Pelculas de envasado de alimentos activas con actividad antimicrobiana sinrgica

Abstracto

Nanocompuestos de polmero de alta calidad que contienen una combinacin antimicrobiana

sinrgica de aceites (mezclas de carvacrol y timol) y su excelente rendimiento como embalaje para
hummus. Las propiedades interactivas de carvacrol y timol contra E. coli se estudian in vitro, ya que
la combinacin de estos aceites esenciales (OE), que proporciona un agente antimicrobiano
sinrgico accin, se carga en los nanotubos del halloysite (HNTs) por primera vez. Esta ltima
nanoescala los portadores minimizan la prdida de los EOs altamente voltiles durante el
procesamiento del polmero a alta temperatura, permitiendo la composicin en fusin y posterior
produccin de pelculas a escala semiindustrial. La resultante las pelculas exhiben una actividad
antimicrobiana sinrgica contra E. coli, superando las pelculas que contienen el individuo EOs por
la potencia y la vida til. Las pelculas tambin se integran en los envases reales de alimentos, y se
estudia su efecto sobre el crecimiento de E. coli en el hummus inoculado. El crecimiento bacteriano
se reduce en siete rdenes de magnitud, lo que conduce a su completa erradicacin, mientras que
el comportamiento antimicrobiano control pelculas fue significativamente ms dbil. Estos
resultados demuestran el inmenso potencial de estas pelculas como materiales de envasado de
alimentos para controlar eficientemente el crecimiento de bacterias en sistemas alimentarios
complejos.

1. Introduccin

El deterioro microbiano causado por microorganismos patgenos, incluyendo bacterias y hongos,

reduce la vida til de los alimentos y aumenta el riesgo de enfermedades transmitidas por los
alimentos y, por lo tanto, preocupacin global (Bohme et al., 2012, Gram y otros, 2002, Quintavalla
& Vicini, 2002). Como resultado, se buscan nuevas tecnologas para productos alimenticios ms
seguros y minimizar las prdidas y (Appendini y Hotchkiss, 2002, Irkin y Esmer, 2015, Kenawy,
Worley y Broughton, 2007; Otoni, Espitia, Avena-Bustillos, & McHugh, 2016; Scharff, 2012). Entre
ellos, el envasado activo, que est diseado para controlar el desarrollo de la caries y las
enfermedades microorganismos, surge como una tecnologa prometedora para extender la vida
til, mantener la inocuidad de los alimentos, minimizando los riesgos de las enfermedades
transmitidas por los alimentos (Han, 2005; Labuza & Breene, 1989; Malhotra, Keshwani, &
Kharkwal, 2015; Vermeiren, Devlieghere, van Beest, de Kruijf, & Debevere, 1999). A pesar de su
potencial inmenso, no se utiliza el envasado de alimentos antimicrobianos, fecha, en gran escala.
Los agentes antimicrobianos usados actualmente (por ejemplo, iones oxidantes, tales como iones
de cobre o de plata) proporcionan slo eficacia contra microorganismos y sobre todo en contacto
directo (Brandelli, 2015, Dallas, Sharma y Zboril, 2011, Llorens, Lloret, Picouet, Trbojevich, &
Fernandez, 2012; Rai, Yadav y Gade, 2009).

Por lo tanto, su eficacia limitada combinada con preocupaciones sobre su seguridad, y la aparicin
de bacterias resistentes, son principales factores que limitan su uso comn (Ahamed, AlSalhi, &
Siddiqui, 2010; AshaRani, Kah bajo Mun, Hande, y Valiyaveettil, 2008; Carbone, Donia, Sabbatella,
& Antiochia, 2016; Gaillet & Rouanet, 2015; Realini & Marcos, 2014). Adems, estos
antimicrobianos materiales no satisfacen la demanda reciente de los consumidores y productos
alimenticios seguros (Malhotra et al., 2015). Alternativamente, aceites esenciales (OE), que son
antimicrobianos naturales y altamente eficaces contra las bacterias y los hongos, estn aprobados
por el Administracin de Drogas (FDA) para uso alimentario como GRAS (generalmente reconocido
como seguro) (Burt, 2004; Dorman & Deans, 2000; Moreira, lvarez, & Ponce, 2016; Vergis,
Gokulakrishnan, Agarwal, & Kumar, 2013). Los OE son compuestos particularmente atractivos para
incorporacin en los materiales de envasado de alimentos, ya que como vapor en el espacio de
cabeza del envase, esterilizando tanto la superficie del alimento como el ambiente del espacio de
cabeza (Bassole & Juliani, 2012; Calo, Crandall, O'Bryan, & Ricke, 2015; Hyldgaard, Mygind, &
Meyer, 2012; Lpez, Snchez, Batlle y Nerin, 2005; MartnezGracia, Gonz alez-Bermdez, Cabellero-
Valc arcel, Santaella-Pascual, & Frontela-Saseta, 2015).

