Deteccin Electroqumica del Crecimiento de Escherichia coli en Leche

Cruda con Sensores Basados en Electrodos Planos de Platino

H. Cobas1*, A. Mesa1, S. Pavoni1, . Zayas2, E. lvarez2, R. Contreras2

1
Centro de Investigaciones en Microelectrnica., km 8 Antigua Carretera de Vento. Capdevila.Boyeros, Ciudad de La
Habana, Cuba. P.O.Box 8016.
2
Centro Nacional de Investigaciones Cientficas, Diagnstico Microbiolgico CNIC, Ave. 25 esq. 158, No. 15202,
Cubanacn, Playa, Ciudad Habana, Cuba.
*Corresponding author: (537) 2663051, hcobas@electrica.cujae.edu.cu

Abstract
A basic research for quality electrochemical monitoring system dairy product is presented. A previously
designed electrochemical system was evaluated. The electrochemical technic applied in measurements
consisted in cyclical voltammetry from 0 to 1 V at differents scan rates (10 mV/s, 20 mV/s and 50 mV/s). An
electrochemical sensor based on thin film platinum electrode was used. The E. coli new measurements in
culture medium EC with milk is compared with those obtained in previous research with culture medium DKD.
As result similar voltametric behavior were obtained independently of the culture medium. Once more time the
electrochemical activity was detected once completed bacteria growth latency phase.

Keywords: bacteria, E. coli, sensor de pelcula delgadas, voltametra, leche.

Negativas y Gram Positivas. Dentro de las Gram

Introduccin
En el mundo actual es cada vez ms importante el
monitoreo de parmetros de la calidad de los
alimentos. Tanto fabricantes como vendedores
deben mantener un control activo de sus productos
con el fin de que los mismos se mantengan aptos
para el consumo humano. Dismiles son las
consecuencias que la ingestin de alimentos en mal
estado puede causar a la salud, como fiebres,
intoxicaciones, diarreas, etc. Son las bacterias las
responsables de la descomposicin y deterioro
paulatino de estos productos. Por esta razn,
mantener un riguroso monitoreo de estos
microorganismos es de vital importancia para la
salud pblica, para la industria alimenticia y para el
sector encargado de la comercializacin.
A nivel internacional los productos lcteos se
encuentran entre los alimentos ms importantes y
comercializados. Entre ellos, la leche es
considerada como el alimento ms completo y la
ms barata de las protenas de origen animal [1]. Su
presencia en las dietas alimenticias es muy
importante ya que maximiza el uso del calcio por el
cuerpo humano. Lo que permite un fortalecimiento
de la estructura sea [2].
En la leche se pueden encontrar diferentes tipos de
bacterias. Estas se clasifican en dos grupos: Gram
Negativas se encuentran las Enterobacterias y
dentro de estas se encuentra la Escherichia coli
(E. coli), con la cual se realiz el trabajo
experimental que se presenta en este artculo.
Dentro de los mtodos empleados
internacionalmente con el fin de monitorear el
crecimiento de microorganismos, se tienen la
Bioluminiscencia, Impedancia, Turbidimtrico,
Catalasa, Limulus Test, DEFT, entre otros. La
mayor parte de los mtodos automatizados estn
dirigidos al conteo total de bacterias o unidades
formadoras de colonias (ufc). Esto posibilita el
anlisis rpido de gran cantidad de muestras con
una aceptable repetibilidad y exactitud en relacin
con el conteo directo. En la Tabla 1 se pueden
observar algunos de los mtodos automatizados
para evaluar la calidad microbiolgica de la leche.
El grupo de Sensores y Sistemas Electroqumicos
del Centro de Investigaciones en Microelectrnica
(CIME) en conjunto con especialistas de la
Direccin de Diagnstico Rpido Microbiolgico
(DIRAMIC) del Centro Nacional de
Investigaciones Cientficas (CNIC) trabajan en el
desarrollo de sensores y sistemas electroqumicos
que contribuyan al diagnstico microbiolgico.
Como resultado se llev a cabo el diseo y
desarrollo de un sensor electroqumico fabricado

