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FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA DE BROMATOLOGIA Y NUTRICION HUMANA

TITULO :

PREPARACION y DILUCIN DE LAS

MUESTRAS DE ALIMENTOS

CURSO :

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PROFESORA :

Blga. JESSY PATRICIA VSQUEZ CHUMBE

NOMBRE :

CANDY SUE HERNANDEZ REATEGUI

SEMESTRE ACADMICO:

II 2011

GRUPO DE PRCTICA :

Mircoles de 6:00 a 9:00 pm.

FECHA DE ENTREGA :

12/10/11

IQUITOS 2011
I. TTULO:

PREPARACION y DILUCIN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS.

II. OBJETIVO:

- Preparar muestras representativas y hacer las diluciones decimales


adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo, para efectuar su
anlisis microbiolgico.
- Que se maneje la correctamente la prctica, las tcnicas asepsia y
bioseguridad para obtener resultados fiables.

III. INTRODUCCIN:

La preparacin de muestras exige reglas de manipulacin aspticas muy


estrictas, as como la utilizacin de materiales y diluyentes estriles,
para evitar la contaminacin exterior del alimento.

La fraccin de alimento a analizar debe ser representativa de la


totalidad de la muestra. Se utiliza una proporcin de 200 250g.

Los mtodos de aislamiento y numeracin de los microorganismos


presentes en las muestras solidas, generalmente requieren de un
tratamiento preliminar para liberar dentro del medio fluido, los
microorganismos que pudieran estar aprisionados en las estructuras del
alimento o en superficies secas o gelatinosas.

El tiempo de homogenizacin de una muestra es de importancia; un


tiempo prolongado puede lesionar las clulas bacterianas, por efecto
mecnico o por la produccin de calor. Por el contrario una
homogenizacin insuficiente puede no liberar todos los microorganismos
presentes en la muestra.

Un factor de importancia en la numeracin de microorganismos en los


alimentos es la naturaleza del diluyente usado, siendo el ms adecuado el
agua peptonada al 0.1%. Sin embargo de acuerdo a la naturaleza del
alimento se pueden utilizar otros diluyentes.

Diluyente: se caracterstica porque no produce modificacin cualitativa y


cuantitativa.
Posteriormente a la toma de muestra y como parte del anlisis, se hace
una dilucin primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra
representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo
(diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y as lograr una
distribucin lo ms uniforme posible, de los microorganismos contenidos
en la muestra destinada al anlisis. Con este fin, se utiliza un diluyente
que favorezca la recuperacin de los microorganismos presentes, para
ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente
debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperacin
y actividad de las clulas microbianas presentes, as como para
favorecer aquellas que se buscan entre una poblacin mixta.

Se pretende encontrar el nmero de microorganismos por unidad de


volumen, hasta asegurar que despus de la incubacin se obtenga un
resultado cuantificable, esto se logra despus de realizar tantas
diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente.
Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas.

IV. METODOLOGA:

Mtodo 1: Recomendado por la Internacional Estndar Organization


(ISO).

a) Equipos y Materiales.
- Homogenizador (Stomacher)
- Frascos estriles por cada muestra de alimento con 90ml del
diluyente.
- Balanza.
- Pipetas bacteriolgicas graduadas de 1,5 y 10ml.
- Tubos de 150 x 15mm que contiene 9ml del diluyente.
b) Procedimiento.
- Se toma 10ml 10 gramos de muestra con una pipeta o una
cuchara estril.
- Se agrega al frasco que contiene 90ml del diluyente.
Obtenindose en esta operacin la dilucin 10-1 1/10.
- Se homogeniza la mezcla en un tiempo mximo de 2.5 minutos
(frasco con diluyente y perlas de vidrio, trituradores), con el
homogenizador de paletas el tiempo y revoluciones por minuto
depende del alimento.
- Se agita este homogenizado y pipetear 1ml con una pipeta estril a
un tubo que contiene 9ml del diluyente. Obtenindose la dilucin
10-2 1/100.
- Mezclar cuidadosamente el contenido del tubo en el vortex
(homogenizador de tubos).
- Transferir 1ml con otra pipeta estril a otro tubo que contiene
9ml del diluyente. Se obtiene la dilucin 10-3 1/1000.
- Se repite el paso anterior hasta conseguir el numero de diluciones
deseadas.

