0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:

ENSAYOS DE RESTRICCIN DE PLSMIDO.

Objetivos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de
agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de
agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la
biotecnologa.

Introduccin
Las endonucleasas de restriccin o tipo II se caracterizan por su habilidad para reconocer
una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en
ambas cadenas de la molcula de DNA. Si bien existen tres tipos de endonucleasas con
caractersticas de reconocimiento y de corte del DNA distintas, son las del tipo II son las que
se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar directamente la
secuencia que reconocen y a que no modifican la secuencia blanco. Las endonucleasas se
denominan enzimas de restriccin, debido a que es la forma de defensa de las bacterias
contra la invasin por bacterifagos, es decir, restringen la invasin por el DNA viral.

Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir

segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha.
Algunas enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en
posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias
complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras
enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos
romos (Figura 4.6).

EcoRI HindIII HaeIII

Figura 4.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde
se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.

Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el

desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido
utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas que van desde un nucletido hasta
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cientos de bases, as como en la introduccin de secuencias ajenas a un genoma, lo que ha
permitido la produccin de protenas recombinantes.

Existen diferentes factores que afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se

inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de
DNA, tales como otras protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta
concentracin de sales. Los efectos de la contaminacin pueden disminuir si se aumenta la
cantidad de enzima aadida a la reaccin, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el
volumen de reaccin, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duracin
de la incubacin. La digestin del DNA genmico por estas enzimas puede facilitarse por la
adicin de policationes como espermidina, que acta uniendo contaminantes cargados
negativamente. Cuando un plsmido est superenrollado es necesario aadir ms enzima o
bien, desnaturalizarlo.

El tratamiento de una molcula de DNA con enzimas de restriccin permite producir

fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. En
soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los nucletidos se encuentran cargados
negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el
electrodo positivo o nodo. Cuando la migracin ocurre en un gel, las molculas de DNA se
separan de acuerdo a su tamao, porque las molculas pequeas se mueven ms
rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes.

Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de

restriccin. Si el fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar
con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de
una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin
se denomina mapa de restriccin. El anlisis de los mapas de restriccin constituye una
importante herramienta para localizar secuencias de bases especficas en un cromosoma y
para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados.

Existen varias aplicaciones de los mapas de restriccin, como la obtencin de los patrones
de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) utilizados en las pruebas de
paternidad, as como tambin en la identificacin de individuos a partir de evidencias
forenses como saliva, sangre, semen, cabello, etc.

En la prctica se utilizarn dos enzimas de restriccin en una mezcla. Esto se debe a que el
vector utilizado en la transformacin (Figuras 4.3 y 4.4) tiene dos sitios de restriccin para
enzimas diferentes, de manera que slo se podr liberar el fragmento de DNA de inters al
cortar por los extremos con las dos enzimas que reconocen dichos sitios.

Material biolgico
DNA plasmdico purificado de la prctica anterior.

Materiales y equipo
Recipiente para hielo
Tubos para microfuga
Gradilla para tubos de microfuga
Recipientes para teir el gel.
Micropipeta de 100-1000 L
2
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Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Vrtex
Horno de microondas
Microfuga
Bao de incubacin a 37C
Bao de incubacin o bloque de calentamiento a 100C
Transiluminador
Pantalla de acrlico
Cmara fotogrfica

Reactivos
NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
NOTA; Las enzimas de restriccin son muy sensibles a la temperatura, mantenerlas
en fro durante su manipulacin.
Amortiguador TANGO de restriccin. Reactivo que es proporcionado por el proveedor
junto con la enzima NdeI.
TAE 1X. Ver preparacin en el apndice.
Agarosa
Amortiguador de muestra
Estndar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizar de acuerdo
a las instrucciones del proveedor.
Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)

Desarrollo experimental

Ensayo de restriccin
1. Etiquetar dos tubos de microfuga.
2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de plsmido y 1 L de
Amortiguador Tango10X
3. Incubar a 100C por 5 min.
4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.
5. Pasado el tiempo de incubacin, aadir al tubo 1 nicamente una de las dos enzimas
de restriccin que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1
L BamHI y otro par de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente despus de aadir la
enzima.
6. Al tubo 2 aadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros
golpes al tubo de microfuga.
7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el lquido se
deposite en el fondo.
8. Incubar a 37C por 1.5 h.