Mucho esfuerzo se dirige hacia la incorporacin de estos compuestos sensibles en los productos
bsicos mediante tcnicas de fabricacin convencionales, al mismo su prdida durante el
procesamiento a alta temperatura y el mantenimiento su funcin antimicrobiana (Malhotra et al.,
2015, Ramos, Jimnez, Peltzer, & Garrigos, 2012; Sung et al., 2013; Suppakul,

Miltz, Sonneveld, & Bigger, 2006; Valdes et al., 2015). Recientemente, hemos demostrado el uso
de nanotubos de Halloysite (HNTs), que son minerales naturales de arcilla de aluminosilicato (Liu,
Jia, Jia, & Zhou, 2014; Lvov, Wang, Zhang, y Fakhrullin, 2015), como portadores a nanoescala para
carvacrol utilizado como modelo EO. Entrapment de carvacrol dentro HNTs permite la
incorporacin de esta EO altamente voltil diferentes matrices polimricas a temperaturas
elevadas de hasta 250 C (Shemesh, Krepker, Nitzan, Vaxman y Segal, 2016). La resultante los
nanocompuestos se caracterizan por un mayor contenido de carvacrol dentro de las pelculas
finales adems del perfil de liberacin sostenida de los EOs atrapados en comparacin con las
pelculas de control sin HNTs (Shemesh et al., 2016, Shemesh et al., 2015b). Sin embargo, las
posibles interacciones de EO con diversos componentes alimenticios (por ejemplo, grasas,
protenas y azcares) y otros factores extrnsecos (tales como temperatura y microorganismos
especficos) a menudo resultan en una actividad antimicrobiana inferior, que requieren el uso de
dosificaciones ms altas de agentes antimicrobianos (Burt, 2004). Esto, a su vez, puede dar como
resultado efectos organolpticos (Calo et al., 2015; Martnez-Gracia et al., 2015).

As, explotando interacciones sinrgicas entre varios OE o sus componentes principales pueden
aumentar su eficacia a concentraciones y minimizar los cambios organolpticos en como el
hummus, que fue elegido como modelo alimentario en este estudio (Martnez-Gracia et al., 2015).

Hummus es uno de los platos ms comunes en el Medio Oriente, y su popularidad en el Estados

Unidos y Europa ha aumentado significativamente en el pasado dcada. Se prepara a partir de
garbanzos cocidos y triturados (u otros frijoles), mezclado con algunos de los ingredientes de
eleccin como el limn jugo, ajo, aceite de oliva, etc Hummus es un alimento de alta humedad con
un valor de la actividad del agua alrededor de 0,98 y pH cido 5.4. Es rico en nutrientes que
promueven fcilmente los microorganismos el crecimiento de Listeria monocytogenes, Salmonella
y E. coli (Ashenafi & Busse, 1991; Ashenafi, 1991). Adems, se demostr que el humus inactivar
varios agentes antimicrobianos, tales como nisina y cido ctrico, a pesar de su actividad in vitro (Al-
Holy, Al-Qadiri, Lin, & Rasco, 2006). Recuerdos recientes de productos de humus debido a bacterias
contaminacin fueron registrados recientemente por Food and Drug Administracin (FDA),
destacando la necesidad de su suministro seguro (FDA, 2015; 2016).En el presente documento,
nuestro objetivo es desarrollar pelculas de LDPE antimicrobianas que contengan una combinacin
sinrgica de carvacrol (CV) y timol (TY) y demostrando que tales sistemas pueden ejercer un efecto
antimicrobiano superior accin (Campos-Requena, Rivas, Prez, Figueroa, Sanfuentes, 2015;
 Cosentino et al., 1999; Didry, Dubreuil, & Pinkas, 1993; Guarda, Rubilar, Miltz, y Galotto, 2011).
Siguiendo la evaluacin de las propiedades interactivas de CV puro y TY contra E. coli in vitro, se
cargan combinaciones de estos OE en la nanocarriers, produciendo por primera vez un aditivo
basado en HNTs para la composicin de polmeros que contiene dos compuestos activos diferentes,
que proporcionan una accin antimicrobiana sinrgica. Despus, los HNTs cargados se incorporaron
a la matriz de LDPE mediante compounding de fusin convencional usando equipo semi-industrial,
y la capacidad de los EO voltiles atrapados por HNT para soportar la procesamiento a temperaturas
elevadas mientras se preservan los antimicrobianos actividad. La actividad antimicrobiana de CV-
TY que contienen pelculas de LDPE (en trminos tanto de larga duracin como de potencia) se
caracteriz in vitro y en un sistema alimentario real (hummus propagacin) y en comparacin con
pelculas de LDPE que contienen los EO individuales.

