Gua prctica N 1

Introduccin a las tcnicas de Biologa Celular

Introduccin.

La tcnica de la fotocolorimetra es un mtodo que sirve para hallar

concentraciones de diferentes muestras.

La tcnica consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A) o transmitida

(T) por una solucin coloreada de uno o varios compuestos. La mxima absorcin
ocurre a una longitud de onda () caracterstica para cada compuesto y la
intensidad de la energa absorbida a esa , varia proporcionalmente con la
concentracin del compuesto en una solucin.

Cuando la luz atraviesa o se refleja en una muestra, la cantidad de luz

absorbida es la diferencia entre la radiacin incidente (I0) y la transmitida (I). La
cantidad de luz absorbida se expresa normalmente como transmitancia o
absorbancia. La transmitancia normalmente se da en trminos de una fraccin de
1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuacin:

T = I/I0 %T = I/I0 X100

La absorbancia A, se define por: A = log 1/T

La transmitancia T, se expresa normalmente en el rango de 0-100 %, pero
la absorbancia no tiene unidades y vara de 0 a 1.

Si 100 fotones de luz atraviesan una cubeta y salen por el extremo de la

misma slo 50, la transmitancia es = 0,5 o del 50 %. Si los 50 fotones atraviesan
una cubeta de las mismas dimensiones, slo saldrn 25, y as sucesivamente.
Este efecto fue formulado como ecuacin matemtica por Bouguer (1729) y Lam-
bert (1760) segn:

T = I/I0 = e-k*b
Ley de Bouguer-Lamber

donde k es una constante (coeficiente de extincin molar) y b es el paso ptico,

normalmente en centmetros.

La ley de Beer es idntica a la de Bouguer, excepto que est expresada en

trminos de concentracin. Establece que la absorbancia es proporcional al nme-
ro de molculas absorbentes por las que pasa la luz. Combinando las dos leyes se
obtiene la ley de Beer-Bouguer-Lambert.

T = I/I0 = e-k*b*c
Ley de Beer-Bouguer-Lambert

donde c es la concentracin de las especies absorbentes, expresada normalmente

en gramos por litro o miligramos por litro.
Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin
de protena presente en las muestras biolgicas, basados en las propiedades que
la formacin de compuestos coloreados.

Los mtodos ms usuales son:

Reaccin del Biuret.

Mtodo de Lowry.
Mtodo de Bradford.
Mtodo del cido Bicincnico.

Reaccin del Biuret. El nombre de la reaccin procede del compuesto

coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con
eliminacin de amonaco.

Figura 1. Se muestra la reaccin de Biuret.

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO 4) se aade a

una solucin de protena se forma una complejo entre el in cprico y los enlaces
peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un
mximo de absorcin a 540 nm. Figura 1.

Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los

pptidos y protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+,Tris, etc.) dan la reaccin.

Mtodo de Lowry. Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del Biuret, el

complejo protena-Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin
Ciocalteus, dando una coloracin azul , con un mximo de absorcin a 650
nm. Figura 2.

Las caractersticas del mtodo son:

La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos de la

protena.
 Es ms sensible que el ensayo del Biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml.
Presenta muchas interferencias

Figura 2. La imagen muestra la reaccin de Lowry.

Mtodo de Bradford. Consiste en la formacin de un compuesto de

adsorcin de coloracin azul entre los residuos de aminocidos bsicos de
las protenas y el colorante Azul Coomassie.

Las caractersticas del mtodo son:

Absorbe luz a 595 nm.

El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de
0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos.

Mtodo del cido Bicincnico. Est basado en la reduccin de Cu(II) a Cu(I) en

medio alcalino y la formacin de un complejo cido bicincnico:Cu(I), con un mxi -
mo de absorbancia a 562 nm.

Las caractersticas del mtodo son:

El rango de concentracin de protena es de 0,5-30 mg/ml.

Ms rpido que el mtodo de Lowry.
Altamente preciso y sensible.
 Instrumento para medir la transmitancia o absorbancia.

Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la transmitancia ab-

sorbancia de una muestra, en funcin de la longitud de onda de la radiacin elec -
tromagntica.

