PRCTICA # 2

TCNICAS DE TINCIN

Objetivo
El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.

Generalidades
La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin y
estructuras)
Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos bencnicos y
grupos cromforos ( agrupacin de tomos que da color a ciertos compuestos) y
auxocromos ( sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las
caractersticas de absorcin del cromforo)
En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes de varias
formas como:
a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus caractersticas de
tincin, por ejemplo, si son o no alcohol-cido resistentes, si son Gram positivas
o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y as
poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.

TINCIN DE BACTERIAS
La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como el
cristal, azul de metileno y fucsina bsica, pero relativamente mal con colorantes cidos
como la eosina.
Un colorante bsico es aquel constituido por un agrupamiento de tomos
orgnicos con carga positiva que ser la parte activa del colorante ya que tendr
afinidad por los cidos nucleicos. Un colorante cido es aquel que se encuentra
constituido por tomos orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por
el citoplasma.

TIPOS DE TINCIN
1. Tincin simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer ms
fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna caracterstica en especial.
Una tincin simple se lleva a cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco
y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y se
lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante
para que quede listo para observarse.
2. Tincin negativa. Este mtodo de tincin utiliza colorantes neutros o cidos ya
que tienen poca afinidad por la clula bacteriana por lo tanto como no se
absorben se colorea el fondo en el que estn las bacterias pero la clula queda
incolora y transparente, as pues las bacterias aparecen como pequeas reas
 iluminadas en un fondo oscuro. La tincin acdica con nigrosina, o neutral ( con
tinta china) son las ms usadas.
3. Tincin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto fsica como
qumicamente, por lo cual su reaccin ante algunos colorantes tambin ser
diferente dando lugar as a grupos tintoreales caractersticos. Entre estos grupos
estn los que se originan por la tincin descubierta por Hans Christian Gram,
esta tincin divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no
solo sirve para diferenciarlas sino an para elegir la terapia adecuada en
algunos casos. Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiologa
clnica como la de Ziehl- Neelsen.
4. Tincin estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su
afinidad se utilizan para teir y detectar ciertas estructuras de la clula
bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cpsulas.

TINCIN SIMPLE
MATERIAL
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Azul de metileno de Leffler
Cepa de Escherichia coli
TCNICA
1. Preparar un frotis de E. coli de acuerdo a las indicaciones de la figura 1 y fijarlo
al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersin.

TINCIN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
4 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%
Nigrosina o tinta china
Puente de tincin
Cepa de Klebsiella pneumoniae

TCNICA
1. Hacer una suspensin ligera en solucin salina de K. pneumoniae y mezclar una
gota de esta suspensin con una pequea gota de nigrosina o tinta china en el
borde central del portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer
portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.
4. Observe con el objetivo de inmersin.

TINCIN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Puente de tincin
Cepas de Gram negativos ( Escherichia coli) y de Gram positivos (Staphylococcus
aureus).
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina
TCNICA
1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno
con una mezcla de ambos microorganismos.
2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teir con cristal violeta por un minuto.
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la
charola de tincin y aada goteando el etanol, dejando que corra por todo
el frotis. Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la accin decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el
frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersin.

TINCIN DE ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Papel filtro
Lmpara de alcohol
Cepa de Bacillus subtilis
cido actico al 5%
Azul de metileno de Leffler
TNICA
1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1.
2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara de alcohol
hasta la emisin de vapores. Es importante que su puente de tincin est
bien nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al
calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos
4. Lavar con agua corriente
5. Decolorar con cido actico al 5% hasta que el frotis tome un ligero color
rosa
6. Lavar con agua corriente
7. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Leffler
8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo
de inmersin

FIGURA 1
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO
Presentacin de resultados
1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:
a) Tipo de tincin
b) Nombre de la bacteria
c) Caracterstica observada

2. Conteste el cuestionario
3. Conclusiones
4. Bibliografa