2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y cultivos bacterianos

Los nanotubos de Halloysite (HNT) fueron suministrados por NaturalNano (EE.UU.) y se sec a 150
C durante 3 h antes de su uso. Polietileno de baja densidad (LDPE), Ipethene 320, fue suministrado
por Carmel Olefins Ltd. (Haifa, Israel) con un caudal de fusin de 2 g / 10 min. Carvacrol (98%), timol
(98%), agar Bacto, medio Luria-Bertani (LB), nutriente El medio de caldo (NB), Tween - 80 se
adquiri de Sigma Aldrich (Israel). NB bacto-agar se adquiri de Becton Dickinson (ESTADOS
UNIDOS). Garbanzos enteros en conserva sin conservantes (Pri Galil Ltd, Israel) fueron comprados
en un supermercado local.

Escherichia coli (E. coli, ATCC 8739), se mantuvieron sobre poliestireno perlas a -80C. Para la
susceptibilidad antimicrobiana y agar difusin, se prepararon cultivos bacterianos incubando una
en 5 ml de medio LB durante 16 h a 37C bajo agitacin (250 rpm).

Posteriormente, el cultivo se diluy 1: 100 en medio LB fresco y se incub durante un ~ 1,5 h

adicional, permitiendo que las clulas para entrar su etapa logartmica. El crecimiento bacteriano
fue monitoreado fotomtricamente midiendo la densidad ptica a una longitud de onda de 600 nm
(OD600). El nmero de clulas es directamente proporcional al Mediciones OD600 (1 OD600= 1 x 108
clulas mL-1, siguiendo curva de calibracin, datos no mostrados) y la concentracin de bacterias
fue calculado a partir de los valores de OD600 obtenidos. Para experimentos de almacenamiento,
una perla se cultiv durante la noche en 3 ml de medio NB a 37C bajo agitacin (250 rpm). Al da
siguiente, la cultura se diluy 1: 100 en medio NB fresco y se incub durante un tiempo adicional ~
1,5 h, permitiendo a las clulas para entrar en su etapa logartmica. Como el cultivo alcanz un valor
de OD600 de 0,6, se diluy con 1% de NB a obtener una suspensin de material bacteriano a una
concentracin de 104 colonias unidades de formacin (CFU) mL-1.

2.2. Susceptibilidad antimicrobiana al carvacrol puro, timol y sus ensayos de combinaciones

La susceptibilidad bacteriana al carvacrol puro, el timol y sus mezclas se caracteriz por el

procedimiento de tablero para la susceptibilidad antimicrobiana para la combinacin de
antimicrobianos (Franzot y Casadevall, 1997, Pei, Zhou, Ji, & Xu, 2009).

Por consiguiente, las emulsiones acuosas de contenido de timol y carvacrol (a concentracin de

6400 mg L-1 en agua de MillyQ (18,2 m U-cm) preparado por ultrasonicacin (Vibra cell VCX 750,
Sonics & Materials Inc., EE.UU.). Las diluciones en serie del stock de carvacrol y timol emulsiones se
 prepararon en una placa de 96 pocillos en medio LB a concentracin de 0e350 mg L1 y 0e400 mg L-
1
para carvacrol (CV) y timol (TY), respectivamente. E. coli en un estadio logartmico se aadi a
cada pozo para contener aproximadamente 106 CFU mL-1 y el volumen en cada pocillo hasta un
valor total de 200 L.