Un espectrofotmetro consta de los siguientes componentes clave:

Una fuente que genera una banda ancha de radiacin electromagntica: Puede
ser una lmpara halgena o de volframio que suministra la luz de la zona visible
del espectro (400-700 nm), o de nen, argn o de hidrgeno, para la zona ultra -
violeta (200-400 nm).
Un dispositivo de dispersin que selecciona una longitud de onda particular de
la radiacin de la fuente. Comnmente, se utilizan prismas y redes hologrficas
de difraccin, que junto a una rendija de entrada y otra de salida configuran el
monocromador.
Un rea de muestra: Clula transparente a la radiacin incidente monocromti-
ca que contiene el material bajo estudio disuelto en un solvente adecuado. Sue-
le ser de 1 cm de espesor.
Uno o ms detectores para medir la intensidad de la radiacin: Normalmente,
es un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo.

Las micropipetas.

Las micropipetas son una herramienta bsica en cualquier laboratorio de

investigacin en el que se necesiten preparar disoluciones. Las micropipetas son
instrumentos delicados y costosos, que estn diseadas para dispensar
volmenes precisos de lquido de manera segura. Existen varios tipos de pipetas
que cubren rangos de volumen especficos. Si estos rangos de volumen no se
respetan, la micropipetas se rompe. Cada micropipeta est debidamente rotulada
en su mbolo y a veces poseen un color distintivo. Figura 1

Figura 1. En la imagen se observa un juego de micropipetas para diferentes rangos de volmenes,

de izquierda a derecha, una pipeta rotulada P-1000 que mide con precisin entre 100 L y 1000
L; una pipeta rotulada P-100 que mide entre 10 L y 100 L y una pipeta rotulada como P-20 que
mide volmenes entre 2 L y 20 L.
 . El volumen se ajusta continuamente dentro del rango de volumen para
cada pipeta. Las micropipetas constan de marcadores numricos que se utilizan
para ajustar el volumen de lquido a transferir. Las micropipetas poseen un
mecanismo de bloqueo que evita el cambio accidental de ste volumen.

Antes de utilizar la micropipeta asegrese de conocer bien cmo fijar el

volumen. La P-20 mide hasta la dcima de microlitro. En la P-20 los dos nmeros
superiores indican el volumen en microlitros, en tanto que el nmero inferior es la
cantidad fraccional. La P-200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto, el
nmero superior de la P-200 nunca debe superar el 2. Figura 2.

Figura 2. Las imgenes muestran como se deben correctamente los volmenes al tomar
dependiendo del tipo de micropipeta que se esta utilizando.

Las micropipetas tienen dos topes, para tomar un volumen solamente debe
bajar hasta el primer tope, para eliminar el volumen hgalo hasta el primer tope, y
en caso de que an quede solucin en la punta puede bajar hasta el segundo
tope. Figura 3

Figura 3. Las imgenes indican como usar correctamente una micropipeta, de izquierda a derecha,
para tomar un volumen se debe bajar el embolo hasta el primer tope, para eliminar el liquido
tomado se debe bajar el embolo hasta el primer tope y si es necesario bajar el tope hasta el final.

Las micropipetas utilizan varios tipos de puntas para los diferentes

volmenes de pipeteo, en alguno casos vienen en distintos colores para que sea
ms fcil su identificacin. Figura 4. Es necesario el cambio de la punta si el
lquido es diferente al ya muestreado o si el volumen establecido es diferente al
anterior.
Objetivos.

Recordar las leyes bsicas de absorcin de luz para la determinacin cuantita-

tiva de compuestos coloreados.
Conocer los principales mtodos de valoracin de las protenas.
Definir los componentes de un espectrofotmetro.
Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina de suero bo-
vino como protena patrn utilizando el mtodo fotocolorimtrico de Biuret, Lo-
wry o Bradford.
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas.
Adquirir destreza en la utilizacin de micropipetas para la medicin de volme-
nes entre 1 L y 1000 L.

