Pre Inf

Universidad Nacional del Santa E.A.P. Ing.
Agroindustrial
Laboratorio de Bioprocesos Pre Informe N 02
FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL

DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
TITULO:
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR
POR LOTES
PROFESOR:
AUGUSTO CASTILLO CALDERON
GRUPO:
B-3
CURSO:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
ALUMNOS:
ESCOBEDO FLORES ALEX

JESUS GUTIERREZ DIANA
LPEZ ZAMORA MARILEYLA
MORALES CHORRES CYNTHIA
VALVERDE LPEZ EDISON
NVO CHIMBOTE, MAYO2016
1
Universidad Nacional del Santa E.A.P. Ing. Agroindustrial
CONTENIDO
1
I. OBJETIVOS: .......................................................................................................... 3
1.1. Objetivos Generales: 3
1.2. Objetivos Especficos: 3
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:................................................................ 4
2.1) SOLIDO DE MANTENCION 5
2.2) Medio Activacin: 6
2.3) Medio para fermentacin: 8
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: ..................................... 12
1. Preparacin medio solido del de mantencin 12
3. Medio de activacin 13
4. Medio de fermentacin 14
IV. CRONOGRAMA .................................................................................................. 15
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: .............................................................. 16
VI. ANEXOS: .............................................................................................................. 17
1) Referencias de composicin de medio de mantencin, activacin y cultivo para
Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la produccin de etanol. 17
2) Clculo de la velocidad de aireacin especfica: vvm 17
3) Clculo del flujo de aireacin recomendado 19
4) Formato del plan de muestreo y registro de datos 20
2
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR
POR LOTES
I. OBJETIVOS:
1.1. Objetivos Generales:
Disear y realizar una experiencia de fermentacin en cultivo

celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en un medio
simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir
etanol en condiciones de micro aireacin, midiendo el coeficiente
volumtrico de transferencia de oxgeno a distintas condiciones de
aireacin y agitacin.
1.2. Objetivos Especficos:
Identificar y describir las partes, accesorios y geometra del

fermentador de laboratorio, conocimiento de su operacin,
esterilizacin, carga y descarga y toma de muestras.
Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y control
automtico, as como la calibracin de los sensores.
Activacin celular y desarrollo del inoculo.
Puesta en marcha del cultivo por lote CL. En el cultivo por lote
determinar max y Y x/s. Asimismo determinar el Kla por el mtodo
dinmico de Humphry y correlacionar los resultados.
Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxgeno
disuelto y pH despus del tiempo total de fermentacin en el
biorreactor.
3
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:
Tabla 1: Referencia de composicin de medios de mantencin,

activacin y cultivo para Pichia stipitis Y- 7124
TABLA N01
MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACION (g/l)
Solido de mantencin Extracto de levadura 3
Peptona 5
Extracto de malta 3
Agar 20
Activacin Glucosa 5
Extracto de levadura. 3
Extracto de malta 5
Solucin de sales 5 ml/L
N = 220 rpm
Fermentacin Glucosa 10
Xilosa 3
Extracto de levadura 3
KH2PO4 2
(NH4)2SO4 3
MgSO4.7H2O 1.1
Solucin de sales 5 ml/L
Tampn citrato 100ml/L
Ph 4.5 0.04M
4
2.1) SOLIDO DE MANTENCION
Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin de

medios de cultivo de mantencin para Pichia stipitis Y- 7124.
Luego de acuerdo a la tabla N 1 se pesan las cantidades
requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.
En una probeta graduada de 50

MEDIR ml de agua destilada.
Adicionando agua destilada.

Todos los componentes
MEZCLAR en un matraz Erlenmeyer
Con el mechero de bunsen la mezcla

disuelta en el matraz, agitando con
CALENTAR una varilla de vidrio, hasta aparicin
de la primera burbuja, a partir de lo
Adicionar 6 ml de mezcla a cada cual se controla de a 1 a 2 min.
tubo
8 tubos de ensayo con tapa y en
PREPARAR caliente, inmediatamente taparlos.
Los tubos en un vaso precipitado, y

llevarlos a la olla a presin,
COLOCAR previamente aflojado las tapas, para
permitir el intercambio de gases.
Hasta que la temperatura alcance
CALENTAR los 121C y a partir de ello controlar
de 15 a 20 minutos. Finalizando la
esterilizacin.
Las tapas de los tubos, luego