Los pocillos de control se prepararon de forma similar (en la misma placa) a incluyen medio LB
fresco en lugar de cultivo de E. coli. La placa estaba sellado con SealPlate (Excel Scientific Inc.,
Victorville, CV, EE.UU.) y se incubaron a 37 C durante 16 h bajo agitacin suave en una microplaca
lector (Varioskan Flash, Thermo Scientific, EE.UU.). Absorbancia las mediciones se registraron a 600
nm cada 3 min. Las MIC de CV y TY fueron considerados como la concentracin ms baja que inhibi
completamente el crecimiento bacteriano despus de 16 h (Gutirrez, BarryRyan, & Bourke, 2008).
La concentracin inhibidora fraccionada sumada (SFIC) (Lambert, Skandamis, Coote, & Nychas,
2001) de CV y TY en una combinacin se defini como la suma de ndices FIC de CV y TY:

donde CCV y CTY son las concentraciones de CV y TY en la mezcla que produce el efecto inhibitorio
mnimo, y MICCV y MICTY son las concentraciones individuales correspondientes de CV y TY,
ejerciendo el efecto inhibitorio mnimo. Las interacciones son interpretadas como sinergismo
cuando el ndice FIC <1, aditividad cuando FIC=1, y antagonismo cuando FIC> 1 (Bell, 2005).
Todas las pruebas fueron realizadas por triplicado.

2.3. Preparacin de HNTS/CV, HNTS/CV-TY y HNTS/TY hbridos

Los hbridos HNTS/CV y HNTS/CV-TY se prepararon mediante cizallamiento mezcla de los

respectivos EOs con HNTs seguido de ultrasonicacin (Instrumento Vibra Cell VCX 750, Sonics &
Materials Inc., EE.UU.) a una amplitud constante del 40% durante 20 min en hielo. HNTs/CV
hbridos fueron preparados en una relacin en peso de 1: 2, respectivamente; HNTs / CV-TY
hbridos se prepararon de forma similar usando una mezcla CV-TY (1: 1, relacin en peso). Los
hbridos HNTs / TY se prepararon en una relacin en peso de 1: 2, respectivamente, mediante
mezcla por cizallamiento de TY fundido con HNT a 60C seguido de ultra sonicacin a la misma
temperatura. El material resultante se enfri a temperatura ambiente y se moli.

2.4. Preparacin de pelculas de LDPE

El polietileno de baja densidad se combin en estado fundido a 140C con hbridos de timol puro,
HNTs / TY, HNTs / CV y HNTs / CV-TY utilizando un Extrusora de doble husillo de 16 mm (Prism,
Inglaterra) Relacin L / D de 25: 1 con una velocidad de tornillo de 150 rpm y una velocidad de
alimentacin de 2 kg h-1 . Despus, Se prepararon pelculas (1 mm y 150 mm de espesor) moldeo
por compresin a 140C. El cuadro 1 especifica la composicin de los nanos compuestos de
polmero estudiados.

2.5. Caracterizacin

2.5.1. Anlisis gravimtrico trmico

El anlisis gravimtrico trmico (TGA) se realiz utilizando TGAQ5000 (TA Instruments, EE.UU.).
Las muestras se calentaron bajo nitrgeno desde la temperatura ambiente hasta 600C a una
temperatura velocidad de calentamiento de 20C min-1. Los resultados se analizaron utilizando
anlisis 200 versin 4.5A construir 4.5.0.5 software.

2.5.2. Microscopa electrnica de transmisin de alta resolucin

Microscopa electrnica de transmisin de alta resolucin (HRSTEM) se realizaron estudios

utilizando un Carl Zeiss Ultra Plus instrumento accionado a una tensin de aceleracin de 30 keV.
Ultra delgado las secciones se prepararon a 150 C con un Reichert E Ultracut microtome con un
cuchillo de diamante.

2.5.3. Microscopa electrnica de barrido de alta resolucin

La nano estructura de pelculas de LDPE/(HNT/CV-TY) en seccin transversal se estudi con un

escner Carl Zeiss Ultra Plus de alta resolucin microscopio electrnico (HRSEM) accionado a una
tensin de aceleracin de 1 keV.

tabla 1

Las composiciones de pelculas a base de LDPE.

Nombre del Composicin(% en peso)

filme LDPE HNTs CV TY
LDPE/TY 96 0 0 4
LDPE/(HNTs/CV) 94 2 4 0
LDPE/(HNTs/TY) 94 2 0 4
LDPE/(HNTs/CV- 94 2 2 2
TY)

2.5.4. Espectroscopia infrarroja

HNTs/CV-TY hbridos se caracterizaron por atenuado total reflectancia de Fourier-transformar

infrarrojo (ATR-FTIR) espectroscopia. Instrumento FTIR Thermo 6700 equipado con dispositivo
ATR de diamante (Smart iTR) y los espectros fueron registrados por OMNIC v8.0 software.