438
Tabla 1 Algunos mtodos automatizados para detectar
microorganismos en leche.
Equipo Metodo Aplicacion
es
Bactoscan 8000 Conteo de bacterias por Leche y
epifluorescencia derivados
Bactometer 33 Impedancia Leche y
derivados
Lumac 3M ATP-Bioluminiscencia Leche y
derivados
PetriFoss Preparacin de placas, Leche y
dosificacin de medios derivados
y siembra
Spiral Plate Siembra automtica y Leche y
Figura 1. Microcelda electroqumica empleada. a) Electrodos
System contador lser derivados que componen la microcelda y terminales de interconexin. b)
Stomacher 400 Homogenizador Leche Muestra en forma de gota de 10 L depositada sobre la
microcelda.
Diralec Turbidimtrico Leche
en Labview 7.1 [11]. El cual es el encargado de
con tecnologa de capas delgadas [3] y se construy aplicarle al circuito potenciostato la seal de
el sistema de medicin electroqumico encargado excitacin correspondiente, as como medir sus
de excitar al sensor y procesar su seal de salida salidas; presentar los resultados de la medicin en
[4]. Como parte de estas investigaciones se analiz pantalla en forma grfica en tiempo real; generar un
el crecimiento de la bacteria E. coli en medio de fichero de salida donde se almacenan los
cultivo Diramic Kit Diagnstico (DKD) [3-9]. parmetros con que se realiz la medicin y
En el presente trabajo se evala la posibilidad de la generar un fichero de salida donde se almacenan
utilizacin del sistema electroqumico los resultados de la medicin para su posterior
anteriormente diseado en el anlisis del procesamiento. El acople entre la computadora y el
crecimiento de la bacteria E. coli en leche, como potenciostato se realiz con una tarjeta de
parte de investigaciones preliminares para el adquisicin de datos profesional (NI 6014 de
desarrollo de un sistema electroqumico de control National Instruments) [12]. El potenciostato se
de calidad de productos lcteos. encarga de aplicar la seal de excitacin a la celda
electroqumica y convertir a tensin la corriente
que entrega la celda. En esta, producto de la seal
Materiales y mtodos aplicada, se produce una reaccin electroqumica
en la superficie del electrodo de trabajo dando
Sensores como resultado una corriente proporcional a la
Como elemento sensor se utiliz una microcelda concentracin de las especies electroactivas.
electroqumica formada por dos electrodos planos
de platino (Fig. 1a), la cual forma parte de un chip
fabricado en tecnologa de capas delgadas sobre
substrato de vidrio [3-9]. El electrodo de
pseudoreferencia tiene forma de anillo con un rea
aproximada de 2 mm2. El electrodo de trabajo tiene
forma de disco con un dimetro de 1000 m.
La zona de la microcelda que no es activa est
recubierta de un material hidrofbico para definir la
superficie donde se depositar el electrolito en
forma de gota microvolumtrica (Fig. 1b). Sobre el
rea activa se deposita perfectamente delimitada
una gota de 10 L de volumen.
Figura 2. Esquema del sistema de medicin.