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9. Se sugiere aadir 0.5 l de una solucin de RNasa (1 g/mL) e incubar 30 min a 37C.
Este procedimiento eliminar el RNA y facilitar la visualizacin de los productos de la
restriccin en el gel. Otra opcin para la eliminacin del RNA es aadir 2 L de la
solucin de RNasa a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cmara de
electroforesis, cuando est tibio.
10. Al trmino de la incubacin colocar los tubos en hielo.
11. Se recomienda que para visualizar ms ntidamente los fragmentos de la restriccin,
tomar todo el volumen usado en el ensayo de restriccin de cada tubo para correr en
un gel de agarosa.

Preparacin del gel

Se sugiere utilizar un gel por cada dos equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o
carriles en el gel.
Colocar la bandeja de acrlico para hacer el gel dentro de la cmara y colocar el peine.
Preparar un gel de agarosa al 1%. Pesar 0.35 g agarosa en un matraz Erlenmeyer,
aadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodn o una servitoalla. Se
calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min. o hasta que la agarosa se disuelva
bien.
Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, aadir entonces 2 L bromuro de
etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGNICO) para obtener una
concentracin final de 0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar. O bien aadir el
reactivo SYBR Green (se recomienda usar 1 L de 10,000 SYBR Green I por cada 10
mL de gel)..
Depositar el gel en la bandeja de la cmara (Figura 4.7), evitando la formacin de
burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).
Quitar los acrlicos que hacen la bandeja y colocar el gel en la cmara de
electroforesis.
Aadir el amortiguador TAE en la cmara. La cmara de electroforesis se llena con
aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.

Figura 4.7. Preparacin de un gel de agarosa. Adicin de la agarosa disuelta en TBE.

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Preparacin y cargado de las muestras.

1. Tomar los tubos de microfuga que fueron usados en la restriccin y etiquetarlos R1,
R2. Adems marcar dos tubos ms uno como E de estndar y otro como P de plsmido
sin digerir.
2. Aadir los reactivos como se indica en la tabla 4.1. Usar una punta de micropipeta
distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin cruzada.

Tabla 4.1. Preparacin de muestras para aplicar en el gel de agarosa.

Reactivos Estndar* Plsmido sin Plsmido digerido Plsmido digerido
(E) digerir con una enzima con dos enzimas
(P) (R1) (R2)
Muestra 1 L DNA-HindIII 10 L 12 L** 13 L**
H2O 9 L
Amortiguador de 2 L (Stop Mix) 3 L 3 L 3 L
muestra
*El estndar que se usa en el laboratorio (lambda DNA digerido con HindIII) puede calentarse a 65C por 10
min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del
estndar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb.
** Volumen que qued despus de realizar el ensayo de restriccin.

3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el lquido en

el fondo.
4. Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar
orientados hacia el ctodo, generalmente el electrodo es de color negro.
5. Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados segn la
tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

Figura 4.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

6. Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y
negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que
las muestras migren hacia el lado positivo de la cmara.
7. Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la
observacin de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado
sobre una lmpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin
ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrlico
entre el observador y la fuente de luz UV.

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8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para
ese propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si es que
estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.
Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las
bandas de DNA detectadas. Construir la curva de estndares de peso molecular y
Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as como del
vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que
se encuentran en la parte inferior de la tabla 4.1.

9. Analizar los resultados.

Cuestionario

1. Qu parte de la molcula de DNA le confiere la carga negativa?

2. Cul es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los
dos colorantes que contiene?
3. Por qu el bromuro de etidio es un reactivo mutagnico?
4. A que se le denomina topoismeros?
5. En la prctica se pudieron observar topoismeros?
6. Qu peso molecular tienen los topoismeros?
7. Qu tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la prctica, romos o
cohesivos?
8. Cuntos fragmentos de DNA o restriccin se obtuvieron al utilizar las dos enzimas
NdeI y BamH1?
9. Cuntos fragmentos se obtuvieron al utilizar slo una de las enzimas de restriccin?
Por qu?
10. Cul fue el peso molecular del DNA liberado y del plsmido o vector?
11. Cules son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restriccin?