El contenido de EOs en las pelculas de polmero se determin mediante FTIR en modo de

transmisin. El anlisis de datos fue realizado por TQ analista v8.0 software. Se cortaron muestras
de aproximadamente 1 g del LDPE, LDPE / TY y LDPE / (HNT / CV). Los espectros se recogieron en
al menos tres lugares diferentes en las pelculas, y el peso preciso de los especmenes se
determin utilizando un equilibrio microanaltico (Mettler Toledo XP26 DeltaRange) con una
precisin de 0.0001 g.

Los especmenes se acondicionaron a 60 C durante varios intervalos de tiempo (10, 20, 40, 50,
60, 80, 100, 120 min y 48 h), mientras que su peso y los espectros (de exactamente los mismos
lugares que antes) se registraron despus de cada perodo de tiempo. La disminucin gradual de
la masa de cada se atribuy a la prdida de CV o TY. Las reas bajo el picos a 1150 cm-1 (atribuido
a TY) y 1250, 1225, 1175 y 1115 cm-1, que se atribuyen a CV (Scrates, 2001), se calcularon y
normalizado al espesor de la pelcula. Las curvas de calibracin fueron construido trazando el rea
 normalizada de picos vs. la masa de CV o TY en pelculas, determinado por pesaje diferencial
utilizando una microbalanza. Curvas de calibracin construidas usando picos en 1150 cm1 para TY
y 1115 cm1 para CV presentaron el coeficiente ms alto de determinacin (R2> 0,96), y por lo
tanto se utilizaron para determinar el contenido promedio de CV y TY en la pelcula empleando La
ley de Beer.

2.6. Ensayos antimicrobianos

2.6.1. Ensayo de difusin en disco de Kirby-Bauer

Se estudi la actividad antimicrobiana de todas las pelculas a base de LDPE utilizando la prueba
de difusin de disco Kirby-Bauer con nfasis en estableciendo la interaccin sinrgica entre CV y
TY despus de su incorporacin en LDPE por mezclado en estado fundido y produccion de
pelicula. Por lo tanto, las pelculas de LDPE que contienen concentraciones variables de CV y / o
TY. LDPE fresco (HNTs / CV-TY), LDPE / (HNTs / CV) y LDPE / TY (12 mm de dimetro y 150 mm de
espesor) se acondicionaron a 60 C para diferentes intervalos de tiempo para acelerar la
liberacin de los OE de las pelculas. Las pelculas fueron muestreados despus de diferentes
duraciones, y el contenido de las respectivas EOs fue determinado por espectroscopia de
infrarrojos de transformada de Fourier en modo de transmisin. Posteriormente, las pelculas se
colocaron sobre el superficie de una placa de agar de Luria (LB) sembrada con 108 CFU mL-1 de E.
coli (0,1 ml). Las placas se incubaron a 37C durante 18 h, y la potencia antibacteriana de las
pelculas se control por midiendo la zona de inhibicin alrededor de las pelculas. Todas las
pruebas fueron se realizaron por triplicado, y al menos 15 especmenes diferentes fueron
estudiado para cada tipo de pelcula. Se utilizaron pelculas LDPE puras como controlar.

2.6.2. Actividad antimicrobiana de las pelculas en funcin del tiempo de almacenamiento

El rendimiento antimicrobiano dependiente del tiempo de todos los LDPE pelculas (almacenadas
a temperatura ambiente) se caracteriz y comparado. Una vez al mes, la actividad antibacteriana
de la diferentes pelculas se midieron por inhibicin del crecimiento de E. coli en medios como se
inform anteriormente (Shemesh et al., 2015b). Brevemente, se colocaron pelculas (12 mm de
dimetro y 150 mm de espesor) en placas de 24 pocillos placas que contenan 1 ml de suspensin
de E. coli en una concentracin de 105 CFU mL-1 . Las placas se incubaron a 37C en agitacin
continua (100 rpm) durante 24 h. La incubacin es seguida por diluciones en serie con 1: 100 NB
(realizadas en placas de 96 pocillos).

