Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Manualpracticassem13-2 22426 PDF
Manualpracticassem13-2 22426 PDF
Facultad de Qumica
Departamento de Bioqumica
Semestre 2013-1
Editora:
Dra. Nahieli Greaves Fernndez
0
0141 Bioqumica experimental 2013
Carmina Montiel
Doctora en Ciencias Qumica, Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del curso Bioqumica
experimental.
1
0141 Bioqumica experimental 2013
CONTENIDO
2
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos
Conocer la importancia de realizar un reporte cientfico.
Conocer las caractersticas y partes de un reporte cientfico: Introduccin, hiptesis,
objetivo, mtodos, resultados, discusin y conclusiones y referencias.
Conocer cmo se formulan las hiptesis.
Aprender a plantear hiptesis.
Aprender a realizar un reporte cientfico.
Actividades sugeridas
1. El profesor proporcionar al menos un artculo de investigacin para que los alumnos
identifiquen y analicen en ste las partes de un reporte. Cada equipo deber presentar
qu secciones tiene su artculo y si stas cumplen con las caractersticas indicadas en
el texto. Los alumnos deben encontrar la hiptesis aunque sta no est planteada con
la estructura descrita aqu, sino como una pregunta de investigacin. Se puede sugerir
a los alumnos que, con base en la informacin presentada en el artculo y la pregunta
de investigacin, planteen la hiptesis de la forma como se sugiere en este manual.
2. Asignar un problema a resolver por equipo o solicitar que los estudiantes elijan el
problema a solucionar. Permitir que los estudiantes formulen hiptesis y diseen un
experimento para comprobarla. Se podrn realizar al menos dos formas diferentes de
reporte: La primera podra ser un reporte oral al final de la sesin (simulando un
congreso) y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesin.
Cuestionario
1. Qu finalidad persigue el cientfico al escribir y publicar un artculo cientfico?
2. Investiga cmo se lleva a cabo el diseo de un experimento e incluye qu son las
variables independientes, las dependientes y las del control?
3. Qu estructura debe tener una hiptesis?
4. Cules son las secciones de un reporte cientfico?
5. Qu diferencia(s) hay entre la seccin de resultados y la discusin?
6. Qu informacin bibliogrfica deben contener las referencias, si son libros, artculos
o catlogos o pginas de internet?
Referencias
Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition.
Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994.
Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New
York: Longman, 2000.
3
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos
Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotmetros.
Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena.
Construir curvas de calibracin y comprender su importancia.
Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Material y equipo
Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotmetro
Tubos de microfuga
1 gradilla para tubos de microfuga
1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.
1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.
1 Micropipeta 10 L
1 Micropipeta 20-200 L
1 Micropipeta 200-1000 L
Vrtex
Espectrofotmetro (por grupo)
Reactivos
Albmina de suero bovino (BSA) a una concentracin de 1 mg/mL.
Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn)
Solucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na2CO3, 0.1 % CuSO4 y 0.2 % de
tartrato de Na+ y K+)
10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)
0.8 N NaOH
Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC,
10% SDS, 0.8 N NaOH y H2O destilada.
Reactivo B. Dilucin del reactivo de Folin-Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5
volmenes de H2O. Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antes
de usarse.
Desarrollo experimental
Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry.
1. Rotular los tubos de microfuga y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la
Tabla 1.2. Recuerda: debes mezclar con el vrtex despus de aadir cada una de las
soluciones.
4
0141 Bioqumica experimental 2013
Tabla 1.1. Reactivos y cantidades a aadir para realizar una curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracin
de protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry para su determinacin.
Tubo H2O BSA Reactivo A Reactivo B A750 m
(1mg/mL)
5
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which
is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356.
Wang Y, Wade H, Wong E-T, Li YC, Rodewald LW, Wahl GM 2007. Quantitative
analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation.
PNAS 104 (30), 12365-12370.
6
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos
- Conocer las propiedades fisicoqumicas de las protenas: carga, punto isoelctrico,
masa molecular y afinidad.
- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar protenas a partir de diferentes
fuentes celulares.
- Relacionar las propiedades fisicoqumicas de las protenas con el fundamento de las
tcnicas utilizadas en la purificacin de protenas: Centrifugacin diferencial,
precipitacin por salado, cromatografa de filtracin en gel, cromatografa de
intercambio inico y cromatografa de afinidad.
- Aplicar las tcnicas de centrifugacin y precipitacin por salado como tcnicas iniciales
de purificacin de una protena.
DISEO EXPERIMENTAL
En esta prctica se purificar la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de msculo de pollo.
En la primera parte del protocolo de purificacin se realizar la clarificacin de la muestra
mediante filtracin y centrifugacin y posteriormente se llevarn a cabo dos pasos
secuenciales de precipitacin con (NH4)2SO4. En la siguiente sesin se realizar el
desalado de la muestra mediante filtracin en gel, para al final purificarla mediante una
columna de intercambio inico o de afinidad. Posteriormente, en la tercera parte del
protocolo se evaluar el rendimiento al determinar la cantidad total de protena y por ltimo,
en la cuarta parte del protocolo, se determinar su pureza al realizar la separacin de las
muestras proteicas y visualizacin en un gel de poliacrilamida-SDS.
PRIMERA PARTE
Para iniciar el proceso de purificacin de una protena primero se deben conocer las
caractersticas de esta, en este caso en particular las propiedades de la lactato
deshidrogenasa de pollo, por lo que se te solicita lo siguiente:
7
0141 Bioqumica experimental 2013
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Material biolgico
100 g de carne de pechuga de pollo por grupo.
8
0141 Bioqumica experimental 2013
Reactivos
Amortiguador A: 20 mM Tris pH 8.6, 1 mM PMSF, 0.5 mM 2 -mercaptoetanol
(NH4)2SO4 slido.
Desarrollo experimental
Importante. Todo el procedimiento deber realizarse en fro (4 C). Mantener las soluciones y
suspensin proteica en bao de hielo. Despus de cada paso de purificacin se tomar
una muestra para analizar posteriormente (en el protocolo de purificacin se indica
cundo tomar las alcuotas). Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, as como el
volumen de la solucin de homogeneizacin y los volmenes resultantes despus de cada
uno de los pasos de purificacin (Figura 2.1). Estos valores son necesarios para calcular
el rendimiento, contenido de protena y actividad enzimtica.