Referencias

Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2

Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in
Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3.
Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd.
www.els.net.
Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2 ndedition. Cold
spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.
279-317. Localizacin QH345 L43
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual.
Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ
specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.

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 0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: INDUCCIN DE

PROTENA RECOMBINANTE.

Objetivos
Conocer el fundamento de la induccin de la sntesis de protenas recombinantes en E. coli
Realizar la induccin de una protena recombinante (-lactamasa)
Obtener la curva temporal de induccin de una protena recombinante
Interpretar el patrn electrofortico de produccin de una protena recombinante
Conocer las aplicaciones biotecnolgicas de las protenas recombinantes

Introduccin
La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas
y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
protenas. Los sistemas bacterianos han sido los ms utilizados para este fin, debido a que son
fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos y
se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas
inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatizacin en proyectos de produccin a gran
escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas.

A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las protenas de eucariontes o
las protenas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico
del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (protenas que se unen a las protenas recin
sintetizadas), as como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son
muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias
no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin, como los sistemas de clulas de mamfero,
de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las protenas eucariontes de manera correcta
y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo de estos sistemas
es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms complicada. Adicionalmente,
la produccin de grandes cantidades de protenas, como algunos productos teraputicos, se puede
lograr tanto en plantas como en sistemas animales.

Muchas compaas ofrecen una serie de vectores con capacidades de expresin muy variadas, con o
sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin de la protena
deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.

Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de protenas
heterlogas en E. coli. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de
expresin fuerte del promotor del bacteriofago T7, que controla la alta expresin de la RNA
polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la
RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms
detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se
exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de la protena de inters, se
tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el isopropil-D tiogalactosido
(IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del opern de la
lactosa (Fig. 4.9). El IPTG se une a la protena represora, ocasionndole a la protena un cambio
conformacional que le impide su funcin biolgica de unirse al DNA. La actividad biolgica de la
protena represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo, en el caso
del vector pET, la transcripcin del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripcin del
transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represin del gen es denominado induccin, por lo que
el IPTG es llamado inductor. El gen que codifica a la protena represora se encuentra incluido en el
vector, LacI, y su transcripcin ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9).

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As, a pocas horas de induccin, la formacin de la protena deseada puede llegar a ser ms del
50% de la protena total en la clula.

Figura 4.9. Mecanismo de accin del IPTG en la expresin de protena mediada por el vector pET.

Como se mencion anteriormente, la produccin de la protena recombinante en un organismo no

relacionado puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las
modificaciones post-traduccionales necesarias o bien porque no se pleg adecuadamente,
provocando su aglomeracin. Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo
pueden solubilizarse a travs del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de
inclusin. En este caso, aumentan los costos de produccin y/o recuperacin de la protena.

En la prctica se llevar a cabo el monitoreo de la induccin de la -lactamasa en clulas completas

de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 4.4), vector que fue
producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostr en la Figura 4.3.

Material biolgico por grupo

1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo lquido saturado de clulas transformadas de E. coli (crecidas
por 12 a 16 horas con agitacin vigorosa).

Material y equipo
1 mechero
1 recipiente para hielo
Tubos para microfuga de 0.5 mL
2 vasos de precipitados 25 mL
1 pipeta Pasteur con bulbo
Recipiente de plstico para la tincin.
Micropipeta de 2 a 10 L
Micropipeta de 20 a 200 L
Micropipeta de 200 a 1000 L
1 caja de puntas de 10 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
Placas de vidrio
Peine

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Separadores
Pinzas para sujetar las placas
Cmara para electroforesis
Fuente de poder
Vrtex
Incubadora a 37C con agitacin
Cmara fotogrfica

Reactivos
1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL)
100 mM IPTG
Estndar de peso molecular de protenas
8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotmetro.