Los recuentos de clulas viables se evaluaron mediante la tcnica de la placa de gota; 20 l se

incorporaron gotas en NB-bacto-agar en placas de Petri (9 cm) y se incubaron a 37C durante 24
h. CFU y la reduccin de logaritmos se calcul en comparacin con E. coli cultivada en NB 1: 100
medio (108 CFU mL-1 ), utilizado como control. Todas las mediciones, incluyendo los controles de
crecimiento, se realizaron por triplicado.

2.6.3. Actividad antimicrobiana de las pelculas en hummus

Hummus se prepar en condiciones estriles de conservas garbanzos sin conservantes comprados

en un supermercado local. Los garbanzos se homogeneizaron manualmente utilizando un manojo
y un mortero. La pasta de hummus resultante se diluy 1:10 en solucin salina segn al Manual
Analtico Bacteriolgico de la FDA (BAM) (Feng, Weagant, Grant, & Burkhardt, 2002) y se
 inocularon con material de E. coli suspensin hasta una concentracin final de 10 CFU mL-1.
Antibacteriana actividad de las pelculas se ensay en placas de 6 pocillos. Cada pelcula estudiada

(27 mm de dimetro) sobre un pocillo que contena 3 ml de hummus inoculado (alrededor de 14

mm por encima de la superficie hummus), dejando 13 ml de espacio libre en el pozo y asegurando
que no haya contacto entre la pelcula y el hummus. Las placas se incubaron a 37C bajo agitacin
orbital a 100 rpm durante 22 h. El ensayo puntual fue realizado mediante manchado de 10 l de
cada pocillo en NB Bacto-Agar placas en duplicados. Las placas se incubaron durante la noche a
37C, y CFU se cuenta. Cada pelcula se prob por triplicado.

2.7. Anlisis de la interaccin entre carvacrol y timol

Las interacciones entre CV y TY se evaluaron en base a los resultados obtenidos por los ensayos
de difusin en agar y analizados utilizando el enfoque de "aditividad de la dosis" (Berenbaum,
1978). Los mtodos se basan en trazar varias combinaciones de dos antimicrobianos que
producen el mismo efecto antimicrobiano. Antimicrobianas dosis de la misma eficacia fueron
conectadas por la lnea de aditividad que predice una interaccin cero. Desviaciones de esta
prediccin fueron interpretados como antagonismo o sinergia.

3. Resultados y discusin

3.1. Actividad antibacteriana de aceites esenciales y su combinacin

Estudios previos sobre la actividad antibacteriana de carvacrol, timol y sus combinaciones contra
E. coli han demostrado resultados polmicos (Burt & Reinders, 2003; Gallucci et al., 2009; Pei et
al., 2009; Rivas et al., 2010). Algunos estudios han revelado sinrgica de carvacrol y timol contra E.
coli (Pei et al., 2009), mientras que otros no lo han hecho (Gallucci et al., 2009; Rivas et al., 2010).
Esta discrepancia puede atribuirse a diferentes concentraciones de E. coli cepas y condiciones de
ensayo antimicrobiano (Pei et al., 2009).

Por lo tanto, hemos determinado los valores de CMI de carvacrol, timol y su combinacin contra
E. coli (ATCC 8739) usando el estndar procedimiento de tablero para la susceptibilidad
antimicrobiana combinacin de antimicrobianos (Franzot & Casadevall, 1997; Pei et al., 2009). El
crecimiento de E. coli en medio LB que contiene diversas concentraciones de CV y / o TY de 0 a
400 mg de L-1 estudi. Algunas de las curvas de crecimiento tpicas se presentan en la figura 1a,
mientras que la Fig. 1b resume los resultados de todas las combinaciones probadas de CV y TY, en
trminos de crecimiento bacteriano o su inhibicin e incluye ndices SFIC, calculados para
combinaciones CV-TY seleccionadas.

