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Salmonella PDF
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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para Optar el Ttulo de
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia
3
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIN Y SEROTIPIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
APROBADO
______________________________ ______________________________
Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarn MV. Carlos Alfonso Moreno Torres
Director. Revisor Consultor
Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia
______________________________ ______________________________
MV. MS.c. Rubiela Castaeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos
Jurado Jurado
Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.
4
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIN Y SEROTIPIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
APROBADO
______________________________ _____________________________
INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P.
Decana Acadmica Directora
Facultad de Ciencias Carreras de Microbiologa
5
A Dios por llenarme de bendiciones cada da y llevarme de su mano por el camino que
me permitir alcanzar todos mis objetivos.
A mi padre por que desde el cielo me ha acompaado durante todos estos aos, por su
ejemplo de entereza, sabidura y fortaleza.
A mi hermano por su apoyo, confianza y compaa durante todos los aos de mi vida, a
mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y
perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida.
A Javier por acompaarme durante todo este proceso, brindndome apoyo en los
momentos difciles y por infundirme paciencia cuando cre que esto no sera posible.
6
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Adriana Pulido Villamarn, por haberme dado la confianza para la realizacin de
este proyecto, por su dedicacin, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos
sus conocimientos para la realizacin de este trabajo.
Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para
concluir con xito este trabajo.
ENERO DE 2009
7
TABLA DE CONTENIDOS
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1. INTRODUCCIN 17
2. MARCO TERICO 19
2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19
2.2. GNERO Salmonella 20
2.2.1. Caracterizacin morfolgica y bioqumica 21
2.2.2. Clasificacin taxonmica 22
2.2.3. Estructura Antignica 22
2.2.4. Factores de virulencia 24
2.2.5. Patognesis y patogenicidad 24
2.2.6. Salmonelosis 27
2.2.7. Diagnstico 27
2.2.7.1. Mtodos de aislamiento de Salmonella sp. 28
2.2.7.2. Identificacin bioqumica 34
2.2.7.2.1. Diagnstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35
2.2.7.3. Serotipificacin 37
2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38
2.2.8. Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 39
2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40
2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41
2.2.8.2.1. Principios del mtodo de difusin en agar (Kirby-Bauer) 41
2.2.8.2.2. Interpretacin de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por
el mtodo de difusin en agar. 42
2.2.8.2.3. Seleccin de los agentes antimicrobianos 42
2.3. EL GNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43
2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47
2.4.1. Caimn del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47
2.4.2. Testudinos 48
2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 51
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA 51
3.2 JUSTIFICACIN 52
4. OBJETIVOS 53
4.1 OBJETIVO GENERAL 53
viii
8
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9 ix
NDICE DE TABLAS
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10x
INDICE DE FIGURAS
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xi
11
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Figura N 12. Lectura de pruebas de identificacin Crystal para
microorganismos entricos/no fermentadores. 63
xii
12
Figura N 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83
xiii
13
NDICE DE ANEXOS
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Anexo 3.2. Ficha tcnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109
xiv
14
RESUMEN
Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al gnero Salmonella han sido
reportadas como patgenos para humanos y animales tanto domsticos como silvestres;
aunque tambin hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de
tortugas.
Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la
poblacin muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de
agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el
100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que
microorganismos del serogrupo C2 fueron los ms prevalentes (41,4%) y conscientes del
riesgo zoontico se dio inicio a la implementacin de un manual de bioseguridad para la
estacin y as prevenir todo riesgo para la poblacin animal y humana.
15
ABSTRACT
Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild;
in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles.
The Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is
part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the
Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and
also bill with an alive collection of Testudinos of different families.
Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of
the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and
genetics.
16
1. INTRODUCCIN
Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afeccin de tejidos y fluidos
por generar un bloqueo de los vasos sanguneos, edema, ulceraciones, necrosis,
17
disminucin de actividad, prdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitacin,
diarrea, constipacin y letargia. (Jertborn et al 1990).
Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es
constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que
tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo
con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los
programas de recuperacin debido a enfermedades asociadas al enteropatgeno;
adems, parece ser que en los centros donde los reptiles estn en condiciones de
cautividad, hay ms posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre (Ramsay
Lewbart, 2006)
18
2. MARCO TERICO
aunque menos de la mitad tienen inters desde el punto de vista veterinario (Stanchi, 2007).
20
con el patgeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminacin ambiental es
invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007).
Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubacin
o
por 18 a 24 horas a 32 C son de 2 a 3 mm de dimetro salvo algunos serotipos que
producen colonias pequeas; con algunas excepciones no presentan cpsula (Smith et al.
1952; Suter 1956). Los miembros del gnero Salmonella crecen en un amplio rango de
o
temperaturas (7 - 28 C), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son
incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada
durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005).
2003).
21
2.2.2. Clasificacin taxonmica
La ms reciente clasificacin del gnero Salmonella est basada en estudios realizados
sobre la base de tcnicas de hibridacin del DNA de la bacteria y se ha concluido que
ste est conformado por dos especies:
1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de:
Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas
segn su hibridacin de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se
encuentran constituidas por ms de 2400 variedades serolgicas, determinadas segn
las distintas asociaciones de los antgenos somticos O y flagelares H (Stanchi, 2007).
Tambin puede hacerse una clasificacin de las salmonelas desde el punto de vista
epidemiolgico en tres grupos:
22
gneros. Al estar este antgeno relacionado con la virulencia de las cepas se le
denomina Antgeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinacin por
antisueros O y que se relacionan con invasividad (Jawetz et al, 2005).
y Schott, 1982). Por lo general, los microorganismos que tienen este antgeno, poseen
dos fases diferenciables por medio de aglutinacin en tubo de ensayo (Stanchi 2007; y
Terragno et al, 2003); esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase
1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria.
En el primer caso (H1), lo ms relevante es que se trata de un Ag especfico de
especie (segn Kauffmann y White) y su sntesis reside en el gen hag1, que slo se
expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es
compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su
produccin es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores
al inicio del desarrollo. La mayora de las cepas del gnero Salmonella pueden
expresar las dos especificidades de su antgeno H (difsicos), sin embargo existen
algunas que logran expresar solamente uno (monofsicos) (Parra et al. 2002). Cada
Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antgenos mediante un
mecanismo denominado cambio de fase (Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952).
23
minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de
aglutinacin con el Ag somtico correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De all
que la expresin de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo
necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresin tenga lugar (Parra et
al. 2002).
Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacridos de superficie celular
(O) y el antgeno Vi, un polisacrido capsular compuesto de cido N-acetilglucosamin-
urnico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas
reactivas de oxgeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antgeno Vi
son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antgeno (Parry et al. 2002).
24
los fagocitos como la destruccin por la accin del complemento, lo cual facilita la
difusin de las salmonelas en el organismo del hospedador (Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al.,
1952).
1952. y Quinn et al, 2002). Algunos factores que determinan el carcter patgeno de ciertas
especies del gnero Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en
las que se denominan genricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes
relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patgenos pero que
estn ausentes o solo presentes de forma espordica en las especies saprfitas (Vadillo et al
La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes
de virulencia (Salyers y Whitt, 2002):
25
Las clulas blanco revisten el ltimo tramo del intestino delgado y el primer tramo del
intestino grueso; si la clula blanco est libre con respecto al nmero de salmonelas, es
posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del gnero Salmonella
segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que
la enfermedad generada sea diarreica o septicmica. Las cepas que producen diarrea se
multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolbil) que altera la
sntesis de los nucletidos cclicos, haciendo que el microorganismo invada la clula, ya
en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su
desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y lquido
hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990) La
gravedad de la enfermedad depende del nmero de clulas blanco afectadas (Blaser y
7
Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Aproximadamente 10 organismos viables son
requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales,
se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie (Blaser y Newman 1982); en
animales, los sntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompaada de
seales de muerte celular (sangre, restos de clulas y clulas inflamatorias) (Biberstein y Chung
Zee 1990).
