EVALUACION DE DIFERENTES obteniendo como produccin promedio 3,89x107 UFC/ml y
CONCENTRACIONES (0,60, 80, 100) ppm DE
HARINA DE SOJA RESIDUAL COMO MEJOR
INDUCTOR DE PRODUCCIN DE Bacillus
thuringiensis UTILIZADO COMO BIOINSECTICIDA,
DISTRITO DE TARAPOTO, SAN MARTIN-2016
RESUMEN
Un bioinsecticida es considerado como el producto
bacteriano o actividad bacteriana que da como resultado la
muerte de un insecto. Una de las formulaciones
comerciales ms usadas actualmente est basada en la
bacteria Bacillus. Thuringiensis. Esta bacteria sintetiza
durante su fase de esporulacin una protena (delta-
endotoxina), que muestra una actividad insecticida nica.
Al ser ingerido la delta-endotoxina por larvas susceptibles,
afecta el intestino de los insectos causndoles la muerte.
Existen endotoxinas especficas contra lepidpteros,
dpteros, colepteros.
Este trabajo se realiz con la finalidad de evaluar
diferentes concentraciones Patrn (0ppm), 60 ppm, 80ppm
y 100ppm de Harina de Soya Residual como inductor de
produccin de Bacillus thuringiensis utilizado como un
Bioinsecticida, el presente proyecto de investigacin busca
dar alcance para producir un Bioinsecticida a bajo costo y
en poco tiempo con el fin de suplir la utilizacin de los
insecticidas sintticos que contaminan el medio ambiente.
Se dise y elabor 4 Biorreactores, 4 paletas Rushton
y 4 bafles, para luego ser esterilizados junto con todos los
materiales a utilizar; la obtencin de la Cepa nativa pura de
Bacillus thuringiensis fue conseguida del Instituto de
Cultivos Tropicales (ICT) para luego ser reactivada con
Agar Nutritivo y sembrada en 2 placas petris para su
posterior crecimiento, se prepar 2400 ml de Medio
Mnimo de Davis, 900 ml de Caldo Nutritivo y la alicuota,
los dos primeros fueron vertidos a los Bioreactores junto
con las diferentes concentraciones de Harina de Soya
Residual y del tercero se extrajo 2ml para luego ser
vertidos en cada uno de los 4 Bioreactores. Se realizaron 4
ensayos a las (0, 4, 8 y 24) horas para el recuento de las
clulas en la Cmara de Neubauer, con un tiempo de
fermentacin en los reactores de (1, 2, 3, 4) horas. Los
resultados demostraron que el que induce a la mayor
produccin de Bacillus thuringiensis es 100ppm,
la que tiene menor produccin es el patrn que no tiene
concentracin alguna de Harina de Soya Residual(Patrn)
4x106 UFC/ml.
Se realiz los clculos para la velocidad de crecimiento
y se obtuvo que a 80ppm y 100ppm el Bacillus
thuringiensis crece en =0,71 para ambas
concentraciones. En la curva de crecimiento no se puede
distinguir la fase lag con la fase log. Por lo que no se
puede fijar el punto de inicio de la fase logartmica.
Asumiendo que el punto inicial es en 4 horas del tiempo de
fermentacin y a las 8 horas del tiempo de fermentacin el
inicio de la fase estacionaria.
Palabras clave: Bioinsecticida, Insecticidas sintticos,
Contaminacin, Medio Ambiente.
"EVALUATION OF DIFFERENT CONCENTRATIONS
(0.60, 80, 100) PPM RESIDUAL SOYMEAL
INDUCTOR AS BEST PRODUCTION USED AS
BIOPESTICIDE BACILLUS THURINGIENSIS,
DISTRICT TARAPOTO, SAN MARTIN-2016"
ABSTRACT
A biopesticide is considered bacterial product or bacterial
activity resulting in the death of an insect. One of the most
currently used commercial formulations is based on the
bacterium Bacillus. Thuringiensis. This bacterium
synthesizes during sporulation phase protein (delta-
endotoxin) which displays a unique insecticidal activity.
When ingested the delta-endotoxin by susceptible larvae, it
affects the insect gut causing death. There are specific
endotoxins against Lepidoptera, Diptera, Coleoptera.
This work was performed in order to evaluate different
standard concentrations (0 ppm), 60 ppm, 80ppm and
100ppm Soybean Meal Residual as inducing production of
Bacillus thuringiensis used as a biopesticide, this research
project aims to give scope to produce a bioinsecticide at
low cost and in a short time in order to replace the use of
synthetic insecticides that pollute the environment.
It was designed and developed four bioreactors, 4-blade
Rushton and 4 baffles, then be sterilized with all materials
to be used; obtaining pure native strain of Bacillus
thuringiensis was obtained from the Institute of Tropical
Crops (ICT) to then be reactivated with nutrient agar and
seeded 2 Petris plates for further growth, 2400 ml of
Minimum Medium Davis was prepared, 900 ml and nutrient
broth aliquot, the first two were I dumped into bioreactors
with different concentrations of soybean meal Residual and
the third was extracted 2ml then be poured into each of 4
bioreactors. 4 trials at (0, 4, 8 and 24) hours for counting
cells in Neubauer chamber were performed, with a