Sin CV o TY, las bacterias han entrado en una etapa de registro despus de un corto rezago
tiempo, alcanzando una fase estacionaria despus de 9 h (Fig. 1a, traza verde (5)). En los pocillos
que contenan 300 mg ml-1 de CV (figura 1a, traza negra (2)) o 350 mg mL-1 de TY (Figura 1a, traza
azul (1)), el tiempo de retardo fue aumentado significativamente. Sin embargo, despus de 9 h,
las bacterias han entraron en su fase log. Estos resultados estn representados por el gris clulas
en la Fig. 1b. Por encima de estas concentraciones, no hubo crecimiento bacteriano. observado
(las curvas de crecimiento no se muestran, ver Fig. 1b, clulas con puntos). Sobre la base de estos
resultados, las MIC individuales de 350 mg L-1 para CV y 400 mg L-1 para TY se establecieron, de
acuerdo con los anteriores (Cosentino et al., 1999). Posteriormente, los ndices FIC individuales
 para CV y TY y el SFIC para CV-TY combinaciones. No se observ crecimiento bacteriano y FIC <1
en pozos que contenidas de 200 mg L-1 TY y 100 mg L-1 CV (FIC = 0,79) y 100 mg L1 TY y 200 mg
L1 CV (FIC = 0,82) (ver clulas negras en la Fig. 1b), sugiriendo un antimicrobiano sinrgica
actividad de CV y TY en estos pozos. Estos resultados se correlacionaron el estudio anterior de Pei
et al. (FIC = 0,75) (Pei et al., 2009), aunque las condiciones de ensayo eran ligeramente
diferentes.

3.2. Preparacin y caracterizacin de hbridos HNTs/CV-TY

Tras la confirmacin de la actividad antibacteriana sinrgica entre carvacrol y timol contra E. coli,
una solucin de CV-TY (al una relacin en peso de 1: 1) se carg en HNTs mezclando por
cizallamiento y ultrasonicacin. Los hbridos HNTs / CV-TY resultantes se caracterizaron por TGA y
FTIR espectroscopia en trminos de estabilidad trmica y composicin, respectivamente. El
anlisis gravimtrico trmico (TGA) permite determinar la estabilidad trmica de los OE voltiles
en la hbridos en comparacin con la solucin de CV-TY puro y HNTs (Fig. 2).

El termograma y su correspondiente derivada (DTG) del CVTY representan una prdida de peso en
un solo paso de CV-TY (figura 2a), atribuido a la evaporacin completa de los OE. El peso inicial
temperatura de prdida y la tasa mxima de prdida de peso se 100 $ ^ {C} $ y 140 $ ^ {C} $
(Figura 2b), respectivamente; y en 160 C los OE son completamente perdido (Fig. 2a).
Incorporacin de la solucin CV-TY en los nanotubos mejora significativamente su estabilidad
trmica, aumentando la temperatura de inicio en ~ 40 C y la temperatura mxima tasa de
prdida de peso por 55 C (figura 2b). La prdida completa de los EOS es observada a 215C.
Estos resultados estn en total acuerdo conestudios previos (Gorrasi, 2015; Shemesh et al.,
2015b), confirmando que los HNTs atrapen y protegen los EOs voltiles. Adems, el Los resultados
de TGA confirman que el contenido inorgnico de los HNTs / CV-TY hbridos es ~31%, lo que
corresponde a un contenido inicial de HNTs hbridos de 33% p/p.

La composicin de los hbridos HNTs/CV-TY fue estudiada por ATRFTIR. La Fig. 3a presenta la
regin ms importante del espectro IR de los hbridos en comparacin con los espectros de
componentes individuales es decir, HNTs, CV puro, solucin TY y CV-TY pura. Los espectros
completos son incluido en la Informacin de Soporte (ver Fig. S1). Los espectros de CV, TY y su
solucin representan la mayor absorcin en el 900-650 cm-1, atribuida a las vibraciones fuera del
plano de CeH del anillo aromtico. Las bandas armnica y combinada debido a la CeH vibraciones
de deformacin fuera del plano se observan entre 2000 y 1660 cm-1 . La absorbancia en las
regiones 1300e1050 cm1 y 850e620 cm1 proviene de modos vibratorios de enlace carbono-X
aromtico y depende de la masa del sustituyente X (Scrates, 2001). Aunque CV y TY son
compuestos ismeros, sus espectros difieren significativamente, en particular, la localizacin del
plano de salida Las vibraciones de sacudida de CH se obtienen a 804 cm-1 para TY y al 811 cm-1
para CV (Lin-Vien, Colthup, Fateley & Grasselli, 1991; Schulz, Ozkan, Baranska, Krger, & Ozcan,
2005; Scrates, 2001 ). El HNT espectro muestra picos de absorbancia tpicos a 3700 - 3600 cm-1
(Enlaces OeH), a 1024 ya 750 cm-1 (perpendicular SieO), a 900 cm-1(deformacin de OeH) ya 796
cm-1(y estiramiento simtrico de SieO) (Pal, Kundu, Malas, & Das, 2014; Yuan et al., 2008). El
espectro de HNTs / CV-TY hbridos exhibe todos los principales elementos espectrales de los
componentes individuales, es decir, la mezcla de HNTs y EOs, y su alta reproducibilidad sugiere
homognea (Shemesh et al., 2015a).
Fig. 1. (a) Curvas de crecimiento de E. coli en medios LB que contienen timol (TY) y / o carvacrol
(CV) a diversas concentraciones. (b) Resumen de los efectos antimicrobianos de las com-binaciones
ensayadas de CV y TY. En las clulas negras, se observ inhibicin del crecimiento bacteriano. Los
nmeros en las celdas negras indican los ndices SFIC calculados para la combinacin CV-TY en el
pocillo (basado en los valores de CMI de CV y TY, 350 y 400 mg L-1, respectivamente).