Las cepas de Salmonella sp. son relativamente hidrfilas, debido en parte a la fraccin
de carbohidratos del LPS que provoca su repulsin de la membrana de las clulas
fagocitarias, la cual es relativamente hidrfoba; las salmonelas que son fagocitadas no
son destruidas fcilmente porque en el animal el contenido de los lisosomas del
macrfago no atacar con facilidad a las salmonelas que se encuentran en el interior del
fagosoma, debido a que las bacterias sintetizan enzimas que tienen la capacidad de
26
neutralizar las que son producidas por el fagosoma (Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee 1990 y
2.2.6. Salmonelosis
Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del gnero
Salmonella sp. adquiridas por la ingestin de alimentos o bebidas contaminadas y
caracterizadas por presentar sndromes febriles asociados a manifestaciones
gastrointestinales sistmicas, con frecuencia severas (Saravia 2008). Las manifestaciones
clnicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan bsicamente bajo tres
modalidades las denominadas fiebres entricas, entre las cuales la ms comn es la
fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias
subespecies y la forma septicmica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones
focales (Saravia 2008). Dentro de las manifestaciones clnicas comunes est la fiebre
acompaada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales lquidas frecuentes, de
aspecto verdoso, ftidas, mucoides y en ocasiones con estras de sangre (Saravia 2008, Report,
1989,1993).
2.2.7. Diagnstico
Existe un gran nmero de mtodos diagnsticos diferentes que pueden realizarse para la
determinacin de Salmonella sp., sin embargo, segn la mayor parte de estudios
realizados, el cultivo microbiolgico es la prueba ms comnmente empleada para el
aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El mtodo ideal debe tener
una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rpido y econmico.
Ningn mtodo cumple con todos los criterios y ninguno es ptimo para todas las
condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y
algunas pruebas bioqumicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse tambin en los
nuevos mtodos de diagnstico que estn innovando para el aislamiento de Salmonella
sp. mediante el uso de pruebas serolgicas y moleculares como ELISA y PCR
respectivamente; esta ltima tiene la capacidad de detectar un pequeo nmero de
2 4
organismos del gnero Salmonella (10 a 10 ). Estos mtodos arrojan resultados
favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward
Chung Zee, 1990 y Stanchi 2007). Adems, es posible determinar la contaminacin de alimentos y
27
agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisin de una muestra al
laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnstico incluye
aislamiento, identificacin bioqumica y serotipificacin de las cepas aisladas (Stanchi 2007,
Luna 1991).
1994).
28
Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de
salmonelas con excepcin de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros
materiales. Mediante la utilizacin de este caldo, es posible obtener algunas
ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obtenindose un
o
rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43 C y
previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja
concentracin de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para
as obtener un mayor porcentaje de recuperacin de Salmonella sp. Adems la
reduccin del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964).
Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma
coliformes y otras bacterias acompaantes, sin alterar las bacterias reductoras de
tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares
que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia
obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970)
Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) segn Hajna: Favorece la
recuperacin de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y
Salmonella sp., pues en su composicin tiene triptona que acta como nutriente en
el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con accin bactericida para organismos
Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos
esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer,
evitando la acidificacin precoz del medio de cultivo a cargo de productos
metablicos cidos. Adicionalmente, la elevada concentracin de manitol sobre la
dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y
Salmonella sp. (Hurtado, 2001)
Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar
la recuperacin de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos
serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inculo es pequeo (S.
paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S.
treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977).
29
lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son
sales biliares (Stanchi, 2007).
30
Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioqumicamente las
bacterias por su actividad metablica. Poseen un sustrato, sobre el cual acta o no
la bacteria, y esa actividad se revela por variacin del pH del medio o por alguna
actividad enzimtica que modifica su aspecto. En el proceso de recuperacin de
Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa
en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la
observacin de colonias caractersticas y propias de la bacteria (Stanchi, 2007). Los
medios ms reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son:
Murray y Shea 2004). Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para
enterobacterias Hektoen an cuando posee suficiente efecto supresor de la flora
acompaante, ejerce escasa inhibicin de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo
tanto, permite la obtencin de altos rendimientos en estos grmenes (King y Meztger 1968,
Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina cida, las colonias
lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromtica frente a las colonias
lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan
lentamente la lactosa y ms fcilmente la sacarosa y la salicina, sustancias
reaccionantes fcilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patgenos
falsamente positivos. La combinacin de tiosulfato, como sustancia reaccionante y
una sal de hierro como indicador, da una coloracin negra a las colonias H 2S
positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompaante (Merck,1994, Murray y
Shea 2004).
31
el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formacin de
cido sulfhdrico por la precipitacin de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las
bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo
purpreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias (Merck,1994, Murray y Shea
2004)
32
comensales. Las colonias tpicas de Salmonella sp. pueden ser caf, gris o negras
con o sin brillo metlico, generalmente el medio circundante (halo) es caf que
posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la
formacin del halo oscuro (Murray y Shea 2004).
tm
f. AGAR XLT4 (DIFCO ): Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el
aislamiento e identificacin de microorganismos del gnero Salmonella excepto S.
enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955). El medio contiene peptona como fuente de
nitrgeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la
diferenciacin de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la
fermentacin de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilacin de la lisina y la
produccin de sulfuro de hidrgeno, la cual es detectada por la adicin de iones
frricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de
sulfuro inorgnico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico del medio y el
rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las
reacciones de fermentacin y decarboxilacin. Al medio base, es adicionado
suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos
diferentes a la Salmonella sp. Las colonias tpicas de la bacteria (H2S positivas),
aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro despus de 18 24
horas de incubacin. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de
pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con
centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen
de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayora de las colonias de Citrobacter
sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El
crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona,
Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter
calcoaceticus est completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella
son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja (Becton
Dickinson).
TM TM
g. BD BBL CHROMagar Salmonella : Es un medio selectivo y diferencial para el
aislamiento e identificacin presuntiva de especies de Salmonella sp, permitiendo la
diferenciacin de la enterobacteria de la flora acompaante dada la presencia de
sustratos cromgenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos
como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente
antifngico que previene el crecimiento de especies de Candida; otros agentes
antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gram
negativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus.
Debido a diferencias metablicas en la presencia de cromgenos seleccionados, las
33
colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa prpura, mientras que los
microorganismos pertenecientes a otros gneros se observan con pigmento verde
azulado, son completamente inhibidos (Gaillot, et al; 1999)
d
d
34
2.2.7.2.1. Diagnstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp.
2000).
LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de
decarboxilacin y deaminacin en el medio de cultivo tienen lugar con la previa
fermentacin del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por
esta reaccin, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la
decarboxilacin liberndose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de
cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efecta la
deaminacin y el producto final son cidos orgnicos que acidifican el medio de cultivo.
Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido prpura y fondo prpura, (K/K),
con produccin de H2S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa (Instituto Nacional
de Salud, 2003).
35
Produccin de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio
est en capacidad de desdoblar el indol de la molcula de triptfano; el indol es uno de
los componentes de la degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias
que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con
produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. La prueba se basa en la formacin de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-
dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich, utilizados para la identificacin de produccin de indol por parte de los
microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no
se presenta ninguna reaccin en el medio (MacFaddin 2000).
36
Tabla N 2. Resultados de las pruebas bioqumicas clave para la identificacin de
microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella sp. Fuente: Manual de pruebas
bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica (MacFaddin 2000)
B. Sistemas BBL Crystal de identificacin (Patgenos entricos/No fermentantes) :
El sistema de identificacin BBL Crystal de bacterias entricas/no fermentadoras (E/NF)
sirve para lel reconocimiento de bacterias gram negativas que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae as como tambin de los bacilos Gram negativos fermentadores y
no fermentadores de glucosa aislados con ms frecuencia (Muytjens et al, 1984).