fermentation time in the reactors (1, 2, 3, 4) hours. The
results showed that inducing increased production of
Bacillus thuringiensis is 100ppm, obtaining an average
production 3,89x107 CFU / ml and having lower production
is the pattern that has no concentration of soybean meal
Residual (Pattern) 4x106 CFU / ml.
calculations for the speed of growth was carried out and
was obtained 80ppm and 100ppm that the Bacillus
thuringiensis grows = 0.71 for both concentrations. In the
growth curve can not distinguish the lag phase with the log
phase. So you can not set the starting point of the
logarithmic phase. Assuming that the starting point is within
4 hours of fermentation time and at 8 hours fermentation
time the start of the stationary phase.
Keywords:Insecticide, synthetic Insecticides,
Pollution, Environment.
INTRODUCCIN
El control de las plagas de insectos que afectan a los
cultivos agrcolas es uno de los problemas de
contaminacin ambiental ms severos para nuestro
recurso agua, suelo y aire, la utilizacin de insecticidas
qumicos est ocasionando desequilibrios en nuestros
ecosistemas. Recientemente se ha dado un gran impulso
al uso de microorganismos en el control de plagas, debido
a que el uso indiscriminado de los insecticidas qumicos ha
ocasionado la contaminacin de la gran mayora de
nuestros recursos naturales. El control Biolgico de las
plagas puede especificar como el uso de organismos
naturales: Virus, bacterias, hongos, protozoarios y
nemtodos, para el exterminio de insectos que afectan los
cultivos. Existen aproximadamente ms de 1500
microorganismos o metabolitos microbianos que poseen
propiedades insecticidas. El potencial del uso de estos
organismos se debe a su alta especificidad, es decir que
afectan slo a los insectos y no causan dao al medio
ambiente.12
Bacillus thuringiensis, es un habitante normal del suelo,
es un componente importante en el control biolgico. Es
una bacteria gram +, que se caracteriza por la produccin
de varias protenas con capacidad insecticida al ser
ingerido por larvas susceptibles especficamente del orden
lepidptera.3
Actualmente existen varios productos comerciales a base
de B.t cuyo ingrediente activo insecticida es una protena
llamada deltaendotoxina, liberada durante la esporulacin.
Las deltaendotoxinas actan sobre las microvellosidades
del epitelio intestinal de larvas susceptibles, causndoles la
muerte del insecto. El Bacillus thuringiensis es una buena
alternativa debido a que es inocuo al hombre, animales
domsticos, flora y fauna silvestre; es especfico al estado
larvario de lepidpteros, colepteros y algunos dpteros
perjudiciales, por ltimo los costos de produccin lo hace
competitivo debido a los avances tecnolgicos frente a los
insecticidas qumicos.
La fermentacin de B. thuringiensis se lleva a cabo
normalmente a una temperatura entre 27C y 33C,
siendo la temperatura ptima de 30C; a 45 C se
produce una disminucin en la produccin de este
organismo. Adems es esencial una fuente inductor
para la produccin de este, la literatura reporta que la
Harina de Soya es la fuente preferida para el B.t
debido a que sta contiene 40% de protenas.4
Se realiz 4 evaluaciones distintas de 4
concentraciones diferentes de Harina de Soya residual
para el patrn (0ppm), 60ppm, 80ppm y 100ppm
teniendo en cuenta los parmetros de temperatura,
velocidad de agitacin y pH.
MTODO DE LA INVESTIGACIN
Se desarrollar tres etapas y estas consisten en:
ETAPA 01: GABINETE INICIAL
En la presente etapa se realizarn las siguientes
actividades:
Se realizaron los trmites respectivos para obtener el
permiso donde se ejecutar el desarrollo del proyecto,
Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad
Nacional de San Martn-Tarapoto.
Recopilacin de informacin bibliogrfica de revistas,
artculos, libros, etc. necesaria para el desarrollo del
proyecto.
 Adquisicin del cultivo de Bacillus thuringiensis,
cedidos por parte del ICT, a travs de la Universidad
nacional de Mxico.
Diseo y elaboracin de 4 reactores y de las paletas
Rushton.
Adquisicin del cultivo de Bacillus thuringiensis,
cedidos por parte del ICT, a travs de la Universidad
nacional de Mxico.
Diseo y elaboracin de 4 reactores y de las paletas
Rushton.
ETAPA 02: LABORATORIO
En la presente etapa se realizarn las siguientes
actividades:
Preparacin y esterilizacin de los materiales a
utilizar, incluido los 4 reactores.
Reactivacin del Bacillus thuringiensis con el Agar
Nutritivo.
Siembra del Bacillus thuringiensis en dos (02) placas
petris por medio de la tcnica de estra con el asa de
drigalski.
Preparacin de Solucin Salina Fisiolgicamente
Estril (SSFE) en 3 tubos de ensayos de 10 ml y otro
tubo de ensayo completamente vaco.
De los tres (03) tubos de ensayos que contienen