AJUSTAR colocarlos en posicin inclinada y
dejarlos a temperatura ambiente.
5
Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando con alcohol.

para tener un rea estril prendemos el mechero cinco minutos antes de
realizar la resiembra con el Pichia stipitis Y- 7124
Los tubos de ensayo cerca del mechero de

bunsen, flameando para evitar la
ABRIR contaminacin, teniendo la aza
bacteriolgica calentando al rojo vivo.
2 a 3 azadas y colocamos en el tubo

SACAR con agar, flameamos y cerramos el
tubo y as los 8 tubos con agar.
2.2) Medio Activacin:
TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin

(15 ml y 100ml)
Nutriente Concentracin Peso - Peso - 100ml

(g/L) 15ml (gr)
(gr)
Glucosa 5 0.075 0.5
Extracto de levadura 3 0.045 0.3
Extracto de malta 5 0.075 0.5
Solucin de sales 5 ml/L 0.075 0.5
6
DIAAGRAMA N1 preparacin de medio de activacin
Todos los MEDIR Matraz Erlenmeyer de 125 ml

nutrientes
PESAR
En cada tubo y adicionar agua

COLOCAR
para disolver
ESTERELIZAR
MEDIR EL pH 6.0
En un mechero de Bunsen la
mezcla para evitar
CALENTAR
contaminacin
Constantemente con una
AGITAR varilla por un minuto
(aparicin de la primera
burbuja)
DIAGRAMA N 02 RESIEMBRA SOLIDO LIQUIDO

La
mezcla
AGREGAMOS En el matraz de 500ml
INOCULAMOS Tomamos una azada e

inoculamos en el matraz con el
medio de activacin
COLOCAMOS En el Shaker a T= 30 - 180 rpm
7
2.3) Medio para fermentacin:
TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin

(3000 ml)
nutriente Concentracin 1L Concentracin 3L
Glucosa 10 30
Xilosa 3 9
Extracto de levadura 3 9
KH2PO4 2 6
(NH4)2SO4 3 9
MgSO4.7H2O 1.1 3.3
Solucin de sales 5 ml/L 15
Tampn citrato 100ml/L 300
Condiciones de asepsia
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza
para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo.
1. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del
grupo (A).
2. Desinfectar el rea de trabajo utilizando alcohol 96
3. Encender el mechero Bunsen.
4. Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapn de algodn,
aflojar un poco de manera que no est muy apretado.
5. Flamear en el mechero Bunsen.
6. Retirar una tapa con el meique, mientras sostienes los matraces.
Nunca poner las tapas sobre la mesa.
7. Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier
microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte
superior durante las manipulaciones.
8. Los matraces abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para
que el riesgo de contaminacin sea mnimo.
9. Sembrar en el matraz estril el inoculo.
8
10. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tpalos de nuevo.

Asegrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que
contienen el caldo sembrado.
11. Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.
Preparacin de medio de fermentacin, segn la Tabla N .03. Para el

cultivo de Pichia stipitis Y- 7124
Materiales
Matraces
Espectrofotmetro
Varilla de vidrio
Instrumentos e Equipos
Balanza analtica.
Biostato
Reactivos
Extracto de levadura
Glucosa-xilosa
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
9
DIAGRAMA N03 preparacin de medio de fermentacin
Los componentes Cada componente con agua

destilada
- Extracto de levadura en un
PESAR matraz de 2L con agua destilada
- (NH4)2 SO4 , KH2 PO4 ,
(MgSO4).7H2O en un matraz con
DILUIMOS agua destilada
REGULAR El pH de 4.5
ESTERELIZAR Las disoluciones por

separado
ENFRIAR
El extracto
extractode yacon
de levaura
y adicionary
MEZCLAR
el inoculo
adicionar el inoculo
del medio
del mediode
activacin
de activacin
COLOCAMOS En el Shaker a T= 30 - 220 rpm
10
DIAGRAMA N: 04- Procedimiento para el fermentador en el medio de

fermentacin
Los 2L de medio de
CULTIVAMOS
fermentacin en el biostat -
Aplus
APLICAMOS El mtodo Dinmico durante 30

horas al caldo de cultivo
OBSERVAR En las primeras 10 horas su

crecimiento (KLa)
Lecturas de de oxgeno disuelto

TOMAR a cada intervalo (fase gasificada y
fase de corte aire)
En una hoja de Excel para las
GRAFICAR grficas de regresin y correlacin
11
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
1. Preparacin medio solido del de mantencin
Materiales
Pipetas de 10 ml. Mechero Bunsen