Los anlisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF estn basados en la utilizacin y
degradacin de sustratos especficos por parte de los microorganismos detectados por
distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentacin detectan la capacidad de
un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxgeno atmosfrico, y las
reacciones de oxidacin estn basadas en la capacidad de un organismo para
metabolizar el sustrato siendo el oxgeno el aceptor final de electrones, ambas
reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el
sustrato del anlisis (Murray et al, 1999). Los sustratos cromgenos al sufrir hidrlisis producen
cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Adems, existen otros anlisis
que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de
otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal (Manafi et al, 1991). (Anexo N 3)
2.2.7.3. Serotipificacin
La serotipificacin constituye un importante complemento de la identificacin bioqumica
y desde el punto de vista epidemiolgico permite determinar la prevalencia de una
serovariedad en distintas zonas geogrficas, tambin es de utilidad para el estudio de
brotes y para conocer la fuente de infeccin y las vas de transmisin (Terragno et al, 2003).
Desde el punto de vista gentico, el gnero Salmonella sp. constituye una sola especie
siendo el grupo ms complejo de la familia Enterobacteriaceae (Biberstein y Chung Zee, 1990;
Crawford et al, 1971) dado que los representantes del gnero Salmonella sp. han sido objeto de
37
sucesivas modificaciones, a travs de los aos, en lo que respecta a su nomenclatura y
taxonoma. Sin embargo, todava siguen vigentes las ideas desarrolladas por Edwards y
Ewing, en la dcada del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del
gnero Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (Stanchi, 2007).
En el gnero Salmonella existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la
mayora de las salmonelas no producen cpsula (Hirsh 2006). La constitucin antignica de
la fraccin polisacardica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie;
asmismo, la clase y el nmero de azcares junto con los enlaces existentes entre los
mismos, definen los determinantes antignicos que contienen los antgenos O de un
determinado aislamiento; dichos antgenos O, junto con los determinantes antignicos
existentes en la superficie de los flagelos (antgenos H), que poseen la mayora de las
salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serolgico, a definir como especie un
determinado aislamiento. Este esquema de clasificacin se le denomina de Kauffmann-
White (Biberstein y Chung Zee, 1990)
2007).
38
Este esquema plantea las diferencias mediante la identificacin de los antgenos de
superficie que se producen en la bacteria. La especificidad del factor O (somtico) de
Salmonella sp. se determina por la composicin y la estructura de la cadena polisacrida
O del lipopolisacrido. Al antgeno O, se lo designa con nmeros; Salmonella sp. se
clasifica en serogrupos que surgen del antgeno somtico O; a estos grupos se los
designa con letras maysculas, por ejemplo, A, B, C 1, C2, D1, D2, E1, E2, etc. (Basualdo et
a. Tener una toxicidad selectiva para el agente infeccioso, lo que implica escasa o
nula toxicidad para las clulas del husped y alta para el patgeno.
b. Penetrar en los tejidos y las clulas del organismo para ejercer su accin sobre
el agente infeccioso.
39
c. Alcanzar la concentracin adecuada para ejercer su efecto en el foco de la
infeccin y que se excrete lentamente.
d. Poseer una accin ms bactericida que bacteriosttica. Los agentes bactericidas
matan a los microorganismos, y los bacteriostticos inhiben el desarrollo,
interviniendo los mecanismos de defensa del husped en la erradicacin final de
la infeccin.
e. No alterar los mecanismos de defensa naturales del hospedador (fagocitosis,
produccin de anticuerpos, entre otros).
f. No generar aparicin rpida de resistencia.
g. Poseer un amplio espectro de accin sobre los microorganismos que con mayor
frecuencia se aslan.
h. Permanecer activo en presencia de plasma, lquidos corporales, exudados.
i. Poseer actividad antibacteriana in vitro.
j. Ser estable para garantizar un periodo razonable de almacenamiento.
k. Ser econmicamente accesibles.
l. No producir efectos colaterales indeseables en el husped (Stanchi, 2007).
Los mtodos empleados, son entre otros, la difusin con monodiscos de antibiticos,
mtodo estandarizado por Kirby-Bauer, en el cual se emplea el agar Mueller Hinton,
nico medio validado por el NCCLS (Comit Nacional para la Normatizacin de
Laboratorios Clnicos) para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, dado que existen
suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad
realizadas en este medio (NCCLS, 1996). Otro mtodo realizado en laboratorio es la
determinacin de la concentracin mnima inhibitoria del antibitico (CMI), el cual se
realiza mediante la tcnica de dilucin en tubo, donde se preparan una serie de tubos
con medio de cultivo, cada uno a una concentracin diferente de antibiticos sembrados
con el microorganismo. Despus de la incubacin, se observa la mnima concentracin
de antibitico que inhibe el crecimiento del microorganismo (Escobar 2004 y Stanchi 2007). Estas
pruebas estn cuidadosamente estandarizadas con el objeto de mejorar el valor
predictivo clnico de los resultados. Desde 1958, el Comit Nacional de Estandarizacin
de Laboratorios Clnicos (NCCLS) estableci un Subcomit de Pruebas de
40
Susceptibilidad Antimicrobiana Veterinaria (VAST). Gracias al desarrollo de NCCLS-
VAST, se estn generando los criterios interpretativos de los agentes antimicrobianos
veterinarios especficos con el empleo de aislamientos animales (Stanchi 2007, Gentilini 2007).
42
resistencia, costo, indicaciones del FDA (Administracin de alimentos y Frmacos),
recomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativos (Pasteran et
al.,2003). Entre los antibiticos con actividad frente a Salmonella sp. se encuentran:
Aminopenicilinas (Ampicilina).
Cloranfenicol (slo para aislamientos de infeccin sistmica).
Tetraciclinas (Tetraciclina)
Trimetoprim/sulfametoxazol
Fosfomicina
Nitrofuranos
Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
Cefalosporinas de tercera generacin (cefotaxima/ceftriaxona solo para
aislamientos de infeccin sistmica)
43
sin embargo, estos animales son catalogados como portadores asintomticos de la
bacteria (Chiodini y Sulberg, 1981; Millan et al, 1997,; Mitchel y Shane, 2000; Abalem de S y Sorari, 2001; Geue y Lschner, 2002;
Corrente et al, 2004; Mermin et al, 2004), ya que segn estudios realizados, sta se ha encontrado en
90% o ms de la poblacin de reptiles evaluada (Chiodini y Suldberg, 1981, Woodward et al, 1997), pero
son relativamente pocos los reportes de cuadros patolgicos en estas especies silvestres
(Boever y Williams, 1975; Isaza et al, 2000; Oros et al, 1996; Oros et al, 1997).
Nasasai et al, 2005., Vadillo, et al, 2002), lo cual ha aumentado el inters de investigacin, por
representar grandes relaciones con la enfermedad diarreica aguda (EDA), puesto que
segn las estadsticas, para el ao 2000 (de acuerdo con un estudio realizado a partir de
muestras de aves y humanos) se present en el pas una tasa superior a los 1500 casos
de EDA por cada 100.000 habitantes, siendo aproximadamente el 50% de los casos,
relacionados con enterobacterias de los gneros Salmonella sp. y Shigella sp. (Jimenez y
Mayorga, 2000).
44
de transmisin de Salmonella sp. dado el gran incremento de la adopcin de estos
animales como mascotas (CDC, 1999: Schrter et al, 2004).
et al, 2005)
Hernandez, 2004) .
Adicionalmente, existen otros factores que afectan de manera negativa las especies
silvestres anteriormente mencionadas al estar implicados en la disminucin de la
poblacin a causa de alteraciones fsicas y/o patolgicas que se pueden presentar.
Centros de cra, proteccin y preservacin de la fauna silvestre (como la Estacin de
Biologa Tropical Roberto Franco) han dado a conocer las principales afecciones que
pueden presentarse en este tipo de animales siendo entre otras: dao renal por exceso
en la ingesta de protenas; fracturas de huesos mandibulares y maxilares por golpes en
peleas territoriales, mordeduras cuando toman el alimento y errores en la manipulacin
al ser capturados, alteraciones a nivel ocular, posiblemente por aguas contaminadas con
desinfectantes como hipoclorito, entre otras (Rodrguez y Ramrez 2000).