SSFE se agreg 10ml a dos (02) placas petris y del
tercer tubo restante se coloc 5ml para cada placa,
obteniendo como resultado 15ml en las dos (02)
placas.
A continuacin se sembr de las dos (02) placas
petris a un cuarto tubo de ensayo de 30ml y ste se
llev a esterilizar de 4C a 5 C.
Se procedi a preparar el medio mnimo de Davis que
fue de 600ml para los cuatro (04) reactores,
obteniendo un total de 2400 ml del medio.
Luego a ello se prepar el inculo con el caldo
nutritivo que fue de 300ml en cuatro (4) matraces y se
agreg 2ml del cuarto tubo de ensayo a cada uno de
los cuatro matraces y se llev a esterilizar por 24
horas a 37C.
Se pes la Harina de Soya residual que fue de
60ppm, 80ppm y 100ppm y se llev a esterilizar en
horno por 24 horas.
A las 48 Horas transcurridas, con todos los materiales
esterilizados se realiz el vertimiento de los 1200 ml
del caldo nutritivo en los cuatro Bioreactores,
igualmente se hizo con el medio mnimo de Davis que
fue de 2400ml y se coloc las tres diferentes
concentraciones (60,80 y 100) ppm ms el patrn, el
cual no contena concentracin alguna de la Harina
de Soya Residual.
Como resultado se obtuvo cuatro reactores,
patrn, 60ppm, 80ppm y 100 ppm y se agitaron
(0, 4, 8 y 24) horas, con una agitacin de 400
RPM y 500 RPM.
Luego se extrajo cuatro muestras de 30 ul
(0,03ml) del patrn, 60ppm, 80ppm y 100 ppm y
se llev a observar el microscopio con la ayuda
de la Cmara de Neubauer-improved para el
recuento.
Por ltimo se realiz el recuento del patrn
(0ppm), 60ppm, 80ppm y 100ppm de Harina de
Soya Residual en un microscopio de 10x por
periodo de 3 das.
ETAPA N 03: GABINETE FINAL
En la presente etapa se realizaran las siguientes
actividades:
Presentacin, interpretacin y sistematizacin de
resultados.
Elaboracin del informe y presentacin del mismo.
RESULTADOS.
Se prob las diferentes concentraciones de Harina de
Soya Residual, patrn (0ppm), 60ppm, 80ppm y 100ppm,
de los cuales se obtuvieron los siguientes resultados; se
realiz la evaluacin de la agitacin, temperatura y el
control del pH y se observ que la agitacin est
relacionada a la velocidad que ejerce la Paleta Rushton en
RPM.
Resultado de Anlisis- cuarto ensayo (24 Horas).
Grfico 5: Comparacin de produccin de B.thuringiensis-
Cuarto ensayo del Patrn, 60ppm, 80ppm y 100 ppm a 24
horas.
Fuente: Elaboracin Propia, 2016.
Grfico 6: Comparacin de produccin de Bacillus
thuringiensis-promedio del Patrn (0ppm), 60ppm, 80ppm
y 100 ppm.
Fuente: Elaboracin Propia, 2016.
Resultado de Anlisis-Promedio.
Recuento en cmara Neubauer.
Grfico 7: Curva de Crecimiento de las 4
concentraciones, Patrn (0ppm), 60ppm, 80ppm y 100ppm
a las 0,4,8,24 horas del tiempo de recuento y a 4 horas del
tiempo de fermentacin, a 7.69 Log (Recuento).
Fuente: Elaboracin Propia, 2016.
Grfico 08: Evaluacin del pH, obteniendo 6,18 a las 24
horas de recuento.
Fuente: Elaboracin Propia, 2016.
Se observa que el pH ha disminuido hasta T8. A partir de
este tiempo fue disminuyendo hasta llegar a 6.18 que fue
cuando culmin el proceso de fermentacin.
DISCUSIN
Uno de los aspectos ms relevantes para la
produccin de Bacillus thuringiensis es la
conservacin de la cepa, ya que de estas depende el
xito del proceso y del producto final, la cepa se
conserv en agar nutritivo y glicerol por un periodo de
3 das. La cepa utilizada para obtener el inculo debe
ser pura, presentar alta cantidad de esporas tal como
se observ en la Figura 3.
Los parmetros de produccin para el Bacillus
thuringiensis fueron tomados de estudios realizados
por Orietta (2002) quien propone que la temperatura y
pH ptima es de 30 C y (6.8-7,2), por lo que en el
proceso productivo esta se mantuvo constante
comprobando su valor con un termmetro, para
mantener esta temperatura en el fermentador se
utiliz un termostato que controlaba la temperatura.
Se realizaron los clculos correspondientes y el
diseo de los cuatro reactores a escala de 2L y de las
Paletas Rushton que fueron agitados con un dinamo
de 12 voltios, con todas las caractersticas
geomtricas establecidas, figura 1, figura 2.
En los cuatro ensayos realizados de las
concentraciones, patrn(0ppm), 60ppm y 80 ppm, a
las (0,4,8 y 24) horas de tiempo de recuento, con una
agitacin de 400 RPM y 500 RPM se obtuvo que en
las tres ltimas concentraciones (0, 60, 80, 100)ppm
produjeron mayor cantidad de Bacillus thuringiensis
 en UFC/ml, obteniendo as que a mayor Se aplic el IBM SPSS Statistics 20, el diseo elegido
concentracin de la Harina de Soya residual mayor
fue el DCA(Diseo Completamente al Azar) para las
produccin de este mencionado organismo, con
respecto al patrn(0ppm) tambin existi la presencia 24 horas del tiempo de recuento del Bacillus

