargo debe revisar antes si el medio a esterilizar
no contiene componentes sensibles a las condiciones de esterilización (121ºC a 15 libras de presión).

OBJETIVO:
Que el alumno sea capaz de preparar adecuadamente distintos tipos de medios de cultivo.

MATERIAL REQUERIDO POR EQUIPO:

5 cajas de Petri estériles
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
9 tubos de vidrio con tapón de malaquita
Espátula
Recipiente para pesar (papel aluminio)
Propipeta de goma
Pipeta serológica de 10 mL
Marcador indeleble
Maskin tape
Papel aluminio o tapones de algodón con gasa

REACTIVOS REQUERIDOS:
Medio de cultivo Agar dextrosa papa en polvo
Medio de cultivo EMB en polvo
Medio de cultivo Agar nutritivo en polvo.
Medio de cultivo MacConkey en polvo
Medio de cultivo Agar Sal manitol
Caldo Nutritivo + gelatina

EQUIPO REQUERIDO:
Balanza granataria
Autoclave.

COMPOSICIÓN DE ALGUNOS MEDIOS A UTILIZAR:

Caldo nutritivo:
Peptona 5 g/L
Extracto de carne 3 g/L

Agar nutritivo:
Peptona 5 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Agar 15 g/L

Caldo Nutritivo + gelatina

Peptona 5 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Gelatina 120 g/L

PROCEDIMIENTO
1. Antes de iniciar, un miembro de cada equipo revisa que la autoclave tenga suficiente agua destilada (que cubra la
resistencia) y que esté limpia. Se registran en la bitácora y se enciende para que se vaya calentando.

Preparación de medio sólido en cajas de Petri:

2. Se pesa la cantidad necesaria para preparar 100 mL de cada uno de los siguientes medios a utilizar:
- Medio de cultivo Agar dextrosa papa en polvo
- Medio de cultivo EMB en polvo
- Medio de cultivo Agar nutritivo en polvo.
- Medio de cultivo MacConkey en polvo
- Medio de cultivo Agar Sal manitol
3. Se colocan 100 mL de agua destilada en 5 matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapón y se vierte en cada uno la
cantidad pesada de cada medio.
4. Se etiquetan los matraces con el nombre del medio que contienen.
5. Se mezcla el medio con el agua, se tapan los matraces sin cerrar herméticamente y se meten a la autoclave.
6. Preservando la esterilidad de las cajas de Petri, se etiquetan de acuerdo con el medio que van a contener.
7. Una vez estériles, los medios se dejan enfriar hasta que la temperatura del medio se soporte con el dorso de la
mano, posteriormente se vierte en las cajas de Petri, en zona de esterilidad (cerca del mechero) colocando una
cantidad de medio tal que apenas cubra la mitad del volumen de la caja (NO LLENE LAS CAJAS CON MEDIO).
8. Cada equipo será responsable de verter el medio que preparó en las cajas que llevarán ese mismo medio.
a. Equipo #1: MacConkey
b. Equipo #2: Agar nutritivo
c. Equipo #3: Agar Sal manitol
d. Equipo #4: Agar dextrosa papa
e. Equipo #5: Agar EMB
9. Las cajas se dejan enfriar para que el medio solidifique.

10. Se forma un equipo temporal integrado por un miembro de cada uno de los 5 equipos. Este equipo reúne los 45
tubos con tapón de malaquita y tendrá la responsabilidad de preparar:
a. 15 tubos con agar nutritivo en pico de flauta
b. 15 tubos con caldo nutritivo
c. 15 tubos con caldo nutritivo + gelatina
 Preparación de medio en pico de flauta:
11. Cada tubo en pico de flauta llevará 5 mL, por lo que se pesan las cantidades necesarias de peptona (0.4 g),
extracto de carne (0.24 g) y agar al 2.5% (2.0 g) para preparar 80mL de agar nutritivo y se colocan en un matraz
Erlenmeyer de 250 mL conteniendo los 80 mL de agua destilada.
12. Se mezcla perfectamente para obtener una suspensión homogénea.
13. Con agitación continua para evitar la sedimentación del agar, se colocan 5 mL de medio en cada uno de 15 tubos
etiquetado como “Pico de Flauta”. ES IMPORTANTE QUE CADA VEZ QUE TOME MEDIO DEL MATRAZ AGITE
LA SUSPENSIÓN PARA EVITAR QUE EL AGAR SE DISTRIBUYA DE MANERA NO HOMOGÉNEA.
14. Se cierran los tubos de manera que no quede herméticamente cerrados para evitar que se rompan por la presión
del vapor.
15. Se esterilizan en la autoclave de acuerdo con las instrucciones del profesor.
16. Una vez estériles y antes de que solidifiquen, se inclinan en un ángulo de 10º aproximadamente (puede ser con la
ayuda de un cuaderno) y se dejan solidificar.

Preparación de tubos con caldo nutritivo:

17. Se pesa la cantidad necesaria de caldo nutritivo (o 0.25 g de peptona y 0.15 g de extracto de carne en su defecto)
para preparar 50 mL de caldo nutritivo.
18. Se disuelve el medio en 50 mL de agua destilada.
19. Se colocan 3 mL en cada uno de los 15 tubos con tapón de malaquita etiquetados como “Caldo nutritivo”.
20. Se cierran los tubos de manera que no quede herméticamente cerrados para evitar que se rompan por la presión
del vapor.
21. Se esterilizan en el autoclave de acuerdo con las instrucciones del profesor.

Preparación de tubos con caldo nutritivo + gelatina.

22. Se pesan las cantidades necesarias de peptona (0.4 g), extracto de carne (0.24 g) y gelatina (9.6 g) para preparar
80 mL.
23. Se adicionan los reactivos a un matraz Erlenmeyer conteniendo 80 mL de agua destilada.
24. Se mezcla perfectamente para obtener una suspensión homogénea.
25. Con agitación continua para evitar la sedimentación de la gelatina, se colocan 5 mL de medio en cada uno de 15
tubos etiquetado como “Gelatina”. ES IMPORTANTE QUE CADA VEZ QUE TOME MEDIO DEL MATRAZ AGITE
LA SUSPENSIÓN PARA EVITAR QUE LA GELATINA SE DISTRIBUYA DE MANERA NO HOMOGÉNEA.
26. Se cierran los tubos de manera que no quede herméticamente cerrados para evitar que se rompan por la presión
del vapor.
27. Se esterilizan en el autoclave de acuerdo con las instrucciones del profesor.
28. Se dejan solidificar en posición vertical.

29. Una vez solidificados y esterilizados los medios, se reparten entre los equipos, de tal forma que cada equipo
deberá tener:
a. 5 cajas de cultivo en total, cada una con los siguientes medios:
i. MacConkey
ii. Agar dextrosa papa
iii. Agar nutritivo
iv. Agar sal manitol
v. Agar EMB
b. 3 tubos en pico de flauta
c. 3 tubos con caldo nutritivo
d. 3 tubos con Caldo nutritivo + gelatina
Estos medios se guardan por equipo, debidamente etiquetados, en refrigeración hasta su próximo uso.

OBSERVACIONES:

RESULTADOS.

DISCUSIÓN.

CONCLUSIÓN.
REFERENCIAS:
Alfred E. Brown; “Benson's microbiological applications: laboratory manual in general microbiology”, McGraw
Hill, USA, 2001.
Difco Laboratories; “Difco manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical
laboratory procedures”.
John P. Harley, Lansing Prescott; “Laboratory exercises in microbiology”; McGraw Hill, USA, 2002.