Minette 1984); se ha reportado que en reptiles, la invasin de las clulas del epitelio intestinal
y subsecuente colonizacin de los rganos internos parece no ser necesaria para el
establecimiento de una infeccin por Salmonella sp. (Pasmans et al, 2002). Aunque los reptiles
45
son portadores asintomticos y por consiguiente los casos clnicos de salmonelosis son
reportados con menor frecuencia, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas (CDC 1999, Chatfield et al, 2007; Durango et al, 2004; Muoz et
Las infecciones por Salmonella sp. son comunes tanto en animales homotrmicos como
en poiquilotermos entre los cuales existen diferencias significativas en el curso de la
infeccin. Mientras que en aves y mamferos las patologas son causadas por serotipos
de Salmonella entrica subespecie entrica, un gran nmero de serotipos de Salmonella
sp. han sido reportados asociados a los reptiles; entre ellos se incluye S. enterica
subsp. enterica, S. bongori, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S.
enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. Indica (Pignato et
al, 1998); siendo todas las especies causantes de infecciones persistentes pero sin producir
signos de salmonelosis clnica en la mayora de los casos (Zwart et al, 1970; Greenberd y Sechter, 1992).
46
importancia zoontica con respecto al mantenimiento como especies silvestres en
cautiverio en calidad de mascotas o por medio de su comercializacin (Hernandez 2004).
reportan que existen menos de 100 individuos distribuidos de forma natural. Todas estas
investigaciones le permitieron al gobierno nacional declararla en peligro de extincin;
actualmente la especie se encuentra protegida por un marco normativo a nivel nacional e
internacional. Rodrguez y Ramrez (2002) en el Libro Rojo de Reptiles de Colombia,
catalogan la especie en categora global CR (peligro crtico), como una poblacin
pequea y en disminucin con menos de 250 individuos maduros, con una rpida
reduccin en su tamao poblacional en extensin de presencia o rea de ocupacin
(Bejarano, 2001; Ramrez y Burbano, 2002). Tras la veda de la caza comercial las principales amenazas
para C. intermedius las constituyen: la fragmentacin de las poblaciones, la prdida de
hbitat, la caza que para protegerse de los animales ejercen los lugareos y, finalmente,
el asalto de los nidos para consumo humano de los huevos o para el comercio ilegal de
las cras (Ardila et al, 1999, Lugo, 1995). Adems, segn Boede y Sogbe (2000), la especie es
afectada por las siguientes enfermedades en individuos mantenidos en cautiverio en
zoocriaderos: anomalas congnitas e intoxicaciones en neonatos, avitaminosis por
deficiencias nutricionales, escoliosis, osteodistrofia, infecciones bacterianas, micticas,
virales, parasitismo, traumatismos y estados de shock en cras y juveniles, traumatismos
e hiperparasitoidismo nutricional secundario en adultos. En ocasiones se ha visto que
por ingesta de trozos de caucho y telas, se han producido muertes por ahogamiento.
47
Figura N 3. Caiman del Orinoco o Caiman Llanero (C. intermedius)
2.4.2. Testudinos
Colombia con sus 25 especies de tortugas continentales, dentro de las que se
encuentran las tortugas acuticas, semiacuticas y terrestres (Figura N 4), constituye
uno de los pases ms ricos en Testudinata de la Regin Neotropical, ya que posee casi
la mitad de las 53 especies de tortugas de la regin (Ceballos, 2000). Sin embargo, la situacin
de estas tortugas es altamente preocupante dado que al menos 14 especies enfrentan
un alto riesgo de extincin y se encuentran incluidas dentro de las categoras de
amenaza de la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (2000) debido
a la sobreexplotacin de manera intensiva, degradacin de hbitats a tal punto que
muchas de ellas han desaparecido en vastos sectores de distribucin natural o se hallan
confinadas en hbitats incapaces de sustentar poblaciones saludables (Boyer y Boyer, 1996).
Durante muchos aos las especies de tortugas continentales han sufrido una fuerte
disminucin en sus poblaciones por varias causas, principalmente antrpicas: consumo
de huevos y carne, uso del caparazn para la fabricacin de artesanas, captura
accidental en redes de pesca y palangres, contaminacin y destruccin del hbitat de
alimentacin y de desove (National Research Council, 1990). Poco se conoce sobre el impacto de
las enfermedades infecciosas bacterianas en las poblaciones de tortugas en estado
natural y sobre el papel que varios microorganismos puedan desarrollar como agentes
patgenos (Glazebrook y Campbell 1990b).
48
Figura N 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F (Morroco
Amar Geochelone denticulata)
Glazebrook et al. 1993). Sin embargo, se conoce que muchos microorganismos pueden ser
causa de elevada mortalidad en otras especies de animales acuticos de vida libre (Medway
1980, Ghittino et al. 1984, Gulland 1999). Adems, muchas de estas bacterias son patgenas para los
humanos. Segn Santoro et al (2006); Aeromonas sp. es el microorganismo ms
frecuentemente aislado, seguido de Citrobacter freundi, Salmonella sp, Acinetobacter sp.
y Pseudomona aeruginosa .
Aeromonas sp., Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus sp.,
Acinetobacter sp., Citrobacter sp., son bacterias potencialmente patgenas, que pueden
portarse como oportunistas, ingresar en los tejidos daados por traumas o aprovechar
las condiciones de estrs causando enfermedades graves. Estas bacterias en reptiles en
cautividad, han sido asociadas a enfermedad cutnea septicmica ulcerativa, dermatitis
papilar, dermatitis focal erosiva, dermatitis ulcerosa traumtica, dermatitis necrosante,
estomatitis ulcerosa, rinitis obstructiva, queratoconjuntivitis, septicemia, bronconeumona
y osteomielitis (Draper et al, 1981, Lauckner, 1985; Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook et al.1993, Dickinson et al, 2001).
Por su parte, existen ms de 2300 serotipos de Salmonella sp. , muchos de los cuales
fueron encontrados en reptiles silvestres y en cautiverio (Mermin et al. 1997), y algunos de estos
en quelonios marinos (Keymer et al. 1968; Keymer 1978; Glazebrook y Campbell 1990a; Raidal et al. 1998; OGrady y
Krause 1999). Estos microorganismos son conocidos como oportunistas principalmente por
49
generar cuadros de enfermedad cuando los hospederos estn debilitados y
ocasionalmente son identificados como agentes causales de gastroenteritis en los seres
humanos por consumo de carne de los animales portadores o contacto directo con heces
de los mismos (OGrady y Krause 1999). Se considera actualmente que los reptiles son fuente de
transmisin de Salmonella sp. (Johnson-Delaney 1996). En reptiles terrestres, coliformes y
Enterobacter sp. son asociados a enfermedades locales y generales (Hoff et al. 1984; Glazebrook y
Campbell 1990a). Proteus mirabilis y Bacillus sp. son considerados saprfitas y parte de la
flora normal que se encuentra sobre la piel de los reptiles (Glazebrook y Campbell 1990a, Shotts, 2001).
Los estudios de la flora bacteriana en animales de vida libre son de fundamental
importancia pues permiten conocer el papel que tienen estos microorganismos en las
enfermedades infecciosas y como afectan la supervivencia de las poblaciones de
tortugas en condiciones naturales dentro del equilibrio biolgico de estos vertebrados.
Considerando que el nmero de los microorganismos resulta mayor en reptiles con
inestable estado de salud, este aspecto puede ser utilizado como un importante ndice
para identificar grupos de animales inmunosuprimidos o enfermos, evaluando la flora
bacteriana de una poblacin durante varios aos. En fin, el conocimiento de la flora
normal de animales silvestres es importante para entender los riesgos potenciales de la
zoonosis (Santoro et al., 2006).