9
0141 Bioqumica experimental 2013
SUGERENCIAS:
1. Para evitar la congelacin y descongelacin innecesaria de las muestras es
conveniente que al final de esta sesin se almacenen las muestras en alcuotas y
que se etiqueten apropiadamente.
2. Se recomienda slo descongelar la alcuota una sola vez y despus desecharla.
10
0141 Bioqumica experimental 2013
_____g Tejido
______mL Amortiguador A
Moler
Homogeneizado
Homogeneizado
Distribuir en botellas de centrfuga
Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4 C
Botn Sobrenadante
(FRACCIN 2;_________mL)
Botn Sobrenadante
(FRACCIN 3)
Aadir 1 mL de H20;
Volumen total obtenido______mL
Figura 2.1 Esquema de purificacin de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de
amonio. Se sugiere llenar los espacios vacos con las cantidades solicitadas.
11
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las protenas purificadas
2. Dentro de la gua para purificar a una protena se plantea que es importante
establecer cul va a ser el uso final de la protena purificada. Explica por qu.
3. Qu propiedades de la lactato deshidrogenasa se aprovecharn en cada paso de su
purificacin? (Ejemplos: carga, peso, solubilidad y unin a ligantes)
4. Por qu es importante mantener la mezcla de protenas a 4 C?
5. De acuerdo con la reaccin que cataliza y su funcin en el organismo, por qu crees
que se seleccion el msculo esqueltico de pollo para aislar la lactato
deshidrogenasa?
6. Qu tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificacin y por qu?
7. Existen varios mtodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por
qu existe esa variedad si todos purifican a la misma protena?
8. Menciona al menos dos protenas que tienen actualmente un uso farmacutico o
mdico y cul es la fuente biolgica de la que se obtienen.
Referencias
Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and
ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New
York, USA.
Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1-
4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Lehninger, A.L. 2005. Principios de Bioqumica. 4 edicin. Editorial Omega. Barcelona. pp.
191-237.
Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.
Code number 18-1132-29 Pp 94.
Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.
Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences.
John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,
USA. Pp 71-104
Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato deshidrogenasa
de pollo http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html autor:
John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant
12
0141 Bioqumica experimental 2013
Informacin previa
De acuerdo con el pI que encontraste para la lactato deshidrogenasa, predice si su carga
elctrica ser positiva o negativa cuando la protena se encuentre en un amortiguador de
fosfatos pH 6.5 Y cuando se encuentre en un amortiguador a pH 8.6?
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Material biolgico
Fraccin 3 obtenida en la seccin anterior
Material y equipo
1 columna de cromatografa vaca
1 columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina
1 probeta de 50 mL
Reactivos
Desalado
2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama de
Sephadex, preparado segn se indica en el Apndice. Se entrega empacada para su
uso inmediato.
Amortiguador A para quienes realizaran la cromatografa de afinidad. Contiene
20 mM de Tris/HCl pH 8.6, 0.5 mM -Mercaptoetanol y 1 mM PMSF
(phenylmethylsulfonyl fluoride, inhibidor de serin y cisten proteasas, viene disuelto
en etanol y se aade justo antes de usarse, preguntar a que concentracin se
encuentra el stock).
13
0141 Bioqumica experimental 2013
Desarrollo experimental
NOTAS.
1. Al terminar de utilizar la columna, lavarla con 10 mL de agua destilada estril, en
el ltimo lavado dejar al menos 1mL de agua en la columna y taparla para
mantenerla hidratada, entregarla al profesor.
2. No es necesario realizar la operacin en condiciones de esterilidad, pero el usar
agua estril ayuda a disminuir una posible contaminacin de la columna para el
uso posterior de otro grupo de estudiantes.
14
0141 Bioqumica experimental 2013
La mitad del grupo realizar la purificacin por cromatografa de intercambio inico y la otra
parte del grupo se enfocar en la purificacin de la LDH por columna de afinidad. Ambas
secciones del grupo comenzarn su purificacin a partir de la fraccin 4.
15
0141 Bioqumica experimental 2013
Investiga:
Cul es la diferencia entre absorcin y adsorcin?
Recuerda:
La resina Macroprep high S (BIORAD) es un fuerte intercambiador catinico, por lo que la
LDH la debes mantener a pH debajo de su pI para que se encuentre cargada
positivamente.
Adems, hay que considerar que la forma B de la LDH es estable a pHs entre 6.0 y 10.0.
16
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Por qu es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la o las fracciones con
alto contenido de sal en protocolo experimental antes de someterla a cromatografa de
afinidad o de intercambio inico?
2. Cules otros usos tiene la cromatografa de exclusin molecular que no sea la de
ayudar a desalar una suspensin de protenas?
3. Qu intervalo de fraccionamiento de molculas tiene el Sephadex-G25 y que
aplicaciones tiene?
4. Qu es el volumen vaco en una columna de filtracin en gel?
5. A qu se refiere el trmino volumen muerto en una columna cromatogrfica?
6. Investiga la composicin de la matriz de intercambio inico que se us para purificar a
la LDH.
7. De acuerdo con pI de la LDH, si contaras con una columna de intercambio aninico
como DEAE-celulosa, a qu pH mantendras a tu protena y a qu pH mantendras el
amortiguador para eluir a la protena de la columna? Fundamenta tu respuesta.
8. Qu propiedad de la protena se utiliza para purificar a la protena mediante una
columna de intercambio catinico?
9. Qu debe contener el eluyente para la purificacin de la LDH en la cromatografa de
intercambio inico que se propone en este protocolo y por qu?
10. Qu propiedad de la protena ests utilizando para purificarla por cromatografa de
afinidad y cul es el componente clave para la purificacin de la LDH en esta
columna?
Referencias
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New
York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catlogo 18-1132-29
Pp 94.
Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la
pgina www.els.net
Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons
Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104.
Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com
17
0141 Bioqumica experimental 2013
Protocolo experimental
Material biolgico
Fracciones obtenidas durante el proceso de la purificacin de la LDH
Material y equipo
1 Recipiente para hielo
Celdas metacrilato grado UV para espectrofotmetro
Celdas de polipropileno para espectrofotmetro
Tubos para microfuga de 1.5 mL
1 vrtex
Micropipeta de 200-1000 L
Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 5 a 10 L
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 piseta con etanol y una con agua bidestilada.
1 gradilla para tubos de microfuga
Espectrofotmetro
Reactivos
Reactivo de Bradford (Solucin en cido fosfrico de azul de Coomassie Brilliant
Blue G-250)
Solucin estndar de albmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL.
18
0141 Bioqumica experimental 2013
Desarrollo experimental
19
0141 Bioqumica experimental 2013
Tabla 2.2 Orden de adicin de reactivos para la determinacin de protenas del estndar de BSA
Tubo B 1 2 3 4 5
H2O ( L) 800 770 760 740 720 700
BSA ( L) 0 30 40 60 80 100
Reactivo Bradford ( L) 200 200 200 200 200 200
Absorbancia
7. Numerar los tubos segn se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volmenes
de protena indicado por el profesor, registrarlos en la tabla.
20
0141 Bioqumica experimental 2013
Abs 595 nm b
Contenido de protena ( g ) *F
m
Donde, b es la ordenada al origen,
m la pendiente y
F es el factor de dilucin de cada muestra (recuerda el factor de dilucin es adimensional y si
hiciste dilucin el valor es mayor a 1 y corresponde al nmero de veces que diluiste)
12. Dividir el valor de contenido de protena entre el volumen de muestra que utilizaron
en el ensayo para obtener la concentracin de protena expresada en g/L.
13. Posteriormente realizar los promedios por muestra (recuerda que tienes duplicados
para cada fraccin).
14. Determinar la cantidad de protena total que se obtuvo de cada una de las fracciones
de los diferentes pasos de purificacin. Para ello multiplicar el volumen total de la
fraccin por el promedio obtenido en el punto 7. Con los datos llenen la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDH
Fraccin Promedio Volumen total en la Protena total en la
( g protena/ L) fraccin fraccin
( L) ( g o mg )
0
FPA
FPB
21
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Compara ambos mtodos de cuantificacin de protenas utilizados en la prctica y
enlista sus diferencias. Considera tanto el fundamento de las tcnicas como la
metodologa para llevarlas a cabo.
2. Compara los resultados de concentracin que obtuviste con los dos mtodos
empleados en la prctica.
3. Qu desventajas tiene determinar la concentracin de protena por Abs 280 con
respecto al mtodo de Bradford en muestras que tienen una cantidad variable de
protenas, como en nuestras fracciones de la purificacin de la lactato
deshidrogenasa?
4. Puedes usar otra protena que no sea BSA como estndar? Si es as cul y por
qu?
5. Qu sustancias pueden interferir en cada uno de los mtodos empleados y si se
puede, cmo evitas su interferencia?
6. Investiga el intervalo de concentracin de protenas que detecta cada uno de los
mtodos.
7. Por qu es necesario construir una curva de calibracin en la determinacin
colorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford?
8. Investiga qu otro mtodo existe para cuantificar protenas y explica su fundamento.
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
22
0141 Bioqumica experimental 2013
Material biolgico
Fracciones obtenidas durante el proceso de purificacin de la LDH
Material y equipo
2 vasos de precipitados 25 mL
1 pipeta Pasteur con bulbo
Tubos para microfuga de 0.5 mL
1 recipiente para hielo
1 micropipeta de 2-10 L
1 micropipeta de 20-200 L
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 recipiente de plstico/gel para la tincin.
1 equipo completo para electroforesis de protenas marca BIORAD (incluye: reservorio con
electrodos, placas de vidrio, peines, sujetadores de las placas de vidrio y mdulo para
preparar el gel)
1 fuente de poder
Reactivos
Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-bisacrilamida.
2 M Tris /HCl pH 8.8
0.5 M Tris/HCl pH 6.8
20% SDS
TEMED
10% Persulfato de amonio
Agua destilada
Isopropanol o butanol
Mezcla de estndares de peso molecular de protenas.
23
0141 Bioqumica experimental 2013
Desarrollo experimental
4. Aadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio.
5. Agregar poco a poco, con la ayuda de una pipeta pasteur, isopropanol o n-butanol
con la finalidad de disminuir la tensin superficial y que no se forme un menisco en la
parte superior del gel.
6. Esperar a que polimerice la acrilamida, no ms de 20 minutos.
7. Decantar el isopropanol o butanol y lavar con agua bidestilada. Eliminar el exceso de
agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel
8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 3. Aadir todos los
componentes del gel concentrador y justo antes de aadir entre las placas de vidrio
aadir los volmenes indicados de TEMED y persulfato.
9. Aadir el gel concentrador entre las placas de vidrio e inmediatamente insertar el
peine en la parte superior para formar los depsitos en los que colocaremos la
muestra.
10. Esperar a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.
11. Remover con cuidado el peine y fijar el gel con las placas de vidrio a la cmara de
electroforesis.
24
0141 Bioqumica experimental 2013
Preparacin de muestras
13. Calcular cul es el volumen necesario para tener 20 g de protena utilizando los
datos de concentracin de protena obtenidos en la Parte II de la prctica (en g
protena/ L). Con los datos llenar la tabla 2.6.
25
0141 Bioqumica experimental 2013
14. Descongelar las muestras, colocar el volumen que se calcul en un tubo de microfuga
y a ese volumen aadirle amortiguador de muestra. Generalmente al preparar la
muestra para correr en geles de poliacrilamida-SDS se mezcla un volumen de muestra
proteica con 1 volumen de amortiguador de muestra. Si los volmenes resultantes son
muy diferentes entre las diferentes muestras ya mezcladas con el amortiguador de
muestra, es recomendable ajustar todas a un volumen total similar usando
amortiguador de muestra. Recuerda: slo ajustamos los volmenes con amortiguador
de muestra por lo que la cantidad de protena en cada carril no cambia, lo que
hacemos es uniformar el volumen en el carril para que la difusin entre carriles se
minimice o sea homognea. Cabe sealar que los pozos del gel tienen una capacidad
mxima de 30 L por lo que la mezcla protena: amortiguador de muestra no debe
exceder ese volumen.