Mtodo 2: Recomendado por Estndar Methods for the Examination


of Dairy Products (1972) y el AOAC (1975); se utiliza como diluyente
agua tamponada fosfatada.

a) Equipos y Materiales.
- Homogenizador
- Frascos estriles por cada muestra de alimento con 450ml del
diluyente.
- Balanza.
- Pipetas bacteriolgicas graduadas de 1,5 y 10ml.
- Frascos que contiene 90 99ml del diluyente.
b) Procedimiento.
- Se toma 50ml 50 gramos de muestra con una probeta o una
cuchara estril.
- Se agrega al frasco que contiene 450ml del diluyente.
Obtenindose en esta operacin la dilucin 10-1 1/10.
- Se homogeniza la mezcla en un frasco con perlas de vidrio,
triturador durante 2.5 minutos o stomacher segn el tipo de
alimento.
- Preparar las siguientes diluciones decimales a partir de la
dilucin 10-1 1/10, por alguna de las dos tcnicas:
Pipetear 1ml de la dilucin 10-1 con una pipeta estril y
transferir a un recipiente con 99ml de diluyente, tenindose
as la dilucin 10-3, agitar esta dilucin energticamente y con
una pipeta estril transferir 1ml a otro recipiente con 99ml
de diluyente, se obtiene as la dilucin 10-5.
Medir 10ml de la dilucin 10-1 con una pipeta estril y pasar a
un recipiente que contiene 90ml de diluyente, obtenindose
la dilucin 10-2, mezclar mediante agitacin. Repetir la misma
operacin hasta obtener las diluciones deseadas segn sea el
caso.

Mtodo 3: Recomendado por FDA; se utiliza como diluyente agua


tamponada fosfatada y 25 grs muestra para 225ml de diluyente, y se
sigue los mismo pasos que los mtodos anteriores (90 9ml de agua
tamponada fosfatada).

V. DATOS Y RESULTADOS.

Datos: Se utilizo el Mtodo 1: Recomendado por la Internacional


Estndar Organization (ISO).
Para la prctica se utilizo como muestra pltano.
Despus de aplastar y moler el pltano tomamos una muestra
representativa para trabajar de 10g pesados en la balanza
analtica.
Usamos 200g de diluyente.
Se homogenizo la mediante movimiento hechas con las manos
durante 2.5 minutos.
Mediante las pipetas estriles extrajimos del frasco (que
contena la muestra con el diluyente) la dilucin 1ml se puso en
un tubo de ensayo con 9ml de diluyente y 1ml se aplico en placas
de petri para la siguiente practica.
Se trabajo as hasta 10-3.
Resultados: Se muestran en la figura:

1ml 1ml

10g

9ml de diluyente 9ml de


diluyente

10-1 10-2 10-3


10g de pltano diluido
y homogenizado en
200g de diluyente AP

Las disoluciones fueron utilizadas en la prctica N3.

VI. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.

DISCUSION: Para obtener resultados confiables y no alterados al


momento de desarrollar la prctica se debe tener asepsia y trabajar
minuciosamente.

CONCLUSIONES: La preparacin correcta de las diluciones y


homogenizacin de las muestras de alimentos son importantes para el
anlisis microbiolgico de control de calidad de alimentos, as como
tambin hay que tener mucho cuidado en la manipulacin de las muestras
y utilizar materiales estriles.
VII. RECOMENDACIONES.

Trabajar siempre cerca al mechero Bunsen.


Descubrir los materiales como las pipetas solo cuando se van a utilizar
para conservar su esterilidad.
Evitar hablar cando se est cultivando los microorganismos, ya que
podramos contaminarla con otros microorganismos que estn en nuestra
saliva.
Ser cuidadosos para evitar accidentes.