50
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
En los reptiles, Salmonella sp. hace parte de la flora intestinal normal, por lo cual estos
animales son catalogados como portadores asintomticos del microorganismo. Sin
embargo, la enterobacteria al tener un comportamiento de parsito intracelular, es
oportunista y puede llegar a causar afecciones en los ejemplares donde se presentan
altos niveles de inmunosupresin debido a las condiciones del cautiverio, situacin que
es aprovechada por el microorganismo para la colonizacin de rganos internos
causando serias patologas en los animales incluso bajo ciertas condiciones llegando a
producir la muerte de los mismos. (Chiodini y Sulberg 1981; Millan et al. 1997; Mitchel y Shane 2000; Boever y
51
3.2. JUSTIFICACIN
El caimn llanero (Crocodylus intermedius) es una especie declarada en peligro de
extincin; a partir de la resolucin 0676 del 21 de julio de 1.997 emitida por el Ministerio
del Medio Ambiente, las acciones se han dirigido a la elaboracin de un programa
general de conservacin producto de la concertacin de todas las Instituciones pblicas
o mixtas con incidencia directa y/o indirecta tanto en los relictos poblacionales existentes
como en los territorios sealados como hbitats tradicionales de la especie. Por su parte,
las tortugas constituyen el segundo grupo de vertebrados tetrpodos ms amenazados
en Colombia, ya que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas
publicadas por la UICN, mas de la mitad de las especies registradas en nuestro pas (19
de 32 (taxones), poseen algn riesgo de desaparecer en un futuro cercano, si no se
adoptan medidas efectivas para su proteccin, manejo y conservacin. Es por ello que
esta investigacin pretende en primer lugar y con una visin conservacionista, establecer
cientficamente si la Salmonella sp. puede estar afectando a los ltimos ejemplares en
cautiverio que existen en Colombia y que son el soporte gentico con el que cuenta
nuestro pas para evitar su extincin; en segundo lugar y dada la implicacin que tiene
esta bacteria en la salud pblica, se busca establecer con precisin la presencia de este
enteropatgeno en tortugas que tambin se investigan en la Estacin Roberto Franco,
ejemplares donde la literatura reporta que esta bacteria puede hacer parte de la flora
normal, constituyndose en una fuente potencial de contagio para los caimanes y el
personal que labora en la Estacin. Una vez conocida la situacin real de la presencia
de este patgeno en los reptiles ser posible establecer medidas de control ms
pertinentes, enfocadas al establecimiento de la buena salud animal y humana.
52
4. OBJETIVOS
53
5. METODOLOGA
54
Tabla N 3: Especies de Testudines y Crocodylia muestreadas y nmero estanques y
ejemplares muestreados para cada caso
Especies N N
Nombre Cientifico Nombre comn Estanques Ejemplares
Muestreados Muestreados
Caimanes 25 227
Tortugas 27 342
Rhinoclemmys funerea 1 1
Kinosternon sp Tapaculo 1 3
55
5.3.1. Obtencin de muestras por hisopado cloacal
56
Figura N 6. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Crocodylus intermedius
neonatos.
57
A. B.
C.
FIGURA N 7. Muestreo de Agua y Sedimento de los Estanques. A y B. Muestreo en los
estanques de Tortugas y Crocodylia neonatos. C. Muestreo en estanques de Crocodylia
Adultos y Juveniles
58
Figura N 8. Toma de muestra: Arena y materia fecal encontrada en los encierros de los
ejemplares en estudio.
A B
Figura N 9. Identificacin de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de
cultivo selectivos. A. CRHOMagar Orientacin, B. Agar MacConkey
Una vez detectadas las colonias sospechosas de Salmonella sp., fueron recuperadas y
BD
aisladas en los medios de cultivo diferenciales CHROMagar Salmonella y Agar
Hektoen Entrico, trabajados en el estudio para confirmar la pureza del cultivo y
determinar si la morfologa y caracterstica de las colonias eran efectivamente
pertenecientes a Salmonella sp..
En Agar Hektoen Entrico la identificacin de microorganismos del gnero Salmonella
est determinada por el crecimiento de colonias con una coloracin negra en su parte
central debida a la produccin y precipitacin de cido sulfhdrico y presentan un halo
transparente alrededor que ha permitido en el dialecto comn definir que los
microorganismos del gnero Salmonella en agar Hektoen crecen con apariencia de ojo
de pescado (Figura N 10 A) (Luna, 1991; Richards, et al, 2004; Gaillot et al, 1999; Dusch y Altwegg, 1993; 1995;
BD
Monnery et al, 1994). Adicionalmente, en CHROMagar Salmonella las colonias
pertenecientes a este gnero crecen con una coloracin rosa prpura (Figura N 10 B),
60
mientras que los microorganismos no deseados son inhibidos o aparecen como colonias
con pigmento verde azul (Bonnie, 2001; ISO, 2002; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Monnery, et al , 1994; Poisson et al,
A B
61
A B
C D
62
5.4.1.4. Identificacin Bioqumica
El reconocimiento de acuerdo con el metabolismo de los microorganismos
pertenecientes al gnero Salmonella sp. se llev a cabo mediante el sistema de
BD
identificacin BBL cristal para bacterias entricas/no fermentadoras realizando el
montaje y lectura de las placas segn las indicaciones, recomendaciones e instrucciones
del productor (Figura N 12) (Anexo N 3).
A B
Figura N 12. Lectura de pruebas de identificacin Crystal para microorganismos
entricos/no fermentadores. A. Identificacin a partir de agua y sedimento del estanque
de Testudines nmero 21. B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimn neonato
en el estanque nmero 47
Para la lectura del perfil del microorganismo por parte del Software fue necesario realizar
a las colonias sospechosas en los medios de cultivo diferenciales, un nuevo
BD
aislamiento en agar tripticasa soya enriquecido con 5% de sangre ovina y luego de
una incubacin por 24 horas a 37C (Murray, 1999) se realiz prueba de indol en medio SIM y
simultneamente se llev a cabo prueba de oxidasa, Salmonella muestra un
comportamiento negativo para las dos pruebas.
5.4.1.5. Serotipificacin
Una vez los aislamientos fueron identificados como Salmonella sp. por el mtodo de
BD
Crystal , las cepas fueron recuperadas nuevamente a partir de Agar TSA con Sangre.
Los aislamientos de Salmonella sp. fueron expuestos a antisueros mono y polivalentes
especficos como lo indica la metodologa de Kauffmann White (Grimont y Weill, 2007). En una
lmina hemoclasificadora se rotul el primer cuadrante de forma vertical con el antisuero
a evaluar y cada recuadro horizontal con la identificacin de la cepa a serotipificar
(Figura N 13). En la primera seccin de la lmina (Grupo B/2 A+S) se depositaron 50l
63
de solucin salina 0,85% y se tom una asada de la colonia a evaluar a partir del TSA
con sangre, se homogeniz la solucin y posteriormente se adicion una gota de 50l
del antisuero correspondiente y se mezcl; se esper la formacin macroscpica de
agregados finos o grandes aglutinados que indicaba la positividad de la reaccin; en
caso de no haber evidencia de aglutinacin, se proceda a evaluar el antisuero siguiente
(Grupo D) y as sucesivamente hasta establecer el serogrupo del aislamiento (Anexo N
4). Para cada reaccin positiva se realizaba un control positivo y negativo con el fin de
garantizar la inexistencia de falsos positivos (Bayley y Scott, 1982, Chatfield, et al., 2007. Luna, 1991, Winkle y
Rhode, 1961)
Cepa
2 A+S 7A+S 14 HC 24 A+S 31 A+S 38 A+S 44 HC 49 A + S
Antisuero
Grupo B + +
Grupo D1 +
Grupo C1 +
Grupo C2 + +
Poli B +
Poli C +
Figura N 13. Esquema de una lmina hemoclasificadora utilizada para la serotipificacin
de las cepas de Salmonella sp. (+: Reaccin positiva de aglutinacin).
Para la serotipificacin se emplearon los antisueros comerciales Polivalentes B DIFCO
(grupos C1,C2, F, G y H) y Polivalente C DIFCO (Grupos I, J, K, M, N, O) y antisueros
monovalentes para Grupo B DIFCO (Factor 1, 4, 5, 12), Grupo C1 DIFCO (Factor 6,7),
Grupo C2 DIFCO (Factor 6,8), y Grupo D1 DIFCO (factor 1,9, 12).
.
Figura N 14. Antibiograma
65
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
Caughey et al, 2005). Sin embargo, mediante las indagaciones realizadas acerca del manejo en
la E.B.T.R.F. y las medidas de bioseguridad establecidas all, esta hiptesis fue
descartada.