Actividades practicas
1) Uso de las micropipetas.
a) Seleccione la micropipetas y las puntas adecuadas.

b) Coloque la tapa de la caja de petri en una balanza y trela a cero.

c) Tome varios volmenes de agua destilada con la micropipeta y dispnselo en la

tapa de la caja de petri. Registre en su hoja de informe el peso del agua aadido.
La densidad del agua es 1 g/mL a 25 C, por lo tanto un volumen de 1 mL corres-
ponde aproximadamente a una masa de 1 g,

d) Repita el procedimiento 3 veces para cada volumen.

e) A continuacin, tome varios volmenes glicerol. La densidad del glicerol es de

1,2656 g/mL a 25 C. Calcule la masa esperada para cada volumen y regstrelo
en su hoja de informe.

f) Repita el procedimiento 3 veces para cada volumen.

 2) Obtencin de la recta de calibracin de la reaccin del Biuret.

a) Coloque en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y se-
cos. Rotule los tubos del 1 al 8 con un marcador permanente.

b) Realice las siguientes diluciones a partir de un stock de albmina de suero bo-

vino (BSA) 10 mg/mL.

Tubo Concentracin Final

1 0 mg/mL
2 1 mg/mL
3 2 mg/mL
4 3 mg/mL
5 4 mg/mL
6 5 mg/mL
7 6 mg/mL
8 7 mg/mL

c) Agite bien cada uno de los tubos de ensayo en un vortex.

d) Aada a cada uno de los tubos de ensayo se 3 mL de reactivo de Biuret.

e) Agite nuevamente cada uno de los tubos de ensayo.

f) Incube los tubos de ensayo en un bao de agua termoregulado a 37 C, duran-

te15 min.

g) Deje enfriar los tubos de ensayo y proceda procede a medir en el espectrofot-

metro.

h) Mida a 540 nm, ajuste el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de
protena (tubo 1).

i) Mida las absorbancias de los tubos 2 a 8. Siempre que se realicen las medidas
desde la solucin menos concentrada (tubo 2) a la ms concentrada (tubo 8), se
cometer el mismo error de medida, por lo que no ser necesario enjuagar y secar
la cubeta despus de cada medicin.

j) Anote las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

 3) Obtencin de la recta de calibracin del mtodo de Lowry.

Puesto que el mtodo de Lowry es ms sensible que la reaccin del Biuret,

lo primero que hay que realizar es diluir la concentracin del stock de BSA en 2
mg/ml.

a) Coloque en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y se-
cos. Rotule los tubos del 1 al 8 con un marcador permanente.

b) Realice las siguientes diluciones a partir de un stock de albmina de suero bo-

vino (BSA) 2 mg/mL.

Tubo Concentracin Final

1 0 mg/mL
2 0,2 mg/mL
3 0,4 mg/mL
4 0,6 mg/mL
5 1,0 mg/mL
6 1,4 mg/mL
7 1,6 mg/mL
8 1,8 mg/mL

c) Agite bien cada uno de los tubos de ensayo en un vortex.

d) Aada a cada uno de los tubos de ensayo se 0,9 mL de reactivo A.

e) Agite nuevamente cada uno de los tubos de ensayo.

f) Incube los tubos de ensayo en un bao de agua termoregulado a 50 C, duran-

te15 min.

g) Deje enfriar los tubos de ensayo y agregue a cada tubo de ensayo 0,1 mL del
reactivo B.

h) Incube los tubos de ensayo en un bao de agua termoregulado a 37 C, duran -

te 5 min.

i) Deje enfriar los tubos de ensayo y agregue a cada tubo de ensayo 3 mL del
reactivo C.

j) Incube los tubos de ensayo en un bao de agua termoregulado a 50 C, durante

10 min.

k) Deje enfriar los tubos de ensayo y proceda procede a medir en el espectrofot -

metro.
l) Mida a 650 nm, ajuste el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de
protena (tubo 1).

ll) Mida las absorbancias de los tubos 2 a 8. Siempre que se realicen las medidas
desde la solucin menos concentrada (tubo 2) a la ms concentrada (tubo 8), se
cometer el mismo error de medida, por lo que no ser necesario enjuagar y secar
la cubeta despus de cada medicin.

m) Anote las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

4) Obtencin de la recta de calibracin del mtodo de Bradford.