Desarrollo experimental
Induccin de protena recombinante, -lactamasa (Figura 4.8).
1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de clulas de E. coli transformadas con el vector PET-
TEM-1-ompA-lactamasa, y aadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina. Tomar una alcuota
de 1 mL y leerla en el espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria (la
absorbancia debe ser menor a 0.3). Incubar los tubos con agitacin vigorosa a 37C
(colocarlos en posicin diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe
llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8.
2. Para verificar que se lleg a la absorbancia indicada, tomar una alcuota de 1 mL y leerla en el
espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si an no llega, volver a incubar
el matraz con agitacin vigorosa.
3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alcuota a la que llamaremos tiempo 0
(mantener en hielo el tubo de microfuga).
4. Agregar el IPTG para tener una concentracin final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del
medio con clulas puede variar, dependiendo del nmero de alcuotas que se hayan tomado
para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el clculo tomando en
cuenta el volumen final de medio con clulas.
5. Incubar nuevamente a 37C con agitacin horizontal y tomar alcuotas de 1 mL cada 30 min
por 1.5 o 2 h.
6. Guardar todas las alcuotas en tubos de microfuga a 4C.

Preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS

Durante el tiempo de incubacin e induccin de la protena recombinante, preparar un gel de
poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las
instrucciones de elaboracin se encuentran en la seccin II, parte III del manual. O bien realizar
los geles y la corrida de las muestras en otra sesin de laboratorio.

Preparacin de las muestras y separacin en un gel de poliacrilamida-SDS

1. Tomar 15 L de cada una de las alcuotas que fueron recolectadas y mezclarlos con 10 L de
amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Hacer una mezcla apropiada de
estndares de peso molecular (se sugiere 7 L de los estndares de peso molecular ms 18
L de amortiguador de muestra).
2. Ensamblar el gel en la cmara de electroforesis.
3. Aplicar las muestras en el gel.
4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del
colorante haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA,
siempre y cuando no se caliente el gel.
5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.

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6. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar la tincin depositando el gel en una
charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante.
7. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H 2O destilada y aadir la solucin
desteidora. Poner a agitar suavemente.
8. Tomar la foto del gel.
9. Analizar los resultados. La protena tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el
pptido seal de la protena ompA y de 29 kDa sin pptido seal.

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1 mL
t=0

Elegir entre incubar

hasta 90 o 120 min,
ya que slo hay 5
pozos disponibles por
equipo. Recordar que
1 mL uno de los pozos
t = 120 min contendr el estndar
de peso molecular.

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Cuestionario
1.5 ml
1. Menciona las diferencias entre las clulas de E. coli DH5 y las clulas E. coli BL21
Medio LB-kanamicina
2. Qu es una protena recombinante?
3. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes de
comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante?
4. Cul fue el tiempo en el que se produjo la mxima cantidad de protena recombinante?
5. Qu otros parmetros se podran modificar 370C / obtener
Incubar apara agitacin vigorosa
un mayor rendimiento de la
Clulas del cultivo saturado durante 2 h
protena?
6. Qu son los cuerpos de inclusin?
7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma soluble o
en forma agregada? Leer a 600 m
8. Qu mtodo propondras para hastapurificar a la protena
obtener 0.6-0.8 Abs. recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de manera
comercial, explicando sus usos.
Agregar__________L 100mM IPTG
(concentracin final 0.5 mM)
Referencias
Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning
0
Incubar
vectors in Escherichia coli. The EMBOa 37 Journal
C / agitacin.
3, 2437-2442.
Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turnercada
Tomar una alcuota J. 30Unit
min 2. DNA profiling. European initiative for
biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in
Protein Science 5.1.1-5.1.8.
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold
spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.

1 mL 1 mL 1 mL
t=0 t = 30 min t = 60 min t = 90 min

Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.

Figura 4.10. Proceso de induccin de protena recombinante en E. coli.

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