66
6.3. Positividad a Salmonella sp. en estanques de Crocodylia y
Testudinea
Entre los ejemplares de Crocodylia se encuentran especies de Crocodylus intermedius
en su mayora, distribuidos en 24 estanques, en 15 de stos se encontr la bacteria; el
estanque restante es ocupado por ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) donde
igualmente se encontr el microorganismo, lo cual permite concluir que el 64% de los
estanques de caimn se encontraban positivos a la bacteria. Por otro lado, de los 27
estanques de tortugas evaluados, 12 (44,4%) son positivos para Salmonella sp;
encontrndose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies que conforman
la coleccin viva de la E.B.T.R.F; estos resultados son de gran preocupacin puesto que
de acuerdo a los resultados obtenidos y haciendo un anlisis general que rene los
datos globales colectados en la Estacin, para las dos especies evaluadas, se pudo
establecer que en 27 de los estanques (52%) fue posible recuperar microorganismos del
gnero Salmonella; mientras que los 25 (48%) restantes se encuentran negativos para la
bacteria (Figura N 14). Segn el volumen de muestras remitidas al laboratorio, de un
total de 129 muestras, 30 fueron positivas para el microorganismo, lo cual equivale a un
24% . Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 129
muestras, en el segundo muestreo 96 y en el tercero 73; debido a que si en alguno de
los estanques evaluados se reportaba el hallazgo de Salmonella en cualquiera de las
muestras procesadas, no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el
proyecto estaba condicionado a la evaluacin de la presencia/ausencia de la bacteria.
N = 52
Figura N 15.
Es de vital importancia tener en cuenta que es muy poco lo que se ha investigado a nivel
mundial y mucho menos Nacional, con respecto a la presencia de la enterobacteria en
este tipo de reptiles, ya que por muchos aos se han encaminado los estudios a las
67
especies que son criadas como mascotas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y
serpientes (Hidalgo et al, 2008; Corrente, et al, 2004; Kourany y Telford, 1982; Ebani et al; 2005; Mitchell y Shane, 2001), pero
en animales que se encuentran en via de extincin y que son el objetivo principal de los
centros de conservacin y recuperacin de las especies mediante programas de
reproduccin, los ensayos acerca de la presencia de Salmonella sp. tanto en los
animales como en su hbitat natural son insuficientes. Adicionalmente, si bien es cierto
que el microorganismo hace parte de la flora comensal de los reptiles y que su
aislamiento en tortugas de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia
(Hidalgo, et al 2007,2008; Siebeling et al, 1975; Passmans et al, 2002; Saelinger y Lewbart 2006), no se puede ignorar el
hecho de que para todos los individuos evaluados, las condiciones de cautiverio donde
son mantenidos crean cuadros de inmunosupresin marcada donde la enterobacteria es
excretada de manera intermitente (Chiodini y Sundberg, 1981; Bradley et al, 2001; Ebani et al 2005) y puede
llegar a producir estados patolgicos caracterizados por letargia, anorexia, septicemia,
pneumonia, celomitis, abscesos, shock hipovolmico y, bajo circunstancias extremas, la
muerte del ejemplar (Onderka and Finlayson, 1985; Frye, 1991).
Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp.,
lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de dicha bacteria (Bamler et al,
1998) y no es claro cmo frecuentemente las especies de reptiles son colonizadas por
serovariedades de Salmonella; en algunos estudios realizados se ha evaluado la
capacidad de colonizacin de la bacteria en tero, contaminacin perinatal, por ingestin
de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles (Schter, et al , 2004). Segn
Kourany y Telford (1982), la predisposicin a condiciones de estrs y escases de
alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sangunea y linftica, llegando a
oviducto, causando la contaminacin de los huevos; aunque Mitchell y Shane (2000),
sugieren que la contaminacin de los huevos se da por abrasin del mismo cuando entra
en contacto con el suelo y cscaras remanentes, en su ensayo descartan la transmisin
vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios,
oviducto y saco embrionario. Sin embargo, la mayor parte de investigaciones en esta
rea concluyen que la ingestin de agua contaminada con heces es la principal va de
infeccin considerndose el medio acutico favorable para la transmisin (Hidalgo, et al, 2007)
sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles tambin son una
importante va de contaminacin; adems las altas tasas de ejemplares portadores de
Salmonella se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las cras, lo
que a su vez asegura la transmisin prematura de dichos microorganismos (Mader, 1996) La
importancia de las infecciones por Salmonella sp. es su potencial zoontico y los
aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patgenos para
humanos, ya que poseen factores de virulencia cruciales para el desarrollo de una
68
gastroenteritis (Pasmans et al., 2005). Estos factores demuestran la importancia en la obtencin
de los resultados ya que se ha informado a la Estacin de Biologa Tropical Roberto
Franco acerca de la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. tanto en los animales
como en su hbitat natural, con el fin de concientizar al personal que labora en sus
instalaciones y que se encuentra en un potencial riesgo de contraer salmonelosis
asociada a reptiles.
Lschner, 2002; Chiodini y Sundberg, 1981; Milln et al, 1997; Abadem de S y Solari; 2001)
N = 27
Figura N 16.
69
N = 25
Figura N 17.
Saelinger y Lewbart (2006) plantearon dos hiptesis de acuerdo con los resultados que
obtuvieron en el aislamiento de Salmonella sp. en ejemplares de tortugas silvestres; ellos
postulan que no lograron recuperar ningna cepa, posiblemente porque las tortugas
excretan Salmonella sp. nicamente bajo condiciones de estrs como el cautiverio y/o
porque las tortugas silvestres no son portadores naturales de Salmonella sp. sino que la
adquieren cuando son incluidas en ambientes ex situ; de esta forma proponen que las
tortugas salvajes no pueden ser portadores de los organismos antes de la captura; sin
embargo tanto el anlisis experimental llevado a cabo en la Estacin Roberto Franco,
como el realizado por Chambers and Hulse (2006), contradice por completo el hallazgo
de dichos investigadores quienes a partir de ejemplares silvestres, reportaron que el 85%
de la muestras procesadas eran positivas para Salmonella sp. Nuestra investigacin en
la Estacin, soporta la primera hiptesis planteada por Saelinger y Lewbart (2006)
puesto que el porcentaje de recuperacin de Salmonella sp. en los Testudines cautivos
en la E.B.T.R.F (Figura N 16), fue de 46% y se plantea que los resultados inesperados
obtenidos por dichos autores posiblemente se dieron por una errada metodologa de
muestreo al haber empleado nicamente hisopado cloacal en la toma de las muestras
dado que la cantidad que se obtiene de esta manera es insuficiente y se conoce que la
concentracin de Salmonella sp. frente a la flora acompaante es muy baja, lo cual hace
que su recuperacin sea ms difcil posiblemente al igual que Richards et al (2004), no
obtuvieron resultados favorables seguramente por no realizar previo enriquecimiento de
la muestra.
70
obtuvieron un porcentaje de recuperacin de la bacteria solo de 2,6% (una muestra) en -
Testudines, mientras que en lagartos obtuvieron un porcentaje de aislamiento de 47,4 %;
(36 muestras); de igual manera en un estudio realizado por Corrente et al (2004) se
obtuvo 50% de recuperacin en lagartos y 10,3% en tortugas. Los resultados obtenidos
en la estacin fueron mayores a lo esperado puesto que existen muchos ms reportes
de aislamientos a partir de muestras provenientes de tortugas que de caimanes (Richards.
et. al 2004; Mitchell and Shane. 2001; Pasmans, et al 2005; Hidalgo, et al 2007, Lane, 1996).
71
Testudines y 10 (71,4%) de 14 muestras igualmente positivas en Crocodylia; a diferencia
de los hisopados cloacales donde la recuperacin del microorganismo fue menor.
Figura N 18.
Figura N 19.