Instrumentacin electroqumica
Cultivos microbianos
En la figura 2 se presenta el esquema del sistema de
Para preparar las muestras que se utilizaron en los
medicin electroqumico empleado [4, 10]. Este se
experimentos se emplearon los siguientes
controla mediante un instrumento virtual diseado
elementos:
439
 -Medio de cultivo 4223 Caldo de EC (EC),
fabricado por Biocen [13].
-Peptona bacteriolgica.
-Cloruro de sodio (NaCl).
-Agua estril.
-Bacteria E. coli ATCC 25922.
-Leche cruda (vaca).
Como primer paso se prepar un caldo peptonado a
partir de 1 g de peptona bacteriolgica y 8,5 g de
NaCl disueltos en 1 L de agua estril. Luego se
tom 1 mL de la muestra de leche cruda
homogenizada y se realizaron diluciones sucesivas
en el caldo peptonado hasta llegar a una relacin de
1/1000. De esta ltima disolucin se aadi 1 mL a
3,5 mL de medio EC hasta alcanzar un volumen
final de 4,5 mL. En lo adelante a este preparado se
identificar como leche blanca (LB).
Para preparar el inculo se tom una asada de 4 5
colonias de E. coli cultivadas entre 18-24 horas a
37 C y se realiz una suspensin con una turbidez
de 0,5 McFarland equivalente
1 x108 - 3x108 cel/mL. Se tomaron 150 L de esta
suspensin y se inocularon en los frascos que
contenan LB. En lo adelante a este preparado se
identificar como ELEC. Las muestras preparadas
se pusieron a incubar a 37 C y se extrajo una cada
media hora para ser procesada.
Procedimiento experimental
El trabajo experimental se bas en la utilizacin de
la tcnica de Voltametra de Cclica para tres
velocidades de barrido, 10 mV/s, 20 mV/s y 50 V/s.
Se emple la configuracin de dos electrodos del
sistema electroqumico.
En las mediciones se utilizaron los siguientes
analitos:
-Solucin salina, (NaCl en H2O).
-ELEC.
-LB.
Antes de introducir las muestras en la incubadora
se tom un frasco de LB para realizar la medicin
en tiempo cero.
Para llevar a cabo los experimentos se
prepararon tres protocolos de medicin. En
cada uno, antes de realizar las mediciones, se
efectu un bao ultrasnico del sensor durante
15 s. Se garantiz que el potencial entre los
terminales de trabajo y referencia fuese cero y
se configur la tcnica con:
Vinicial = 0,
Vfinal = 1 V (entre R yW),
No. De Barridos = 2,
el perodo de muestreo (Ts) y el incremento de
tensin (dV) se especifican en la Tabla 2 para los
tres protocolos.
Una vez configurados todos los parmetros de la
tcnica se conect el sensor y se depositaron 10 L
de muestra sobre el mismo.
Cada media hora se extrajo una muestra de la
incubadora y se realizaron los pasos anteriormente
descritos. En la tabla 2 se presentan los parmetros
de configuracin que diferencian los protocolos.
Estos parmetros son el perodo de muestreo (Ts) y
la mnima variacin de potencial entre dos valores
consecutivos de tensin aplicada (dV), los cuales
determinan la velocidad de barrido en el sistema.
Tabla 2. Parmetros que diferencian los protocolos
Protocolo 1 Protocolo 2 Protocolo 3
Parmetros
(10 mV/s) (20 mV/s) (50 mV/s)
Ts 500 ms 1000 ms 500 ms
dV 0,005 0,02 0,025
Resultados y discusin
Tomando como base conocimientos acumulados
por el grupo de trabajo en investigaciones
a anteriores, donde se meda el crecimiento de la
bacteria E. coli en medio de cultivo DKD, se
llevaron a cabo diferentes experimentos. Estos
tenan como objetivo determinar semejanzas y
diferencias en la respuesta electroqumica del
sistema al cambiar el medio de cultivo en que se
encontraba la bacteria.
El primero de los experimentos tena como fin
determinar si el sistema responda o no ante los
cambios realizados en el medio de cultivo. Para
ello se prepararon 10 muestras de ELEC con
concentracin inicial de 108 cel/mL de la bacteria.
Se pusieron a incubar 9 muestras, cada media hora
se extrajo una y se midi siguiendo el Protocolo 2
(Voltametra Cclica a 20 mV/s de 0 a 1 V), el cual
se mencion anteriormente. La dcima muestra no
se puso a incubar y se midi en tiempo cero. El
voltamograma obtenido por el sistema, con esta
muestra, se presenta en la curva a) de la figura 3.
Se puede observar que en esta no aparece un pico
de corriente alrededor de 0,2 V de la tensin de
excitacin. En la curva b) de la misma figura se
presenta el voltamograma obtenido por el sistema
al medir una de las muestras que se puso a incubar.
El tiempo de incubacin transcurrido fue de
5,5 horas. En el mismo se puede observar que
alrededor de los 0,2 V de tensin de excitacin se