Tubos de ensayo Esptula
con tapas Guantes.
Varilla de vidrio Capachos de papel
Matraz Erlenmeyer Vaso de precipitado
Probeta graduada
Balanza analtica
Olla a presin
Reactivos
Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta.
Agar
Glucosa
12
2. Resiembra celular
Materiales
Aza bacteriolgica
Tubo de ensayo con medio slido donde
se encuentra el M.O.
Mecheros.
Alcohol.
Incubadora
3. Medio de activacin
Materiales
Matraz de 125 ml. Capachos de papel aluminio

2 tubos de ensayo con tapa Mechero Bunsen, trpode y
Varilla de vidrio rejilla.
Pipetas de 1, 5, y 10 ml
Pinzas, esptula.
Algodn ,gasa
Guantes
Instrumentos e Equipo
Shaker pH metro
Balanza analtica Olla a presin
13
Reactivos
o Glucosa o MgSO4.7H2O (sigma).

o Extracto de levadura o pH 4,5
o Extraxto de malta o T 30C, N 220 rpm.
4. Medio de fermentacin
Materiales
Matraz de Erlenmeyer Espectrofotmetro.

Matraces. Varilla de vidrio.
Biostato
Balanza analtica.
14
IV. CRONOGRAMA
MESES
ACTIVIDADES MAYO JUNIO
Miercoles 25 Jueves 26 Viernes 27 Martes 31 Jueves 02 Viernes 03 Lunes 06 Martes 07 Miercoles 08 13-17 Martes 21
Presentacion del Pre - informe X
Reconocimiento del fermentador,
accesorios y geometria del fermentador
X
del laboratori, conocimiento de su
operacin.
Preparacion y esterilizacion de medios
de activacion para los inoculos de medio
X X X
de fermentacion para el BIOSTAT -
Aplus. Determinar el Yx/s y Qx del CLA.
Inoculaciones (S/L, L/L ) X X
Inoculacion del BIOSTAT-Aplus,

medicion del Kla y seguimiento de
cultivo. En el cultivo por lote determinar X X X
umax y Yx/s, asimismo determinar Kla
por el metodo dinamico Humphry.
Seguimiento, descarga y limpieza del

X X
BIOSTAT-Aplus
Determinacion de azucares reductores y
X
proteinas
Presentacion del informe final. X
15
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=
quimicos
http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-
C.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.sht
ml
QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera Bioqumica.
16
VI. ANEXOS:
1) Referencias de composicin de medio de mantencin, activacin y cultivo

para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la produccin de etanol.
Medio Nutriente Concentracin (g/L)

Slido de Peptona 5
mantencin Extracto de malta 3
Agar 20
Glucosa 5
Activacin Extracto de malta 5
Solucin de sales 5 m/L
N: 220 rpm
Glucosa 10
Xilosa 3
(4 )2 4 3
2 4 2
Fermentacin
4 . 74 1.1
Solucin de sales 5 mL/L
Tampn citrato 100 /L
pH 4.5 0.04M
Fuente: A. Castillo. 1994. Tesis Magster PUCV
2) Clculo de la velocidad de aireacin especfica: vvm

= 2,035104

Donde:
NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno

T: Temperatura en K
: Eficiencia de Absorcin
Los valores tpicos de vvm: Laboratorio: 0,5 2.0 vvm

2 = (0.5 2.0 . ) / g O2
17
DATOS A TENER EN CUENTA:
Consideramos:

o 2 = 1
o = 0.1 (Eficiencia de absorcin)

o mx = 0.4984 h-1
Para determinar la biomasa producida X:

= ( )
Rendimiento:
% .
= = ( )
% .
F= 0.25: Factor de aireacin para condiciones microarebias.
Calculamos el rendimiento:
% . 40%
= ( ) = (0.25)
% . 46.57%
= 0.21473
Sustrato en el hidrolizado de cascarilla de arroz