VIII. BIBLIOGRAFA.

Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios.


Preparacin y dilucin de muestras para su anlisis microbiolgico.
Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de
Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial
Mexicana. Mxico.
ICMSF, Microorganismos de los Alimentos ecologa microbiana de los
productos, editorial Acribia, Zaragoza Espaa
Garca Rojas, Carmen Elena, Anlisis Microbiolgico de los Alimentos,
editorial Ciencia 3 S.A

IX. CUESTIONARIO.

1. Cul es la razn de la dilucin y homogenizacin de una muestra


de alimento para un anlisis microbiolgico?

La razn por la cual se diluye y homogeniza una muestra de


alimento para un anlisis microbiolgico es para liberar los
microorganismos que pueden estar aprisionados en las
estructuras de los alimentos o en superficies secas o gelatinosas.
2. Cuntos gramos de alimento se encuentra contenido en una
dilucin 10-3?

En una dilucin de 10-3 encontramos 0.001g de alimento.

3. Si tenemos una poblacin inicial de 1012 microorganismos en la


dilucin 10-1, cuanto tendremos en 10-2 y 10-3.

4. Como hiciera usted para calcular sus datos si en vez de colocar


10 gramos de muestra para 90ml de diluyente vierte una cantidad
ms de 10 gramos.

Multiplicamos la cantidad de la muestra por que se verti por 9 y


agregamos la cantidad de diluyente faltante.

5. Que tipos de equipos generalmente se utilizan en la


homogenizacin. Especifique las ventajas y desventajas de cada
uno.

Stomacher (homogeneizador peristltico) o licuadora con vaso


esterilizado.

6. Cules son los diluyentes ms utilizados en el anlisis


microbiolgico de acuerdo al tipo de alimento.

Los diluyentes ms utilizados son la solucin amortiguadora de


fosfatos, el agua peptonada y la solucin salina isotnica, pero
pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones
de dispersar y homogenizar la carga microbiana y de facilitar la
recuperacin de los microorganismos en estudio, mediante
condiciones de osmolaridad, pH, etc.
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA DE BROMATOLOGIA Y NUTRICION HUMANA

TITULO :

PREPARACION y DILUCIN DE LAS

MUESTRAS DE ALIMENTOS

CURSO :

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PROFESORA :

Blga. JESSY PATRICIA VSQUEZ CHUMBE

NOMBRE :

CANDY SUE HERNANDEZ REATEGUI

SEMESTRE ACADMICO:

II 2011

GRUPO DE PRCTICA :

Mircoles de 6:00 a 9:00 pm.

FECHA DE ENTREGA :

12/10/11

IQUITOS 2011
I. TTULO:

NUMERACION DE MICROORGANISMOS MESOFILOS


AEROBIOS VIABLES
II. OBJETIVO:

- Que el estudiante conozca la determinacin de la calidad de un


alimento a travs del recuento de mesofilos aerobios viables
mediante la tcnica recuento estndar en placa.

III. INTRODUCCIN:

El recuento en placa de un alimento ha sido uno de los indicadores


microbiolgicos de la calidad de alimentos ms comnmente
utilizados. Sin embargo este mtodo no puede ser aplicado para
productos fermentados (quesos, yogurt, ciertos embutidos, etc.)

Este mtodo resulta til como indicador de limpieza, desinfeccin y el


control de la temperatura durante los procesos de tratamiento
industrial, transporte y almacenamiento de los productos.

Existen tres mtodos utilizados para este fin:

a) Mtodo de recuento estndar por siembra en profundidad.


b) Mtodo de recuento estndar de siembra por extensin en
superficie.
c) Mtodo de recuento estndar por siembra en gotas.

No hay que esperar que estos procedimientos permitan poner de


manifiesto todos los tipos de grmenes presentes en una muestra, ya
que muchas clulas microbianas no pueden multiplicarse, por que las
condiciones de nutricin, aireacin, temperatura o tiempo de
incubacin resultan especficamente desfavorables para ella.