de esta bacteria sin existir concentracin alguna de thuringiensis de las cuatro concentraciones de Harina
Harina de Soya, tal como se muestra en , los grficos
de Soya residual, patrn(0ppm), 60ppm, 80ppm y 100
2,3,4,5.
ppm tomando como mnimo 5 repeticiones para cada
En el anlisis promedio de produccin de Bacillus
una de las concentraciones, ver tabla 9, cuadro 4.
thuringiensis se vuelve a demostrar al igual que en el
punto anteriormente descrito que a mayor
CONCLUSIONES
concentracin de Harina de Soya residual mayor
produccin de Bacillus thuringiensis, obteniendo que Se aisl la cepa de B. thuringiensis
a 100 ppm se produjo 3,891500x107 UFC, grfico 6; comprobando microscpicamente su morfologa
segn Vargas V.F (2010), la Harina de Soya contiene (bacilos Gram (+)).
40% de protenas, siendo ste el inductor esencial de
La concentracin de Harina de Soya que
produccin del Bacillus thuringiensis, ver grfico 1.
produjo mayor produccin de Bacillus
Con las condiciones de fermentacin propuestas por thuringiensis en los cuatro ensayos fue de
Escobar(2004) y con los datos experimentales 100ppm en los 0, 4, 8 y 24 horas del tiempo de
obtenidos se grafic la curva de crecimiento en la recuento a 500 RPM, a las 24 horas se produjo
Cmara de Neubauer de las 4 concentraciones de 5,057500 x 107 UFC/ml y en los anlisis
Harina de Soya Residual, Patrn(0ppm), 60ppm, promedio se obtuvo 3,89175500x107 UFC/ml y
80ppm y 100ppm, Grfico 7, se puede observar que la menor produccin obtenida fue la del Patrn
las escalas de tiempo de la fermentacin es de (0ppm), debido a que ste no contena
(1,2,3,4) horas respectivamente con un concentracin alguna de Harina de Soya
Log(Recuento) y a un tiempo de recuento de 0, 4, 8, residual.
24 horas, obteniendo que no se distingue la diferencia
Los resultados del anlisis del diseo
entre la fase lag y log, fijando como punto de inicio la
experimental, demostraron que las condiciones
fase logartmica, asumiendo que el punto inicial es T4
ptimas para la produccin de Bacillus
y empezando la fase estacionaria con el punto T8. La
thuringiensis a nivel de 2 L de reactor son: 500
velocidad de crecimiento y tiempo de regeneracin
rpm de velocidad y control de pH igual o mayor
de las cuatro concentraciones se puede observar en
a 7, con tiempos de recuento de 0, 4, 8, 24
el cuadro 3.
horas respectivamente y la temperatura de 30
El pH es un parmetro fsico-qumico importante C, tal como lo describe la literatura.
durante el proceso de produccin. Es por ello, que
El diseo de la paleta Rushton y de los cuatro
iniciando el proceso se debe ajustar el medio a un pH
Reactores fu en un periodo de 9 meses, siendo
entre 6,8-7,2 que es el rango de pH ptimo para este
de mucha importancia los dnamos de 12voltios,
microorganismo. Luego, el pH baja despus de 8-12
los cuales permitieron brindar la condicin
horas (Orietta, 2002). Esto concuerda con nuestros
ptima de agitacin que fue de 500 RPM; las
resultados que el pH empez a bajar
velocidades de crecimiento del patrn (0ppm) ,
progresivamente. Sin embargo, hay que tener en
60ppm, 80ppm, y 100ppm son 0.58, 0.69, 0.71 y
cuenta que un pH cercano a 5 puede inhibir el
0.71 correspondientemente y sus tiempo de
proceso de desarrollo de esta bacteria, y de acuerdo
regeneracin de 1 hora y 17 minutos, 59
a los resultados obtenidos, el pH fue de 6,18 a las 24
horas del tiempo de recuento.
 minutos, 57 minutos y 56 minutos con 45
segundos respectivamente.
La curva de crecimiento del Bacillus
thuringiensis demuestra que la fase Lag
(latencia) no se diferencia con la fase
Logartmica, asumiendo que en los puntos T4 y
T8 las clulas se duplican y la actividad
metablica se incrementa notablemente y a
partir de T8 empieza la fase estacionaria, donde
las clulas nuevas remplazan a las que ya han
muerto, la actividad metablica es ms lenta.
caracterizacin de nuevas cepas de" Bacillus
thuringiensis" procedentes de muestras de tierra de
Canarias. Bol.San.Veg.Plagas., 2004: 703-712.
6. Sauka, Diego H. Bacillus thuringiensis:
Generalidades. Un acercamiento a su empleo en el
biocontrol de insectos lepidopteros que son plagas
agricolas. Revista Argentina de Microbiologia , 2008:
124-140124-140
7. Maduell Soler, Pau. Estudio de la ecologia de
Bacillus Thuringiensis en la hoja. 2007: 96.