15. Realizar tambin una mezcla de estndares de peso molecular ver la tabla 2.6.
16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se
obtuvieron las fracciones y colocar el estndar en el ltimo pozo (Figura 2.4).
PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS MOLECULARES DE LOS
ESTNDARES.
17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel
separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se
caliente el gel.
18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel o
segn se desee.
19. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar una tincin depositando el gel en
una charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin
constante.
20. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucin
desteidora. Poner a agitar suavemente.
26
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. En cul de los pasos de la purificacin se obtuvo una mayor cantidad de LDH?
2. Cul de los dos mtodos de purificacin cromatogrfica produce una mayor cantidad
de LDH, la cromatografa de afinidad o la de intercambio inico?
3. Usualmente, en una purificacin se utilizan la cromatografa de intercambio inico y la
de afinidad como pasos secuenciales, una despus de otra, pero por costos hemos
utilizado slo una de ellas. Con los resultados que obtuvo tu equipo y los otros
equipos, predice cul sera el resultado si primero se realizara la cromatografa de
intercambio catinico y luego la cromatografa de afinidad.
4. Cuntos contaminantes se tienen en la mezcla de protenas obtenida en el proceso
cromatogrfico final?
5. Elabora un esquema de purificacin para la protena malato sintasa a partir de
semillas de girasol. Para ello busca:
A) Cul es la funcin de la protena
B) En qu material biolgico se encuentra
C) En qu compartimento subcelular se encuentra
D) Busca la informacin estructural y/o fisicoqumica de la protena.
E) Realiza un diagrama de flujo del protocolo de purificacin propuesto,
fundamentando el porqu de cada paso de purificacin, indicando en cada paso
en dnde est la protena. Recuerda que tiene caractersticas muy distintas a la
lactato deshidrogenasa por lo que no necesariamente se tienen que usar los
pasos de purificacin usados en este protocolo experimental.
Recuerda que para cada tipo de protena el protocolo de purificacin puede
variar.
Referencias
Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current
protocols in protein science 3.4.1-3.4.29.
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,
USA. Pp 71-104
27
0141 Bioqumica experimental 2013
3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
Informacin previa.
Uno de los mtodos para seguir el proceso de purificacin de una protena es la deteccin de
su funcin, en la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de
pollo. En esta parte del protocolo se medir la reaccin en el sentido de piruvato a lactato a
diferentes tiempos, utilizando como fuente de enzima las fracciones obtenidas durante el
protocolo de purificacin de la LDH de la seccin II del manual.
El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y el
NAD+. El NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD + no absorbe
radiacin a esta longitud de onda. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se
detectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que durante la
reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Material biolgico
Fracciones obtenidas durante la purificacin de la LDH (seccin II del manual)
Material y equipo
Celdas de plstico
Tubos de microfuga
Parafilm
1 recipiente para hielo
1 micropipeta de 200-1000 L
1 micropipeta de 20-200 L
1 micropipeta de 2-10 L
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 vrtex
Espectrofotmetro (por grupo)
Reactivos
100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0
10 mM piruvato de sodio
28
0141 Bioqumica experimental 2013
4 mM NADH. Reactivo que debe prepararse justo antes de usarlo, puede usarse
el amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340
nm sea mayor de 1.0, si no es as volver a pesar y medir. El NADH no se puede
almacenar disuelto, por lo que al final la sesin experimental se desecha el reactivo.
Desarrollo experimental.
Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin
3, que es la fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Para
obtener las curvas de actividad se determinar la dilucin ptima de enzima para realizar los
ensayos (ver abajo).
Una vez que concluyan con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido de
la sesin, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad de la fraccin 1 y/o la
fraccin purificada A o B.
29
0141 Bioqumica experimental 2013
Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas. Anotar la fraccin
y su dilucin.
30
0141 Bioqumica experimental 2013
Para calcular la actividad total de la enzima se realizan los siguientes tres pasos:
A. Utilizar la pendiente de la curva de la grfica de absorbancia vs. tiempo y sustituir
los valores en la siguiente ecuacin
Abs
m
min
Actividad 1
mmol min 1 mL 1
M cm 1 * b cm
Donde:
m: es la pendiente de la recta ( Abs/ t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extincin molar para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
Para obtener el valor de la actividad especfica, cuyas unidades son mmol min-1mg-1 divide
la actividad total dada en mmol min-1 entre la cantidad de protena total de la fraccin (mg).
El valor de grado de pureza tambin llamado veces de purificacin se obtiene al dividir la
actividad enzimtica especfica de la fraccin entre la actividad especfica de la fraccin
31
0141 Bioqumica experimental 2013
inicial en este caso la F1. Se espera que conforme se pierdan protenas contaminantes el
grado de pureza se vaya incrementando.
Cuestionario
1. Qu solucin se us como blanco para calibrar el espectrofotmetro en la prctica?
Por qu?
2. Realiza el anlisis dimensional de la frmula que se propone para calcular la actividad
de la enzima.
3. Define actividad especfica y katal.
4. Propn un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de
realizar una curva temporal de aparicin de productos.
5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.2 menciona cul fue el paso
en el que la protena se enriqueci ms. A qu crees que se debe?
6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad en
qu pasos de la purificacin se eliminan ms contaminantes?
7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se toma en cuenta la
actividad de la enzima?
Referencias
Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190.
Localizacin QP514.2
Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical
significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.
Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345
L43
Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de
CV., 2002, pP185
Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
32
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos:
- Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad
mxima.
- Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km.
- Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato
deshidrogenasa utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis-
Menten.
- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa
- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima.
Informacin previa
En la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato
deshidrogenasa de msculo de pollo, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato,
manteniendo constante la concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin.