IV. METODOLOGA.

a) Equipos y materiales.

Placas petri.
Pipetas bacteriolgicas.
Incubadora regulada a 35 a 37C.
Contador de colonia.
Agar plate count.
Alimentos para analizar.
b) Procedimiento.

1) Preparar las diluciones segn el Mtodo 1 de la practica N02.


2) Pipetear 1ml a partir de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 a dos
placas petri vacas por dilucin.
3) Agregar ms o manos 15ml de agar plate count a las placas que
contienen las alcuotas y homogenizar mediante movimientos de
vaivn y rotacin de las placas.
4) Como control de esterilidad, adicionar a una placa petri estril
agar sin inocular y a otro agar inoculado con 1ml del diluyente
(agua peptonada tamponada).
5) Dejar solidificar el agar y luego invertir las placas e incubar a 35 a
37C, durante 18-48 horas.

c) Resultados.

1. Computo de Recuento Estndar en Placa.

Seleccionar las placas correspondientes a una dilucin que


contenga entre 30-300 colonias.
Calcular la media aritmtica de los dos recuentos y multiplicar
por el factor de dilucin (reciproco de la dilucin utilizada).
Reportar el resultado como un recuento estndar en placa.
Si las placas de una misma dilucin presentan recuentos
menores de 30 y mayores de 300, tomar el promedio de los
dos recuentos.
Si el nmero de las placas de dos diluciones consecutivas estn
dentro del rango 30-300, calcular el recuento por separado y
establecer la relacin de los dos recuentos. Si el cociente es
menor de 2 reportar el promedio de los dos valores, pero si el
cociente es 2 o mayor de 2 slo se reportar el recuento
menor.

2. Computo Estimado del Recuento Estndar en Placa.

Si las placas de todas las diluciones muestra ms de 300


colonias, dividir cada duplicado de la dilucin ms alta en
secciones radiales convenientes y contar las colonias en una o
ms secciones; o en todo caso por cm2. Multiplicar en cada caso
por el factor apropiado para obtener el nmero de colonias en
toda la placa. Promediar los estimados de las dos placas y
multiplicar por el factor de dilucin correspondiente.
Si hubiese ms de 200 colonias por 1/8 de seccin de la placa,
multiplicar por 1600 (200x8) por la dilucin y expresar el
estimado como mayor que el nmero resultante.
Si no hubiese colonias en placas de la mayor concentracin,
reportar el estimado como menor que una vez la dilucin.

3. Otro calculo para el recuento Estndar en Placa.

Segn Diane Roberts (1999) utilizar el recuento de dos placas


consecutivas que tengan menos de 300 colonias.

N = C/v (n1 + 0.1 n2) d

V. DATOS Y RESULTADOS.

Datos:

- Se utilizo el Mtodo 1: Recomendado por la Internacional Estndar


Organization (ISO). De la practica N2.
- De las diluciones que se obtuvieron de la practica 2 con el pltano,
se aplico 1ml a dos placas por dilucin.
- Se hiso un control de esterilidad, aplicando 1ml de dilucin a una
placa y a la otra agar sin inocular.
- Con el contador de colonias se contabilizaron dentro de dos
cuadros por placas las colonias que contenan.

Resultados:

Dilucin
homogenizada

10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml

10-1 10-2 10-3


Control de esterilidad

Agar sin inocular Agar inoculado


1ml de dilucin

Agar Plate count

10-1 10-2 10-3

Despus de 48 h

10-1 10-2 10-3


Placa
Dilucin
1 2
10-1 ------- --------
10-2 -------- --------
10-3 165 87

Recuento = (suma/4) x 65/ 10-3 x 1ml

165 + 87 x 65 4095 x 10-3 4.095 ufc/ ml


4

Resultados de control:

Placas Resultados
Agar sin inocular 0
Agar inoculado 2

VI. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.

DISCUSIONES: Al momento de hacer en recuento de colonias las


placas estaban repletas de colonias lo que indica que la muestra
estaba en un mal estado o puede ser perjudicial para el consumo
humano.