Puesto que el mtodo de Bradford es ms sensible que la reaccin del Biu-

ret, lo primero que hay que realizar es diluir la concentracin del stock de BSA en
2 mg/ml.

a) Coloque en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y se-
cos. Rotule los tubos del 1 al 8 con un marcador permanente.

b) Realice las siguientes diluciones a partir de un stock de albmina de suero bo-

vino (BSA) 2 mg/mL.

Tubo Concentracin Final

1 0 mg/mL
2 0,2 mg/mL
3 0,4 mg/mL
4 0,6 mg/mL
5 1,0 mg/mL
6 1,4 mg/mL
7 1,6 mg/mL
8 1,8 mg/mL

c) Agite bien cada uno de los tubos de ensayo en un vortex.

d) Tome 8 tubos de ensayo limpios y aada a cada uno 0,1mL de cada dilucin.

e) Adicione 0,5 ml de reactivo de Bradford a cada uno de estos tubos y agite en

vortex.

f) Incubar los tubos al menos durante 5 minutos. No debe pasar ms de una hora
desde que preparan las reacciones hasta que realiza la medicin.

g) Mida la absorbancia de cada reaccin a 595 nm en espectrofotmetro.

m) Anote las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

 5) Uso de herramientas estadsticas.

Una vez determinados los valores de absorbancia para cada concentracin

de protena patrn para los mtodos establecidos de Biuret, Lowry y Bradford, el
desarrollo de los mismos pasa por optimizar una serie de parmetros, tales como,
linealidad, sensibilidad, precisin, exactitud, rango, selectividad y robustez, me-
diante el uso de herramientas estadsticas.

La linealidad es la capacidad del mtodo para producir resultados proporcionales,

directamente o mediante una transformacin matemtica, a la concentracin del
compuesto de inters presente en las muestras, dentro de un determinado rango.
En las medidas de UV-visible, la relacin ms usual es la ley de Ley de Beer-Bou-
guer-Lambert. Una curva de calibracin lineal que relacione la absorbancia con la
concentracin debe de tener la forma:

A = k*C
donde A es la absorbancia, C es la concentracin y k es el factor de calibracin (la
pendiente de la curva de calibracin).

Tericamente solo se requiere la medida de absorbancia de un patrn de

concentracin conocida, como calibrado para la cuantificacin.Todos los valores
medidos deben estar sobre una lnea recta, pero en la prctica, los valores siem -
pre presentan cierta dispersin. Se debe de aplicar un mtodo estadstico para en-
contrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibracin. El mtodo estadstico
ms frecuente es la regresin lineal, conocido como el mtodo de mnimos cua-
drados. Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir la bondad del
ajuste de los patrones, De los valores estadsticos el coeficiente de correlacin
es el ms popular. Un valor de +1 indica una relacin lineal perfecta entre la absor -
bancia y la concentracin.

La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad

de analito. Se puede determinar por la pendiente de la recta de calibracin ajusta-
da por mnimos cuadrados.

Tambin se indica mediante dos factores analticos:

El lmite de deteccin (LOD).

El lmite de cuantificacin (LOQ).

El LOD es la concentracin ms baja del analito que se puede detectar pero no

necesariamente cuantificar. En general, el LOD es el punto al que la seal del ana-
lito es igual a tres veces el ruido de la medida. Para alguno espectrofotmetros se
puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviacin es-
tndar.
El LOQ es la concentracin ms baja del analito que se puede determinar con una
precisin y exactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir por tan-
to los lmites aceptables de precisin y exactitud. Se puede aproximar a la relacin
entre la precisin de la medida analtica y la sensibilidad del mtodo.

Rango es el intervalo entre los niveles superior e inferior del analito, que se han
calculado con la precisin, exactitud y linealidad requeridos. Rango de linealidad
ser por tanto el intervalo entre las concentraciones ms baja y ms alta de analito
determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer-Lambert.

a) En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorban-

cia obtenidos frente a la concentracin de protena estndar calculada de cada
uno de los tubos, para cada mtodo ensayado.

b) Calcule la ecuacin de la recta junto con los valores de los coeficientes de co-
rrelacin con cuatro dgitos como mximo.

c) Calcule las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada
uno de los mtodos, y sus valores tambin son los correspondientes coeficientes
de absorcin de los complejos protena-reactivo.