obtiene un pico en la corriente de respuesta del
sistema de aproximadamente 0,45 A. Es de notar
que las respuestas del sistema al utilizar muestras
de ELEC son similares a las obtenidas en
mediciones con medio de cultivo DKD (Fig. 3c y
3d) [3-9]. Esto pone en evidencia que es posible la
utilizacin de este sistema en las investigaciones
bsicas para el desarrollo de un sistema de control
de calidad de productos lcteos.
En los diferentes experimentos realizados se
comprob que la forma del voltamograma obtenido
440
a partir de tiempos de incubacin superior a 3,5
horas fue repetitiva. En las mediciones realizadas
antes de las 3,5 horas no se observ respuesta.
Como era de esperar, a partir de las experiencias
con medio de cultivo DKD, el sistema se mantuvo
sin respuesta durante el tiempo que el
microorganismo demor en transitar por su fase de
latencia [6, 9]. Esto sucede probablemente ya que
durante este perodo la bacteria se encuentra en un
proceso de adaptacin al nuevo ambiente en que se
encuentra [14, 15], no se reproduce y por tanto los
desechos metablicos tienen una baja
concentracin que no puede ser medida. Este
tiempo es inversamente proporcional a la
concentracin inicial de microorganismos [6].
En todos los casos en el barrido descendente de la
seal de excitacin no se apreci respuesta dado
por la carencia de picos de corrientes apreciables.
Por esta razn se centr el estudio en el barrido
ascendente de la seal de excitacin.
Figura 3. Voltamogramas a 20 mV/s de 0 a 1 V. a) y b)
obtenidos de ELEC con diferentes tiempos de incubacin y
concentracin incicial 108 cel/mL. a) Muestras con 0 horas. b)
Muestras con 5,5 horas, c) y d) obtenidos con medio DKD
para tiempos de incubacin de 0 horas y de 5,5 horas,
respectivamente, y concentracin incicial 105 cel/mL.
Los especialistas en microbiologa plantean que en
las muestras de LB tambin pueden existir trazas de
microorganismos en concentraciones reducidas que
pueden variar con el transcurso del tiempo. De aqu
la necesidad de analizar si con el perodo de
incubacin las concentraciones de estas trazas
aumenta al punto de poder afectar las mediciones.
Para determinar la influencia que la LB puede tener
sobre la respuesta del sistema se tomaron 10
441
muestra de LB preparadas como se explic
anteriormente. De las mismas se pusieron a incubar
9 y se midi una sin incubar. Cada media hora se
extrajo una muestra de la incubadora y se efectu la
medicin. Para la realizacin de estas mediciones
se utiliz el Protocolo 2 (Voltametra Cclica de 0 a
1 V a 20 mV/s). En la figura 4 se puede observar el
comportamiento de la respuesta electroqumica en
funcin de la tensin aplicada entre los electrodos
de trabajo y referencia. En ella se muestra el tiempo
de incubacin para cada muestra. A partir de las
curvas obtenidas se pueden analizar las variaciones
de la respuesta electroqumica de la LB en el
tiempo.
Se analizaron las variaciones alrededor de una
tensin de 0,2 V debido a que es la tensin de
excitacin donde se han obtenido las respuestas de
mediciones hechas con E. coli en investigaciones
anteriores [3-9]. Se puede observar como estas
variaciones no son significativas
independientemente del tiempo de incubacin
transcurrido. Por tal motivo descartamos la
interferencia de la respuesta de la LB, en la
respuesta de la medicin con muestras de ELEC.
Figura 4. Voltamogramas a 20 mV/s de 0 a 1 V obtenidos con
4 muestras de LB obtenidos en diferentes tiempos de
incubacin.
En investigaciones anteriores se report el
incremento del pico de corriente del voltamograma
a medida que se aumenta la velocidad de barrido
para una misma concentracin, igualmente se
produce un corrimiento hacia la derecha del nivel
de tensin correspondiente al mismo [4, 5, 8, 16,
17].
En la figura 5a se presentan las respuestas del
sistema al realizar la tcnica Voltametra
Cclica a muestras de ELEC con concentracin
inicial 108 cl/mL. Se utilizaron los Protocolos
1, 2 y 3 (10 mV/s, 20 mV/s y 50 mV/s). Al
realizar el experimento el perodo de
incubacin en cada caso fue de 4.75 horas. Las
curvas que se muestran en este grfico siguen
la forma de respuesta tpica de este tipo de
sistema, tanto para el medio de cultivo ELEC
(Fig. 5a) como DKD (Fig. 5b).
Al analizar la grfica de la figura 5a se puede
apreciar una diferencia entre este
comportamiento y el reportado en la literatura.