CONCLUSIONES: La numeracin de microorganismos es esencial en el


anlisis microbiolgico cuando se trata de control de calidad de
alimentos para el consumo humano, porque mediante este conteo se
puede se puede determinar dependiendo de la cantidad de
microorganismos y colonias encontradas, el impacto que pudiera
causar este alimento al ser consumido.

VII. RECOMENDACIONES.

Usar madil limpio en todas las prcticas.


Tener cuidado al desarrollar las prcticas para no ocasionar
percances o accidentes.
Al momento de hacer el conteo apuntar las colonias contadas.
Dejar limpio la mesa de trabajo antes de retirarse del laboratorio.
VIII. BIBLIOGRAFA.

Orden de 4 de diciembre de 2001 por la que se actualizan las


instrucciones tcnicas para el transporte sin riesgos de mercancas
peligrosas por va area. Suplemento del BOE n 299. de 14 de
diciembre de 2001. Fascculo primero. pp. 68-71.
ISO 9001:2000. Sistema de gestin de la calidad. Requisitos.
COLLINS. C. H. LYNE. P.M. 1989. Mtodos Microbiolgicos. Editorial
Acribia S.A.

IX. CUESTIONARIO.

1. Reportar otros mtodos de recuento microbiano, indicando


fundamentos, operaciones y presicin a parte del recuento
mesfilos viables por siembra en profundidad

Mtodo del Recuento de Superficie o de la Gota:

Consiste en poner sobre las placas de agar algunas gotas del


material.Este mtodo se presta a normalizacin arbitraria; por
ejemplo, si hay menos de 10 colonias en 5 gotas de la muestra, esta
cifra indica que hay menos de 100 colonias/ml. en tal muestra. Si
son numerosas (ms de 40 colonias), entonces el recuento de
colonias por mililitro es mayor de 2000.

Mtodo del recuento por Filtros de Membrana.

Los lquidos que contienen las bacterias se hacen pasar a travs de


un filtro que retiene los grmenes. Se deja despus que el filtro
absorba un medio de cultivo y se incuba, pudiendo contarse las
colonias que se desarrollen.

Se emplea el medio de triptona soja para el contaje total de


aerobios.

Para el recuento de bacilos coliformes, ya de presuncin, ya fecales,


el filtro debe colocarse sobre un medio resucitador durante 1 2
horas y despus sobre un medio de membrana de MacConkey; de
otra forma los contajes sern demasiado bajos. Cuando deban
incubarse 44C para recuento de coli fecal, las cajas se sumergen en
un bao mara, comprobando antes que cierren hermticamente.
Existen tambin otros mtodos como:

Contaje en tubos arrollados


Mtodo de recuento superficial

2. Defina y clasifique a los Microorganismos Indicadores.

E. coli: puede ser indicador e ndice a la vez


Aerobios: nos indica la presencia de oxigeno en el alimento
Anaerobios: nos indica que el alimento esta bien
sellado(conservas)
Mesfilos: nos indica la presencia de microorganismos a una
temperatura ambiente.
Coliformes fecales: nos indica la presencia de un foco de
contaminacin fecal en una industria
Enterobacterias: Higiene de lo que estamos elaborando.

3. Cmo realizara el recuento de mesfilos viables en un queso


madurado o yogurt?

Segn la teora de recuento de microorganismos aerobios mesfilos,


que este mtodo no se aplica a productos fermentados como son
los quesos o yogures; no obstante los recuentos en estos productos
se realizan especficamente para un tipo de microorganismo.

4. Por qu este mtodo no pone en manifiesto todos los tipos de


microorganismos?

Es porque existen microorganismos que se desarrollan en otro tipo


de condiciones, no slo de temperatura (bajas), tambin segn las
necesidades de oxgeno (anaerobios) que pueden estar en el
alimento en forma de esporas.

5. Qu nos indica la presencia de microorganismos aerobios


mesfilos en un alimento?

Nos indican la calidad de nuestro producto y el nivel de higiene en


el cual a sido elaborado en dicho alimento.