Tambin se determinar el tipo de inhibicin que el oxamato (un cido carboxlico) produce
en la actividad de la enzima (Figura 3.5). Para la determinacin de las constantes se medir
la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentracin
de inhibidor. A travs del anlisis del efecto del inhibidor en los parmetros cinticos de la
enzima se determinar el tipo de inhibicin que produce el oxamato.
Figura 3.1 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Material biolgico
Fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.
Materiales y equipo
10 celdas de plstico
Tubos para microfuga
1 recipiente para hielo
1 vaso de precipitados de 25 mL
3 tubos de ensayo 13x100mm
1 micropipeta de 1000 L
1 micropipeta de 200 L
1 micropipeta de 10 L
1 micropipeta de 50 L
33
0141 Bioqumica experimental 2013
Reactivos
100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0
10 mM piruvato de sodio
10 mM oxamato de sodio
4 mM NADH.
Desarrollo experimental
3. Preparar la dilucin de la enzima. El volumen preparado debe ser suficiente para que
alcance para la determinacin del efecto de la concentracin de sustrato y para la del
efecto del inhibidor.
4. Justo antes de medir en el espectrmetro aadir a la celda 63 L de NADH 4 mM,
tapar con parafilm y mezclar por inversin. Registrar la lectura. Este paso se realiza
para asegurarse de que la mezcla de reaccin contiene NADH.
5. Posteriormente aadir a la celda 10 L de la muestra de la enzima diluida, fraccin 3
obtenida en la prctica de purificacin. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por
inversin.
6. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una
longitud de onda de 340 nm.
34
0141 Bioqumica experimental 2013
Abs
m *Vol reaccin
min
Actividad 1 1
mmol min 1 mg 1
Donde:
m: es la pendiente de la recta ( Abs/ t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
Cantidad de enzima: En vista de que no se comparar la actividad de la enzima de un proceso de
purificacin, hay que calcular la cantidad de enzima que se aade al medio de reaccin tomando en cuenta la
concentracin de protena de la muestra, la dilucin y el volumen que se tom para el ensayo de esta
dilucin.
Por ejemplo, si la concentracin de la enzima F3 es 22 g/L e hiciste una dilucin 1:300 de la fraccin y de
sta tomaste 10 L, entonces la cantidad de enzima que aadiste a la celda fue de 7.33X10 -4 mg de acuerdo
a la siguiente operacin:
9. Posteriormente se grafican:
35
0141 Bioqumica experimental 2013
10. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax con los datos obtenidos de los tres
grficos anteriores y tabular los datos.
11. Analizar los valores de las constantes cinticas de la lactato deshidrogenasa.
1. Adicionar en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el orden
indicados en la Tabla 3.5.
Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato
deshidrogenasa.
Solucin 1 2 3 4 5 6
*Concentracin final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 600 600 600 600 600 600
H2O c.b.p. 1000 L 287 284 278 268 257 243
10 mM Oxamato ( L) 34 34 34 34 34 34
10 mM Piruvato ( L) 6 9 15 25 36 50
4 mM NADH ( L) 63 63 63 63 63 63
Enzima (diluida) ( L) 10 10 10 10 10 10
36
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
37
0141 Bioqumica experimental 2013
Referencias
Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin
QP514.2
Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.
202-233. QH345 L43
Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
Bennett NG, Gutfreund H. 1973. The Kinetics of the interconversion of intermediates of the
reaction of pig muscle lactate dehydrogenase with oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide
and lactate. Biochemistry Journal 135, 81-85.
38
0141 Bioqumica experimental 2013
Protocolo experimental
Material biolgico
Cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a
37C.
Cultivo de E. coli W3110/FKmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a
37C.
Materiales y equipo
1 microtubo con 600 L de caldo Luria estril
5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml)
2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
100 palillos de madera estriles
1 asa bacteriolgica
1 propipeta
1 mechero
Incubadora a 37 C
Bao Mara a 37 C
Refrigerador a 4 C
Desarrollo de la prctica
1. En condiciones estriles tomar el tubo de microfuga con 600 L de caldo Luria estril y
hacer la siguiente mezcla de conjugacin: 300 L del cultivo de E. coli JM1452Str ms
120 L del cultivo E. coli W3110/FKmTn3 (Figura 4.1).
2. Incubar el tubo a 37C SIN AGITACIN durante 30 min.
3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes.
Marcar la zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugacin y la zona 3
como bacteria donadora. Colocar una gota pequea de cada cultivo en el sitio
correspondiente y dejar que se absorba.
Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota del
cultivo se puede sembrar por estra cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja de
adelantar un da.
39
0141 Bioqumica experimental 2013
Parchar consiste en transferir una colonia aislada de una caja a otra caja petri. En la
prctica se transferir una misma colonia a 2 cajas petri, esto al picar con un palillo la
colonia de bacterias aislada, transferirla picando la caja Petri que contiene Luria-agar
con el antibitico estreptomicina y ese mismo palillo pica despus a la caja Petri que
contiene Luria-agar y kanamicina, as las dos cajas habrn sido picadas con la misma
colonia. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrs de las
cuatro cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja y
numerar cada uno de los cuadros (ver figura 4.1).
8. Incubar ambas cajas a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y
analizar los resultados. Refrigerar a 4 C las cajas.
9. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes, es decir aquellas que presentaron
la resistencia a ambos antibiticos.
40
0141 Bioqumica experimental 2013
Figura 4.1. Esquema experimental de conjugacin bacteriana. Produccin de una cepa transconjugante a partir
de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la informacin
gentica para la resistencia a kanamicina. No olvidar hacer los testigos.
Cuestionario
1. Qu es un plsmido?
2. Cules son los mecanismos de transferencia horizontal de material gentico en
bacterias?
3. Qu es la conjugacin?
4. Qu diferencia existe entre la conjugacin y los otros mecanismos de transferencia
horizontal de material gentico?
5. Cules son las principales caractersticas del plsmido F y qu genes contiene?
6. Cules son los genes del plsmido F necesarios para la transferencia de material
gentico por conjugacin y para qu codifican?
7. De acuerdo al plsmido F cuntos tipos de cepas bacterianas se conocen? y qu
diferencia existe entre ellas?