72
81% de recuperacin de Salmonella sp. en serpientes y Pasmans et al (2005), con 25
aislamientos positivos para Salmonella sp. (75,8%) de 33 muestras obtenidas a partir de
hisopados cloacales en lagartos, aunque igual establecen que el muestreo nico por
hisopado cloacal no es altamente sensible. Segn los resultados obtenidos en este
trabajo, no es recomendable realizar hisopados cloacales en los animales porque el
estrs generado durante el procedimiento es muy alto y el porcentaje de recuperacin
de la bacteria muy bajo; adems, conociendo que la excrecin de la bacteria es
intermitente, el aislamiento del microorganismo mediante hisopado cloacal va a
depender no solo de llevar a cabo una buena metodologa diagnstica, sino del factor
azar que garantice que en el momento del muestreo la bacteria este siendo excretada
por el animal (Hidalgo, et al 2007; Saelinger y Lewbart 2006; Pfleger,. et al, 2003; Warwick, et al 2001; Woodward et al, 1997;
Los datos sugieren que el agua, junto con el sedimento, es una fuente de transmisin
importante para los ejemplares que se encuentran alojados en cada estanque; a
diferencia de Mitchell y Shane (2000), quienes no obtuvieron resultados en las muestras
de agua procesadas, en su trabajo de investigacin, al igual que en este lograron aislar
el microorganismo en la arena de los estanques contaminada con heces de los animales,
la cual segn los resultados obtenidos, tambin puede ser tomada como una muestra
apropiada para el aislamiento de la bacteria aunque debe estar acompaada de otra
metodologa de aislamiento. En nuestra investigacin se realizaba una excavacin
aproximada de 15 cm de profundidad y a partir de all se obtena la muestra, logrndose
un porcentaje de recuperacin de 12,5% en Testudinea y 8% en Crocodylia aunque se
debe aclarar que el lugar de eleccin para la toma de la muestra era aquel contaminado
con excremento del animal en los estanques de Testudinea puesto que en ninguno de
los 3 muestreos realizados se encontr materia fecal sobre la arena de los encierros en
Crocodylia. Algunos reportes soportan la metodologa empleada en este estudio; han
establecido que a profundidades de 5 50 cm hay una mayor supervivencia de
Salmonella sp. en la arena en comparacin con la superficie (Platz, 1980; Purvis, et al, 2002), a
pesar de ser un ambiente ms inestable expuesto a temperaturas extremas (Mitscherlich y
Marth. 1984; Bicudo y Goyal, 2003), desecacin (Purvis, et al, 2002; Zibilske y Weaver, 1978) y rayos Ultra Violeta
73
Es claro que tanto para tortugas como para caimanes, la frecuencia de aislamiento de
Salmonella sp. en el ambiente de la Estacin (19,2% n =10 en tortugas y 24 % n = 12 en
caimanes) indica la habilidad del microorganismo para sobrevivir fuera del hospedero, lo
cual favorece la contaminacin de los otros animales que permanecen en contacto
constante con el estanque infectado (Winfield y Groisman, 2003); sin embargo, las propiedades
fsico qumicas del ambiente externo influyen fuertemente en la supervivencia de
Salmonella sp. y por consiguiente en el riesgo de infeccin asociado para los otros
ejemplares. Segn Jensen et al (2006) es posible disminuir la carga bacteriana en el
suelo realizando tratamientos sobre la arena, como lo es el arado; sugirieron que el
hecho de recoger el excremento peridicamente podr reducir la concentracin del
microorganismo.
Figura N 20.
74
El hecho de que en caimanes neonatos se halla encontrado el mayor porcentaje de
aislamiento permite el planteamiento de varias hiptesis teniendo conocimiento de la
posible transmisin vertical del microorganismo que ha sido evaluada en varios estudios
reportados previamente. En esta instancia es posible citar a Kourany y Telford (1982),
quienes evaluaron la presencia de Salmonella sp. en oviducto y huevos a partir de
lagartos hembras, encontrando Salmonella rubislaw y S. sandiego en todas las muestras
a pesar de que los animales procedan de diferentes sitios; ellos plantearon que en
animales saludables la enterobacteria permanece en el tracto gastrointestinal pero bajo
condiciones adversas como estrs y/o escases de alimento atraviesa la barrera linfoide y
coloniza el contenido interno de los huevos y el oviducto. Por el hecho de haber aislado
los mismos serotipos en muestras de diferente orgen, sugirieron que la bacteria estaba
presente en oviducto y que los huevos son infectados en estados tempranos de
formacin en el mismo. Por otra parte, tambin existen reportes en que los caimanes
neonatos pueden adquirir Salmonella sp. cuando se encuentran en estado de huevo y
este se encuentra enterrado en arena o suelo hmedo contaminado con la bacteria o
tambin puede contaminarse con el microorganismo durante el pasaje a travs de la
cloaca. Se ha reportado que Salmonella sp. est en capacidad de contaminar el
contenido interno de los huevos dentro de una hora post exposicin (Austin y Wilkins, 1998).
Como medida de prevencin, Mitchell and Shane (2001) plantean que el uso de
oxitetraciclina y cloranfenicol puede eliminar la Salmonella en huevos eclosionados antes
de 24 horas por metodologa de inmersin; en huevos con 48 horas despus de la
oviposicin ya no surge ningn efecto el empleo de los antibiticos (Siebeling et al, 1975) .
6.6. Serotipificacin
BD
De los 31 aislamientos identificados mediante mtodo de Crystal como Salmonella sp.
29 se lograron clasificar con los antisueros comerciales DIFCO empleados,
identificando 6 serogrupos prevalentes en la Estacin. En la figura N 21 se observa que
el 40% de las cepas de Salmonella sp. halladas en la Estacin pertenecen al serogrupo
C2; mientras que la prevalencia de bacterias clasificadas como pertenecientes al Grupo
B y Grupo C1 fue la misma, obteniendose un porcentaje de 20% para cada caso. En esta
instancia, se debe mencionar que hubo correlacin entre las cepas de Salmonella
cholerae suis identificadas por el sistema BBL crystal y la serotipificacin ya que las
cepas sospechosas son pertenecientes al serogrupo C1 donde se encuentra incluida S.
cholerae suis segn el esquema de Kauffmann White (Anexo N 4).
El 20% restante de las cepas pertenecen a serotipos incluidos en los Grupos que abarca
el antisuero polivalente B (14%), Grupo D1 y serogrupos pertenecientes al Polivalente C.
75
Figura N 21.
S. cholerae suis nunca ha sido reportada para reptiles, por lo cual es necesario realizar
una investigacin profunda en la E.B.T.R.F. que permita determinar la causa o el origen
del hallazgo de esta serovariedad especfica de porcinos, teniendo en cuenta que este
tipo de alimento no es suministrado a los animales y que las personas que manejan los
ejemplares aseguran no estar en contacto con porcinos, es probable que los individuos
introducidos recientemente a la Estacin, hayan traido consigo el microorganismo y que
ste se encuentre establecido en el hbitat.
77
Tabla N 5: Comportamiento de los microorganismos del gnero Salmonella sp. aislados
a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibiticos
utilizados mediante el mtodo de Kirby Bauer.
Figura N 22.
78
El porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada para todas las cepas
aisladas en las muestras de la E.B.T.R.F se observa en la figura N 22. Como ya se
habia mencionado, el 100% de las cepas fueron sensibles a la Norfloxacina; resultado
que se puede extrapolar para ser soportado por Mitchell et al (1999) quienes obtuvieron
100% (N = 20) de sensibilidad frente a cepas de Salmonella sp. aisladas a partir de
muestras de hisopados cloacales en tortugas a las cuales se les administr durante un
periodo de 14 das Enrofloxacina [10 mg/Kg] lapso en el cual se realiz un nuevo
aislamiento del microorganismo, obteniendo una totalidad de negativos a la bacteria.
Norfloxacina y Enrofloxacina son antibiticos pertenecientes a la familia de
Fluoroquinolonas que tienen actividad bactericida, propiedad que es indispensable en un
antibitico ideal (Gentilini, 2007)
Shane, 2001; CDC,1999); adicionalmente se debe aclarar que la eleccin de los antibiticos a
utilizar en este ensayo se bas en los resultados obtenidos en antibiogramas realizados
a distintos ejemplares de reptiles con patologas asociadas a algunas bacterias
diferentes a Salmonella sp.; casos que eran remitidos al laboratorio de Microbiologa de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Nacional de Colombia,
los datos se colectaron mediante un estudio retrospectivo realizado a los archivos de
resultados obtenidos durante el ao 2003 a 2007.