Para los voltamogramas correspondientes a las
velocidades 20 mV/s y 50 mV/s la intensidad
de corriente pico vari de 0,822 A a 1,65 A,
coincidente con lo reportado. A diferencia, la
curva correspondiente a 10 mV/s mostr una
corriente pico de 1,38 A, mayor que la
correspondiente a la curva de 20 mV/s,
contrario al comportamiento tpico en este tipo
de sistema. Se repitieron los experimentos en
varias oportunidades y los resultados fueron
similares. Este comportamiento est an bajo
estudio para poder esclarecer las causas que lo
provocan.
En la figura 5b se muestra la respuesta
electroqumica del sistema al realizar la tcnica
Voltametra Cclica en muestras de E. coli
inoculada en medio DKD. La concentracin
inicial fue 105 cl/mL y perodo de incubacin
de 5,68 horas. Se emplearon las velocidades de Figura 5. Voltamogramas obtenidos con muestras de ELEC y
10 mV/s, 20 mV/s y 50 mV/s en los E. coli en DKD. a)Voltamogramas obtenidos con muestas de
ELEC con diferentes velocidades de barrido y concentracin
experimentos realizados. En estas respuestas se inicial de 108 cl/mL y tiempo de incubacin de 4,75 horas.
aprecia el incremento de corriente pico con el b) Voltamogramas obtenidos con diferentes velocidades de
aumento de la velocidad de barrido [4, 5, 8]. barrido, con muestras de E. coli inoculadas en medio de
cultivo DKD con concentracin inicial de 105cl/mL y tiempo
Al analizar las figuras 3 y 5 es de notar la de incubacin de 5,68 horas [4]
diferencia entre los niveles de corrientes pico
correspondientes a cada velocidad para cada
una de las grficas. Para el caso de los Conclusiones
experimentos mostrados en la figura 3b y 5a, Se obtuvieron voltamogramas sin pico de corriente
estos se realizaron con una concentracin para tiempos de incubacin inferiores de 3,5 horas
inicial mayor que los de la figura 3d y 5b. Por donde las muestras de ELEC, de concentracin
esta razn se esperaba que los niveles de inicial 108 cel/mL, an transitaban por la fase de
corriente, para tiempos de incubacin iguales o latencia y con pico de corriente cuando ya las
prximos, fuesen mayores en las curvas de las muestras haban sobrepasado esta fase.
grficas de las figuras 3b y 5a que las de las figuras Al realizar la tcnica de Voltametra Cclica solo se
3d y 5b. Los comportamientos anteriormente observ respuesta en el sentido ascendente de la
descritos probablemente estn provocados por el seal de excitacin.
cambio del medio de cultivo. Este, entre otros Se comprob que la forma de los voltamogramas
interferentes, tiene presente la grasa propia de la no vari significativamente al cambiar el medio de
leche que puede adherirse a la superficie activa de cultivo. Por lo que es posible la utilizacin del
los electrodos. De esta forma se puede aumentar la sistema de medicin electroqumico empleado en
resistencia a la transferencia de electrones producto los experimentos, en las investigaciones bsicas
de la reaccin electroqumica en la interfaz para el desarrollo de un sistema de control de
electrodo electrolito y de aqu el menor valor de calidad de productos lcteos.
corriente pico. Este comportamiento an sigue bajo
estudio para delimitar las razones que lo pueden Al analizar las muestras de leche blanca (no
estar provocando. En este sentido se proyectan inoculada con la bacteria E. coli) no se observaron
experimentos donde se extraiga la mayor cantidad cambios apreciables alrededor del potencial de
posible de grasa de las muestras con el objetivo de excitacin 0,2 V, independientemente del tiempo
corroborar la hiptesis anteriormente planteada. de incubacin. Por lo que se puede descartar su
influencia en la respuesta general del sistema.
Las respuestas del sistema cuando se realizaron
442
experimentos con ELEC presentaron menor
sensibilidad comparado con las respuestas
cuando se utiliz E. coli en medio DKD.
Se obtuvieron anomalas en la respuesta
electroqumica cuando el sistema utiliz la
velocidad de barrido de 10 mV/s.
Agradecimientos
Los autores agradecen enormemente por la ayuda
prestada a:
Instituto de Pesquisas Tecnolgicas del Estado
de So Paulo, en particular al Dr. Mario
Ricardo Gongora Rubio.
Al proyecto SENSAME del Programa
Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para
el Desarrollo CYTED, en particular a la
Dra. Cecilia Jimnez Jorquera.
Instituto de Qumica y Biosensores (ICB) de
Mnster, Alemania.
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