8. Seale qu tipo de transconjugantes se obtienen en cada una de las siguientes
cruzas:
a) F+ X F-
b) F X F-
c) Hfr X F-
9. Qu caractersticas tienen las cepas empleadas en la prctica?
10. Por qu tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de seleccin?
41
0141 Bioqumica experimental 2013
11. Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la prctica en las cajas controles con
antibiticos? Por qu son importantes estas cajas control?
12. Por qu se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con
estreptomicina como kanamicina? Qu resultados se obtuvieron en esas cajas?
13. Cmo se comprob la conjugacin en la prctica? Qu porcentaje de bacterias
transconjugantes se obtuvo?
14. Cul es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la prctica?
15. Qu diferencias existen entre un plsmido conjugativo y uno movilizable?
16. La conjugacin puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o slo ocurre en
las bacterias Gram negativas?
17. Con qu frecuencia y dnde se realiza la conjugacin en forma natural?
18. Cul es la importancia biolgica de la conjugacin?
19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los
antibiticos utilizados en la prctica.
20. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los
conceptos adquiridos al realizar esta prctica?
Referencias
Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp
467.
Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272.
Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el
opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
42
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos
Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas.
Realizar la tcnica de transformacin bacteriana.
Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo.
Conocer la definicin de organismo transgnico.
Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.
Informacin previa
En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.2, que
contiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la
tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que
las clulas son transformantes.
Figura 4.2. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA -lactamasa. El vector pET24a (Figura 4.3) fue utilizado para la
construccin del vector pET-TEM-1. Se insert el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin
mltiple del vector pET24. El transgene, ompA- lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa.
Para insertarlo se adicion el sitio de retriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen la secuencia
que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias,
en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia
seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector
pET-TEM-1-ompA -lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a kanamicina ya que el plsmido contiene
un gene que confiere la resistencia a ese antibitico en particular.
Material biolgico
1 tubo de microcentrfuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo
mantenerlas congeladas hasta su uso.
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo
mantenerlas congeladas hasta su uso.
43
0141 Bioqumica experimental 2013
Materiales y equipo
2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL)
Tubos de microfuga de 1.5 mL
Varilla de vidrio en forma de L
Recipiente para hielo
Mechero Bunsen
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 10-100 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Reactivos
Medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression). Medio que se prepara
utilizando el medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa.
Desarrollo experimental
Las clulas competentes se proporcionarn congeladas. Al final de este protocolo
experimental se describe la tcnica para su preparacin.
Preparativos
1. Revisar y/o equilibrar el bao de incubacin a 42 C.
2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente.
3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37 C por 30
min antes del plaqueo.
44
0141 Bioqumica experimental 2013
7. Si la turbidez del medio es escasa, concentrar las clulas por centrifugacin a 14,000
rpm por 1 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 L
de medio SOC.
8. Esparcir los 100 L de las bacterias transformadas en las cajas con el medio de
seleccin (Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.
9. Incubar a 37 C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4 C.
10. Como control negativo incubar 100 L de clulas competentes en una caja con LB-
kanamicina por 24 h a 37 C.
11. Calcular la eficiencia de la transformacin, para lo cual se necesita conocer la
concentracin del DNA usado para la transformacin, el volumen aadido a la mezcla
de transformacin, el volumen usado para el plaqueo y el nmero de colonias
obtenidas.
Cuestionario
1. Qu es un organismo transgnico?
2. Qu es un vector de clonacin?
3. Cules son los requisitos que debe cumplir un vector de clonacin para ser utilizado
para transformar a un organismo?
4. Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonacin de fragmentos
de DNA de alto peso molecular
5. Qu tipo de vector de clonacin es el pET24?
6. Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica?
7. Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas, ya sea de animales,
hongos o plantas.
8. Para realizar la transformacin de clulas, adems del vector de clonacin se
necesitan las clulas receptoras, qu tipo de clulas receptoras son las E. coli DH5
y las clulas E.coli BL21?
9. Cul es el marcador de seleccin de las cepas transformantes y dnde se encuentra
codificado?
10. Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se
deben tener para su manipulacin o almacenamiento?
Referencias
Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localizacin QP514.2
Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring Harbor
Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442.
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. QH345 L43
Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein science.
A.4D.1-A.4D.2.
Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of
TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression
& Purification 19: 235-45.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Revert, pp.745-773.
http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinacin de eficiencia de la transformacin)
45
0141 Bioqumica experimental 2013
Inocular 3 mL de medio Luria con E. coli BL21 y se deja crecer en agitacin toda la
noche a 37 C.
Tomar 0.2 mL del precultivo y agregrselo a 10 mL de medio Luria. Las bacterias
se dejan crecer hasta llegar a una absorbencia de 0.6 a 0.8 (lectura a 600 nm).
Centrifugar la suspensin de clulas a 5000 rpm durante 5 min a 4 C. Descartar
sobrenadante.
Resuspender el paquete celular muy bien en 3 mL en solucin 10 mM NaCl fro.
Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min a 4 C. Descartar el sobrenadante y
resuspender el precipitado en 5 mL de 30 mM CaCl2 fro.
Dejar incubando en hielo por 20 min con agitacin ocasional suave y centrifugar a
2500 rpm por 7 min. El precipitado debe ser de forma anular.
Resuspender el precipitado en 0.5 mL de 30 mM CaCl2 fro. Tomar 0.2 mL y pasarlo
a un tubo microfuga.
Almacenar a -80 C hasta su uso.
46
0141 Bioqumica experimental 2013
Material biolgico
Clulas de E. coli transformante obtenidas en la prctica anterior.
Materiales y equipo
Tubos para microfuga
Recipiente para hielo
Microcentrfuga
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L
Reactivos
Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 g/mL)
Solucin GTE: 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
3 M Acetato de potasio pH 4.8
70% Etanol
Isopropanol
10 N NaOH
10% SDS
Para preparar 500 L de solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 L de
10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo
deber prepararla justo antes de usarla.
47
0141 Bioqumica experimental 2013
cultivo se acabe el cultivo. De tal manera que el paquete celular de los 5 mL quede
en un solo microtubo.
3. Resuspender el paquete celular en 300 L de solucin GTE fra, agitando en el vrtex.
Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solucin de lisis durante
este tiempo de incubacin.