Qu protocolo habra que utilizar para determinar la concentracin de

protena de una muestra desconocida?

Una vez obtenida la recta de calibrado, si se deseara conocer la concentracin de

protena de una muestra problema, se debe seguir el mismo procedimiento descri-
to en el apartado 4 para cada uno de los mtodos, pero tomando 2 mL de la mues -
tra problema en el caso del mtodo del Biuret, 1 mL para el mtodo de Lowry. Si
la absorbancia de la muestra est dentro del rango de medida del mtodo selec -
cionado, mediante la ecuacin de la recta de calibrado se puede calcular la con-
centracin de protena de la disolucin problema. Si la absorbancia es mayor al l-
mite superior del rango de medida, siempre se puede realizar la dilucin corres-
pondiente para introducirla en el rango del mtodo. Pero si es inferior al lmite de
cuantificacin del mtodo seleccionado, hay que emplear un mtodo ms sensible.
 Hoja de informe
Prctico N 1

Nombre:____________________________Seccin_________Fecha_______

Actividad: Uso de las micropipetas.

Objetivo: ________________________________________________________

Volumen Masa
300 L
200 L
Agua 60 L
10 L
3 L
Volumen Masa
300 L
Glicero
200 L
l
60 L
10 L
3 L

Actividad: Obtencin de la recta de calibracin de la reaccin del Biuret.

Objetivo: ________________________________________________________

Tubo Albmina Agua Concentracin

Stock (mL) Final
(mL)
1 0 mg/mL
2 1 mg/mL
3 2 mg/mL
4 3 mg/mL
5 4 mg/mL
6 5 mg/mL
7 6 mg/mL
8 7 mg/mL

Concentracin Absorbancia
Final 540 nm
0 mg/mL
1 mg/mL
2 mg/mL
3 mg/mL
4 mg/mL
5 mg/mL
 6 mg/mL
7 mg/mL

Actividad: Obtencin de la recta de calibracin de la reaccin de Lowry.

Objetivo: ________________________________________________________

Calculo para diluir stock

Tubo Albmina Agua Concentracin

Stock (mL) Final
(mL)
1 0 mg/mL
2 0,2 mg/mL
3 0,4 mg/mL
4 0,6 mg/mL
5 1,0 mg/mL
6 1,0 mg/mL
7 1,4 mg/mL
8 1,8 mg/mL

Concentracin Absorbancia
Final 650 nm
0 mg/mL
0,2 mg/mL
0,4 mg/mL
0,6 mg/mL
1,0 mg/mL
1,0 mg/mL
1,4 mg/mL
1,8 mg/mL
Actividad: Obtencin de la recta de calibracin de la reaccin de Bradford.

Objetivo: ________________________________________________________

Calculo para diluir stock

Tubo Albmina Agua Concentracin

Stock (mL) Final
(mL)
1 0 mg/mL
2 0,2 mg/mL
3 0,4 mg/mL
4 0,6 mg/mL
5 1,0 mg/mL
6 1,0 mg/mL
7 1,4 mg/mL
8 1,8 mg/mL

Concentracin Absorbancia
Final 650 nm
0 mg/mL
0,2 mg/mL
0,4 mg/mL
0,6 mg/mL
1,0 mg/mL
1,0 mg/mL
1,4 mg/mL
1,8 mg/mL

En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorban-

cia obtenidos frente a la concentracin de protena estndar calculada de cada
uno de los tubos, para cada mtodo ensayado.

Igualmente se deben de expresar las ecuaciones de las rectas ajustadas junto

con los valores de los coeficientes de correlacin con cuatro dgitos como mxi -
 mo.

Calcule las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada
uno de los mtodos, y sus valores tambin son los correspondientes coeficien-
tes de absorcin de los complejos protena-reactivo.