Gua de Trabajos Prcticos

MATERIAL COMPLEMENTARIO

Plsmidos: clonamiento y complementacin

Plsmidos y su uso como vectores

El DNA de una cepa bacteriana, puede ser extrado de las clulas por diferentes
procedimientos y puede separarse el DNA cromosmico del DNA extracromosomal
(plsmido). Con un extracto de DNA plasmdico, puede realizarse una electroforesis y
visualizar lo que se denomina el perfil plasmdico de una cepa bacteriana. Este
procedimiento tiene gran aplicacin fundamentalmente en epidemiologa. A partir de
plsmidos obtenidos en el laboratorio, ya sea provenientes de una cepa portadora
natural o construidos artificialmente, es factible transferir informacin gentica contenida
en estas molculas a una cepa bacteriana. Este procedimiento se denomina
transformacin y consiste en forzar a una cepa a captar de alguna forma el DNA extrao.
Esta captacin es en general ms eficiente cuando el DNA a incorporar se encuentra
como una molcula circular cerrada. Tambin las bacterias en la naturaleza, utilizan la
transferencia de DNA plasmidal como mtodo habitual para intercambiar material gnico,
aunque muchas veces est mediado por contacto entre una clula dadora y una receptora
(conjugacin). En general los plsmidos son molculas ampliamente utilizadas para
transferir informacin de una cepa a otra en el laboratorio

Fig. 1. (Izquierda) Bacteria con su material gentico, el plsmido es un material extracromosomal

circularizado. (Derecha) Mapa caracterstico de un plsmido con un origen de replicacin, una zona de
multiclonamiento y un gen de resistencia para su seleccin.

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Digestin, clonamiento y ligacin

Los plsmidos pueden ser modificados y de esta forma convertirse en una

poderosa herramienta de la biologa molecular. Desde hace aos son utilizados tanto para
la expresin heterloga de protenas como para la complementacin de mutantes. Las
tijeras moleculares que nos permiten la modificacin (eliminar o insertar segmentos de
DNA) de los plsmidos se conocen como enzimas de restriccin.

Estas enzimas son endonucleasas que reconocen una secuencia entre 4-8 pb en
DNA de doble hebra, se encuentran en diversas especies bacterianas y desde su
descubrimiento produjeron un avance exponencial en las metodologas de biologa
molecular y gentica.

Su funcin in vivo se ha descrito experimentalmente como parte de un sistema de

restriccin y modificacin (sistema R/M). Este sistema podra compararse al sistema
inmune de los mamferos, ya que la funcin principal es reconocer DNA forneo y
degradarlo como mecanismo de defensa y proteccin (funcin de restriccin). El DNA
propio no es degradado por estas enzimas, puesto que previamente ha sido metilado por
la accin de una metiltransferasa (funcin modificacin).

Tipos de enzimas de restriccin

Sistemas tipo I

Una sola enzima (multimrica, posee 3 subunidades) reconoce la secuencia

especfica de DNA, metila y restringe. Pero la restriccin no ocurre en el sitio de
reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Sistemas tipo II

Enzimas diferentes realizan la restriccin y modificacin. La restriccin ocurre en el

sitio de reconocimiento o adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en el
clonamiento de genes, puesto que permiten romper el DNA en sitios especficos, y as,
recuperar secuencias conocidas.

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Sistemas tipo III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomrica que realiza todas las
actividades enzimticas, rompen el DNA 25-27 bp ms all del sitio de reconocimiento

Procedimiento

A. Digerir el DNA blanco y plsmido con una misma enzima de restriccin

B. Ligar DNA blanco y plsmido.

C. Transformar clulas bacterianas con el producto de ligacin obtenido en el paso anterior

D. Seleccin de
colonias

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Complementacin en E. coli DH5

E. coli sintetiza una -galactosidasa que es capaz de hidrolizar el disacrido

lactosa en los monosacridos glucosa y galactosa. La actividad de esta enzima puede ser
puesta en evidencia utilizando un sustrato cromognico como el X-gal (5-bromo 4-cloro 3-
indolil D galactsido) el cual es convertido por la -galactosidasa en un compuesto azul
insoluble. Muchos vectores comnmente utilizados en el laboratorio para clonar genes de
inters (pUC, Bluescript, pGEM, pTOPO entre otros) portan un segmento del DNA de E.
coli conteniendo la secuencia regulatoria y la informacin codificante para los primeros
146 aminocidos de la -galactosidasa. Inmediatamente adyacente a esta regin del
plsmido se encuentra el sitio de multiclonamiento del vector, que mantiene intacto el
marco de lectura y resulta en la incorporacin de unos pocos aminocidos a la secuencia
de la enzima. Este tipo de vectores pueden ser utilizados en cepas de laboratorio que
expresan la porcin carboxi-terminal de la -galactosidasa. Una cepa de este tipo por s
sola no podr expresar la enzima, pero cuando es transformada con el plsmido, la
-galactosidasa podr sintetizarse de forma completa de manera de ser enzimticamente
activa. Este tipo de complementacin se denomina -complementacin. Las bacterias
lac+ que resultan de esta -complementacin, son fcilmente reconocidas en presencia
del sustrato cromognico X-gal, observndose de color azul. La insercin de un fragmento
de DNA exgeno en la zona de multiclonamiento (polylinker) del vector resultar en la
produccin de una subunidad de beta galactosidasa que no ser capaz de complementar
la actividad enzimtica, por lo que las colonias portadoras del plsmido conteniendo el

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inserto no sern capaces de metabolizar el sustrato cromognico y se observarn
incoloras en los cultivos. Este mtodo permite el screening (bsqueda) de miles de
colonias transformantes a la vez. Hay que considerar que el mtodo de seleccin no es
infalible, ya que existe la posibilidad de que la insercin no inactive la capacidad de
complementacin (sobre todo cuando se trata de insertos menores de 100pb que no
cambian el marco de lectura) y que no todas las colonias blancas porten plsmidos
recombinantes. Para corroborar que las colonias seleccionadas poseen el inserto de
inters es necesario extraer los plsmidos y corroborar mediante ensayos de restriccin
y/o PCR especfica la presencia de ste.

Fig. 2. Esquema del sistema de complementacin