S = 10 g/L de glucosa + 03 g/L de Xilosa
S = 13 g/L de sustrato total
Por lo tanto, calculamos la Biomasa generada (x):

= ( )
= (0.21473 ) (13 /)
= 2.791497 /
18
Entonces reemplazamos datos para calcular la demanda de oxigeno

(NA):

=

Valores:
o mx = 0.4984 h-1

o 2 = 1
o = 2.791497/
Entonces:
(0.4984) (2.791497)
=
1
= . .
Velocidad de aeracin especifica ( vvm ): = 30 = 303

Frmula: = ,

(. ) ( )
= ,
.
= .
3) Clculo del flujo de aireacin recomendado

= =

Dnde:
Vvm = 0.85787 min-1

Volumen de fermentacin VL= 2 L
= (0.85787 2)
19
= . /
4) Formato del plan de muestreo y registro de datos
CULTIVO CELULAR POR LOTESY MEDICIN DEL KLA
Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: __________________________________ Da: ___ /___ / ___

Microorganismos: ___________________________
Fuente Carbono: ____________________________
Nombre
N HORA TIEMPO Abs.(640 OD pH del Observaciones
nm) alumno
20
21

Pre Inf

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Pre Inf

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Universidad Nacional del Santa E.A.P. Ing.

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

AUGUSTO CASTILLO CALDERON

ESCOBEDO FLORES ALEX

NVO CHIMBOTE, MAYO2016

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

1.1. Objetivos Generales:

Disear y realizar una experiencia de fermentacin en cultivo

1.2. Objetivos Especficos:

Identificar y describir las partes, accesorios y geometra del

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

Tabla 1: Referencia de composicin de medios de mantencin,

2.1) SOLIDO DE MANTENCION

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin de

En una probeta graduada de 50

Adicionando agua destilada.

Con el mechero de bunsen la mezcla

Los tubos en un vaso precipitado, y

Las tapas de los tubos, luego

Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando con alcohol.

Los tubos de ensayo cerca del mechero de

2 a 3 azadas y colocamos en el tubo

2.2) Medio Activacin:

TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin

Nutriente Concentracin Peso - Peso - 100ml

DIAAGRAMA N1 preparacin de medio de activacin

Todos los MEDIR Matraz Erlenmeyer de 125 ml

En cada tubo y adicionar agua

DIAGRAMA N 02 RESIEMBRA SOLIDO LIQUIDO

INOCULAMOS Tomamos una azada e

COLOCAMOS En el Shaker a T= 30 - 180 rpm

2.3) Medio para fermentacin:

TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin

10. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tpalos de nuevo.

Preparacin de medio de fermentacin, segn la Tabla N .03. Para el

DIAGRAMA N03 preparacin de medio de fermentacin

Los componentes Cada componente con agua

ESTERELIZAR Las disoluciones por

COLOCAMOS En el Shaker a T= 30 - 220 rpm

DIAGRAMA N: 04- Procedimiento para el fermentador en el medio de

APLICAMOS El mtodo Dinmico durante 30

OBSERVAR En las primeras 10 horas su

Lecturas de de oxgeno disuelto

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1. Preparacin medio solido del de mantencin

Pipetas de 10 ml. Mechero Bunsen

Matraz de 125 ml. Capachos de papel aluminio

o Glucosa o MgSO4.7H2O (sigma).

Matraz de Erlenmeyer Espectrofotmetro.

Inoculaciones (S/L, L/L ) X X

Inoculacion del BIOSTAT-Aplus,

Seguimiento, descarga y limpieza del

QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera Bioqumica.

1) Referencias de composicin de medio de mantencin, activacin y cultivo

Medio Nutriente Concentracin (g/L)

2) Clculo de la velocidad de aireacin especfica: vvm

NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno

Los valores tpicos de vvm: Laboratorio: 0,5 2.0 vvm

DATOS A TENER EN CUENTA:

o = 0.1 (Eficiencia de absorcin)

Para determinar la biomasa producida X:

F= 0.25: Factor de aireacin para condiciones microarebias.

Sustrato en el hidrolizado de cascarilla de arroz

Grupo: ________________________________ Da: _ /_ / _