4. Adicionar 300 L de la solucin de lisis. Mezclar suavemente por inversin del tubo.
IMPORTANTE: no agitar en el vrtex. Incubar en hielo por 5 min.
5. Agregar 300 L de la solucin fra de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar
suavemente por inversin del tubo. Incubar en hielo por 5 min.
6. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. a 4 C.
7. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de
isopropanol fro.
8. Incubar por 20 min a -20 C.
9. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4 C.
10. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA aadir 1 mL de etanol al 70% y
centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min.
11. Remover el sobrenadante por decantacin y eliminar el etanol residual por
evaporacin a temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min).
12. Resuspender el DNA en 30 L de agua estril, guardar a 20 C.
Investiga:
El fundamento de la determinacin espectroscpica a 260 nm de la concentracin de
cidos nucleicos.
48
0141 Bioqumica experimental 2013
Figura 4.3. Protocolo de obtencin de DNA plasmdico a partir de las clulas transformantes que se obtuvieron en
la prctica anterior.
49
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Cules son las propiedades del DNA plasmdico que nos permiten separarlos del
DNA cromosomal o genmico?
2. Explica por qu se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificacin de
plsmidos.
3. Cules son los principales contaminantes de una preparacin de plsmidos?
4. Cmo los eliminas?
5. Cules son los usos que se le dan a los plsmidos una vez purificados?
6. Cules son los mtodos utilizados para cuantificar los cidos nucleicos?
7. Qu experimento realizaras para determinar si el plsmido que obtuviste se
encuentra puro?
8. Porqu a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmdico?
9. Busca el factor de conversin de pares de bases a nmero de aminocidos y de
nmero de aminocidos a peso molecular de protena en kDa.
Referencias
Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences &
2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin,
WH Freeman.
Objetivos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de
agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de
agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la
biotecnologa.
En la prctica se utilizarn dos enzimas de restriccin en una mezcla. Esto se debe a que el
vector utilizado en la transformacin (Figuras 4.3 y 4.4) tiene dos sitios de restriccin para
enzimas diferentes, de manera que slo se podr liberar el fragmento de DNA de inters al
cortar por los extremos con las dos enzimas que reconocen dichos sitios.
Material biolgico
DNA plasmdico purificado de la prctica anterior.
Materiales y equipo
Recipiente para hielo
50
0141 Bioqumica experimental 2013
Reactivos
NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20 C.
BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20 C.
NOTA. Las enzimas de restriccin son muy sensibles a la temperatura,
mantenerlas en fro durante su manipulacin.
Amortiguador TANGO de restriccin viene con las enzima de restriccin. Reactivo que
es proporcionado por el proveedor junto con la enzima NdeI.
TAE 1X (Tris-Acetato-EDTA). Para preparar TAE 50X pesar 24.2 g Tris base, 5.71 mL
cido actico glacial y 1 mL de 0.5 M de EDTA (pH 8) y se afora con agua a 100 mL;
se diluye a 1X justo antes de usar.
Agarosa
Amortiguador de muestra para cidos nuclicos (0.25% azul de bromofenol, 0.25%
xilencianol FF y 3% de glicerol; se almacena 4 C)
Estndar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizar de acuerdo
a las instrucciones del proveedor.
Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)
Desarrollo experimental
Ensayo de restriccin
1. Etiquetar dos tubos de microfuga.
2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de Plsmido y 1 L de
Amortiguador Tango10X
3. Incubar a 100 C por 5 min.
4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.
5. Pasado el tiempo de incubacin, aadir al tubo 1 nicamente una de las dos enzimas
de restriccin que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1
51
0141 Bioqumica experimental 2013
52
0141 Bioqumica experimental 2013
53
0141 Bioqumica experimental 2013
6. Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y
negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que
las muestras migren hacia el lado positivo de la cmara.
7. Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la
observacin de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado
sobre una lmpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin
ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrlico
entre el observador y la fuente de luz UV.
8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si es que
estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.
Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las
bandas de DNA detectadas. Construir la curva de estndares de peso molecular y
Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as como del
vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que
se encuentran en la parte inferior de la tabla 4.1.
9. Analizar los resultados.
Cuestionario
54
0141 Bioqumica experimental 2013
Referencias
Objetivos
Conocer el fundamento de la induccin de la sntesis de protenas recombinantes en
E. coli
Realizar la induccin de una protena recombinante ( -lactamasa)
Obtener la curva temporal de induccin de una protena recombinante
Interpretar el patrn electrofortico de produccin de una protena recombinante
Conocer las aplicaciones biotecnolgicas de las protenas recombinantes
Material y equipo
1 mechero
1 recipiente para hielo
Tubos para microfuga de 0.5 mL
Micropipeta de 2 a 10 L
Micropipeta de 20 a 200 L
Micropipeta de 200 a 1000 L
1 caja de puntas de 10 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
55
0141 Bioqumica experimental 2013
Reactivos
1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL)
100 mM IPTG (isopropil--D-1-tiogalactopiransido, anlogo no hidrolizable de la
alolactosa, inductor de la expresin de protenas recombinantes)
Estndar de peso molecular de protenas
Reactivos para preparacin de geles de poliacrilamida-SDS, corrimiento y tincin (ver
seccin II del manual)
1 mL de LB para ajustar a cero el espectrofotmetro
Desarrollo experimental
Induccin de protena recombinante, -lactamasa (Figura 4.6).
1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de clulas de E. coli transformadas con el vector
PET-TEM-1-ompA -lactamasa, y aadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina.
2. Tomar una alcuota de 1 mL de la mezcla del paso 1 y leerla en el espectrofotmetro a
600 m contra un blanco de medio Luria (la absorbancia debe ser menor a 0.3).
Registrar la absorbancia.
3. Incubar los tubos con agitacin vigorosa a 37 C (colocarlos en posicin diagonal para
que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre
0.6 a 0.8.
4. Para verificar que se lleg a la absorbancia indicada, tomar una alcuota de 1 mL y
leerla en el espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si an no
llega volver a incubar el matraz con agitacin vigorosa.
5. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alcuota a la que llamaremos tiempo 0
(mantener en hielo el tubo de microfuga).
6. INICIO DE LA INDUCCIN. Agregar el IPTG para tener una concentracin final en el
tubo de 1mM. El volumen del medio con clulas puede variar, dependiendo del
nmero de alcuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia
corresponde a 0.6-0.8. Hacer el clculo tomando en cuenta el volumen final de medio
con clulas.
56
0141 Bioqumica experimental 2013
57
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Menciona las diferencias entre las clulas de E. coli DH5 y las clulas E. coli BL21
2. Qu es una protena recombinante?
3. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes
de comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante?
4. Cul fue el tiempo en el que produjo la mxima cantidad de protena recombinante?
5. Qu otros parmetros se podran modificar para obtener el mayor rendimiento de la
protena?
6. Qu son los cuerpos de inclusin?
7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma
soluble o en forma agregada?
8. Qu mtodo propondras para purificar a la protena recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de
manera comercial, explicando sus usos.
Referencias
Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors in
Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442.
Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for biotechnology
education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in Protein
Science 5.1.1-5.1.8.
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor
Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment
of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein
Expression & Purification 19: 235-45.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John
Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.
58
0141 Bioqumica experimental 2013
Objetivos
- Comprender la importancia de la regulacin gentica como mecanismo para controlar
los niveles de enzimas en la clula.
- Conocer los elementos que integran el opern de la lactosa.
- Entender el funcionamiento del opern de la lactosa en presencia y ausencia de este
carbohidrato.
- Conocer el concepto de represin catablica y cmo se lleva a cabo.
Material biolgico
Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.
Reactivos
1 tubo con medio M9-glicerol estril. El medio M-9 glicerol contiene una mezcla de
sales y glicerol: 0.3 % Na2HPO4, 0.5 % KH2PO4, 0.5 % NaCl, 0.1 % NH4Cl, 1 mM
MgSO4, 0.1mM CaCl2 y 0.2 % glicerol.
Solucin de glucosa al 2% estril
Solucin de lactosa al 2% estril
Solucin de glucosa 2% + lactosa 2% estril
Amortiguador Z (60 mM Na2HPO4-7H2O, 40 mM NaH2PO4-H2O, 10 mM KCl, 1mM
MgSO4 7H2O, 50 mM -mercaptoetanol, pH 7.0).
Reactivo ONPG (0.1%Orto-Nitrofenil Galactosa disuelto en amortiguador Z). El
reactivo es incoloro y debe prepararse justo antes de usarse para mejores
resultados.
SDS al 0.1%
Na2CO3 1M
Cloroformo
Desarrollo de la prctica (Figura 5.2)
Slo los pasos 1 al 4 requieren condiciones de esterilidad.
59
0141 Bioqumica experimental 2013
1. Colocar 1 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 microtubos estriles y
rotularlos de la A a la D. El tubo E no contendr clulas, sino 1 mL de medio M9-
glicerol como E (blanco).
2. Aadir a cada tubo lo siguiente:
3. Incubar los tubos durante 15 minutos a 37C con agitacin ocasional. A los 7.5
minutos de incubacin aadir, nicamente al tubo D, 250 L de lactosa 2% y
reintegrarlo a la incubadora a 37C.
4. Cuando hayan transcurrido los 15 minutos de incubacin, centrifugar los tubos en la
microfuga a 10,000 rpm durante 1 minuto.
5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 250 L de amortiguador Z.
6. Aadir a cada tubo 25 L de cloroformo y 12.5 L de SDS 0.1%. Agitar durante 10
segundos.
7. Aadir a cada tubo 50 L de reactivo ONPG y agitar.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos o hasta el desarrollo de color
amarillo.
Nota: monitorear la aparicin del color amarillo y no dejar que el color se iguale
en todos los tubos, parar la reaccin una vez que se vean diferencias de color
entre los diferentes tubos.
9. Parar la reaccin con 125 L de Na2CO3 1M.
10. Anotar cules tubos desarrollan color amarillo y con qu intensidad (se pueden utilizar
cruces, por ejemplo + para un tubo con poca intensidad de color y ++++ para el tubo
con mayor intensidad).
11. Para un resultado cuantitativo se puede leer la absorbencia de la solucin a 420 nm.
12. Analizar y reportar los resultados obtenidos.
60
0141 Bioqumica experimental 2013
61
0141 Bioqumica experimental 2013
Cuestionario
1. Qu es la regulacin gentica?
2. Cules son las diferencias entre la expresin gentica constitutiva, la inducible y la
represible?
3. Cmo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresin gentica?
4. Cmo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresin gentica?
5. Investiga qu reacciones catalizan las enzimas del opern de la lactosa.
6. Qu son un activador y un inductor?
7. Qu son un represor y un co-represor?
8. Qu es un opern y cules son sus componentes?
9. Cul es la estructura del opern de lactosa de E.coli?
10. Cmo funciona este opern en ausencia y en presencia de lactosa?
11. Qu es la represin catablica y cmo se ejerce este proceso sobre el opern de
lactosa?
12. Por qu la bacteria utilizada en la prctica fue cultivada inicialmente en medio M9-
glicerol?
13. Para qu se utiliza cada reactivo de la prctica?
14. Explica qu ocurre en los tubos A-E en la prctica.
15. Qu reaccin es responsable del color amarillo observado en los tubos?
16. Qu ocurrira si a los tubos B y C se agregara ATP?
17. Cul ser el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada uno de los
siguientes mutantes del opernlac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc? Explica por qu.
18. Qu diferencias existen en la regulacin de una va metablica como la de la
degradacin de la lactosa y una va anablica, como la de la sntesis de triptfano?
19. Qu importancia tiene la regulacin de la expresin gentica en procariontes?
20. Cules son las principales diferencias en la regulacin gentica entre procariontes y
eucariontes?
21. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los
conceptos adquiridos al realizar esta prctica?
Referencias
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene
expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localizacin
QP514.2
Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-
407. Localizacin QH581.2 M 65
Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el
opernlac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp.
51-71.
Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125.
Localizacin QH581.2 M 65
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.
62