Si realizamos el contraste de los resultados 8. Ruiz de Escudero IIIPMACACP. Aislamiento y

obtenidos p < 0,05 por lo tanto se rechaza que caracterizacin de nuevas cepas de" Bacillus
la produccin de las 4 concentraciones de thuringiensis" procedentes de muestras de tierra de
Harina de Soya, Patrn(0ppm), 60ppm, 80ppm y Canarias; 2004.grado Td. : 1-87; 2009.
100ppm sean iguales y se acepta que la
9. Cabrera Mdlcc. Produccion de bacillus
produccin de los Bacillus thuringiensis en las
thuringiensis: 1-87; 2009.
cuatro concentraciones son diferentes, donde se
concluye que tiene mayor produccin en 10. Orietta, 2002.Medios de cultivos optimos para el
100ppm con una media de 50038988 y la que crecimiento del Bt.pdf.
tiene menor produccin de los Bacillus
11. Vargas V.F. (2010).Produccin de Bacillus
thuringiensis es el patrn que no tiene
thuringiensis H-14 var. Israelensis utilizando
concentracin alguna de Harina de Soya
esprrago (Asparagus officinalis) y su uso potencial
Residual(Patrn) con una media de 4500151,ver
para el control de la Malaria en la Libertad- Per.
cuadro 5,6,7,8.
12. Noticiero de Desarrollo Tecnologico en
REFERENCIA BIBLIOGRFICA.
Alimentos. Editado por: PUAL. Nmero 3-1991.
Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
1. Beltrn L et al (2012) Estrategia para el diseo
de un medio de cultivo para la fermentacin con
Bacillus
2. Cerdn, Willian Blas. Produccin de biomasa
de Bacillus thuringiensis H-14 var . israelensis
mutante en un medio fermentativo a base de
sanguaza. 31 (2011).

3. Cabrera, Bertha. Control biolgico Evaluacin

de Cepas de Bacillus thuringiensis. Fitosanidad,
2009: 83-87.

4. Escobar, Jenny M. Anlisis exploratorio para la

optimizacin de un medio de cultivo para la
fermentacin de Bacillus thuringiensis. 2004 (2004).

5. Ruiz de Escudero, I. Ibaez, I. Padilla, M.A.

Carnero, A. Caballero, P. Aislamiento y