79
una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbvoros tras
terapias prolongadas de antibiticos (Jacobson, 1980;1999; Kaufman, 1998)
Figura N 23.
De acuerdo con la Figura N 23, se puede establecer que en este estudio hay un
predominio de flora Gram negativa, lo que concuerda con lo reportado por Sunderland y
Veal (2001), sin embargo, Enterococcus sp. microorganismo Gram Positivo, fue el que
estuvo en un mayor porcentaje (33%) en todas las muestras trabajadas sin importar el
origen de las mismas.
Figura N 24.
Figura 25.
81
Figura 26.
Figura N 27.
Figura N 28.
Figura 29.
83
pueden tener una adaptacin a la temperatura llegando a desarrollarse a temperaturas
inferiores de lo esperado (Boyer, 1992) Se han aislado tambin, Citrobacter, Klebsiella, y
Proteus, las cuales aunque son flora normal, bajo ciertas condiciones pueden llegar a
producir septicemias, enterocolitis y diarreas; Escherichia coli puede producir dolor
abdominal, diarrea, vmito y fiebre; Klebsiella produce enfermedades respiratorias y
Citrobacter alteraciones a nivel del colon (Martnez, et al, 2003).
Es necesario conocer la particular poblacin saprofita en los reptiles debido a que
cualquier causa que altere este equilibrio puede desencadenar diarrea u otras patologas
digestivas (Martnez, et al, 2003). Adicionalmente, hasta el momento se han realizado anlisis
como este en otras especies de reptiles, como serpientes y tortugas; sin embargo, la
informacin que se ofrece en este trabajo es la primera descripcin microbiolgica
realizada hasta la fecha en las especies de Crocodylus intermedius manejadas en
Colombia.
84
7. CONCLUSIONES
85
8. RECOMENDACIONES
BD
Los medios de cultivo CHROMagar Orientacin y CHROMagar
BD
Salmonella son altamente selectivos y diferenciales para el aislamiento e
identificacin de los microorganismos.
86
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105
10. ANEXOS
106
ANEXO N 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientacin
107
ANEXO N 3. Sistema de Identificacin BBL Crystal para Entericos/NoFermentadores.
Anexo 3.1. Procedimiento para la identificacin de los microorganismos por sistema BBL
Crystal.
108
Anexo 3.2. Ficha tcnica de reacciones de color para Lectura de Resultados.
109
ANEXO N 4. Esquema de Kauffmann - White
S. enteritidis
bioser Paratyphi A A 1,2,12 a -
ser Paratyphi B B 1,3,5,12 b 1,2
variante Odense B 1,4,12 b 1,2
bioser Java B 1,4,5,12 b [1,2]
ser Stanley B 4,5,12 d 1,2
ser Schwarzengrund B 1,4,12,27 d 1,7
ser Saintpaul B 1,4, [5],12 e, h 1,2
ser Reading B 4,5,12 e, h 1,5
ser Chester B 4,5,12 e, h e, n, x
*
ser Sandiego B 4,5,12 e, h e, n, z
ser Derby B 1,4,5,12 f, g [1,2]
ser California B 4,5,12 m, t -
ser Typhimurium B 1,4,5,12 i 1,2
variante B 1,4,12 i 1,2
Copenhagen B 1,4,12,27 i,v 1,7
ser Bredaney B [1],4,[5],12 r 1,2
ser Heilderberg
C1 6,7 c 1,5
S. choleraesuis C1 6,7 [c] 1,5
bioser Kunzendorf
S. typhi D1 9,12, Vi d
110
Cont. Simplificacin del Esquema de Kauffmann White para identificacin de antgenos
somticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp
S. enteritidis
ser Berta D1 9,12 f, g, t -
*
ser Enteritidis D1 1,9,12 g, m -
ser Dublin D1 1,9,12 g, p -
ser Panama D1 1,9,12 l,v 1,5
ser Javiana D1 1,9,12 l, z28 1,5
bioser Pullorum D1 9,12 - -
ser Anatum E1 3,10 e, h 1,6
ser Meleagridis E1 3,10 e, h l, w
ser Give E1 3,10 l,v 1,7
ser Newington E2 3,15 e, h 1,6
ser Illinois E3 (3), (15), 34 z10 1,5
ser Senftenberg E4 1,3,19 g, s, t -
ser Simsbury E4 1,3,19 z27 -
ser Rubislaw F 11 [d], r [d], e, n, x
ser Poona G1 [1], 13,22, [36] z 1,6
ser Worthington G2 1,13,23 z l, w
ser Cubana G2 1,13,23 z29 -
ser Florida H 1,6,14,25 d 1,7
ser Madelia H 1,6,14,25 y 1,7
*
ser Nottingham I 16 d e ,n, z15
ser Cerro K 18 z4, z23 [z45]
ser Siegburg K 6,14,18 z4, z23 [1,5]
ser Minnesota L 21 b e, n, x
ser Urbana N 30 b e, n, x
Nota: La primera columna indica el nombre de la serovariedad, en la segunda columna indica el serogrupo del
Ag O, en la tercera, estn consignados los Ags somticos (O). Los nmeros indican el o los factores del Ag O y
se escriben separados por una coma. En las ltimas columnas, se observan los Ags flagelares (H),
estableciendo los factores pertenecientes a la fase 1 (motil) denominados con letras minsculas y en la fase 2
(no motil) se usan nmeros. El signo (-) indica que la fase est ausente. Los factores entre parntesis
aglutinan dbilmente. Los factores somticos determinados por conversin fgica estn subrayados y los que
estn entre corchetes pueden estar presentes o ausentes.
* Serovariedades encontradas en reptiles
Fuente: Laboratorios DIFCO
111
ANEXO N 5: Interpretacin de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
112
TABLA DE INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Metodo de Difusin en Agar (Normas CLSI NCCLS Ao 2005)
AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE
(mm) (mm) (mm)
CEFOXITINA 30g 14 15 17 18
N. gonorrea 30g 23 24-27 28
E. aureus y lugdunensis 30g 19 20
E. coagulasa negativo excepto 30g 24 25
lugdunensis
CIPROFLOXACINA 5g 21
N. gonorrea 5g 15 16-20 41
Haemofilus 5 g 27 28-40 21
CLORAMFENICOL 30g 12 13-17 18
E.pneumoniae 30g 20 21
Haemofilus 30g 25 26-28 29
DOXICICLINA 30g 12 13-15 16
ENROFLOXACINA 5g 15 16-20 21
ERITROMICINA 15g 13 14-22 23
E.pneumoniae 15g 15 16-20 21
ESTREPTOMICINA
Enterococos (alta resistencia) 300g 6 7-9 10
Otros microorganismos 10g 11 12-14 15
FLORFENICOL 30g 16 17-20 21
GENTAMICINA
Enterococos (alta resistencia) 120g 6 7-9 10
Otros microorganismos 10g 12 13-14 15
KANAMICINA 30g 14 14-17 18
NALIDIXICO ACIDO 30g 13 14-18 19
NITROFURANTOINA 10g 14 15-16 17
NORFLOXACINA 10g 12 13-16 17
PENICILINA G
Estafilococos 29
Enterococos 10U 28 15
Estreptococos (- E. pneumoniae) 10U 26 27-46 24
N. gonorrea 10U 14 47
RIFAMPICINA
Estafilococos Enterococos y
Haemofilus 5g 16 17-19 20
E . pneumoniae 5g 16 17-18 19
TETRACICLINA
Estafilococos 30g 14 15-18 19
Estreptococos 30g 18 19-22 23
SULFATRIMETOPRIM 1,25/23,75 10 11-15 16
g
VANCOMICINA 30g 14 15-16 17
113
ANEXO N 6. Muestras positivas para Salmonella sp. en cada estanque segn cada
muestreo.
Muestreo N 1 (N = 129)
Muestreo N 2 (N = 94)
114
MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE
Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 34)
ORIGEN DE LA MUESTRA
N ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO
SEDIMENTO ARENA CLOACAL
42 X
44 X
49 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (8,8 %)
Caiman Juvenil: 1 Caiman Neonato: 2
Muestreo N 3 (N = 76)
115