Fig. 2. a) Termogramas y b) curvas derivadas correspondientes de los hbridos HNTs / CV-TY (lnea
punteada) en comparacin
con los HNTs puros y la solucin CV-TY (lneas slidas grises y negras, respectivamente).
Caracterizado por HRSTEM. La Fig. 4 muestra micrografas de secciones ultrafinas de pelculas LDPE
/ (HNTs / CV-TY). Se observa que los HNTs se dispersan individualmente y se distribuyen
homogneamente dentro de la matriz LDPE (figura 4aeb). Los estudios de HRSEM de pelculas de
LDPE en seccin transversal tambin revelan HNTs individuales dispersos en matriz de LDPE (Figura
S2, Informacin de Soporte). Las micrografas de mayor magnificacin (Fig. 4cee) representan los
HNT individuales embebidos dentro del polmero. Los HNT exhiben una morfologa caracterstica
de tubos cilndricos de extremo abierto, con un dimetro externo de hasta 150 nm. La Fig. 4ced
revela adems la estructura tubular hueca con dimetros interiores de aproximadamente 30 nm
(Lecouvet, Gutirrez, Sclavons, & Bailly,2011). Los bordes de algunos tubos parecen estar astillados,
lo que se atribuye a los daos estructurales inducidos durante el proceso de secado transversal
criognico (Figura 4e). Debe observarse que las pelculas que contienen TY o HNTs / TY eran opacas
y no homogneas, presentando regiones de cristales TY en su superficie (ver Figuras S3aeb,
Informacin de Soporte). As, debido a sus pobres propiedades pticas e in- homogeneidad, estas
pelculas no se caracterizaron adicionalmente.
El contenido de los OE y la distribucin dentro de la matriz LDPE son parmetros muy importantes,
cruciales para determinar el rendimiento ptico, mecnico y antimicrobiano de los sistemas
nanocompuestos (Shemesh et al., 2015b). La espectroscopa FTIR se emple para determinar las
concentraciones individuales de CV y TY dentro de la LDPE de una manera no destructiva. La Fig. 3b
presenta la regin ms importante de los espectros FTIR caractersticos de todas las pelculas
estudiadas. Los espectros completos se presentan en la figura S4. Aqu, usamos el picos a 1115 cm
^ {- 1} y 1150 cm ^ {- 1}, atribuidos a las partculas fuera del plano
vibraciones de deformacin en CV y en molculas TY, respectivamente (ver Fig. S5 y Fig. S6)
(Scrates, 2001). Las reas normalizadas bajo estos picos se correlacionaron con las
concentraciones de in- fusin de los respectivos OE, usando curvas de calibracin apropiadas.
En particular, los picos prominentes para CV y TY, discutidos en la seccin 3.2, se superponen con
las bandas de absorcin por infrarrojos de otros componentes de la pelcula. Por ejemplo, las
bandas caractersticas de HNTs enmascaran completamente los picos CV y TY en la regin 1100e900
cm ^ {- 1}. Adems, del plano CH, movindose las vibraciones a 804 cm ^ {- 1} para TY y al 811 cm ^
{- 1} para CV se han fusionado en una sola banda a 809 cm ^ {- 1} (Schulz et al., 2005).
La Tabla 2 presenta el contenido de CV y TY dentro de las diferentes pelculas, segn se determina
mediante anlisis FTIR. Las concentraciones de TY y CV en LDPE / CV (Shemesh et al., 2015b) y LDPE
/ TY fueron significativamente reducidas en 35% y 55%, respectivamente, lo que indica que una
parte sustancial de los OE se perdi durante la alta temperatura tratamiento. Por otro lado, el
contenido de voltiles en las pelculas LDPE / (HNTs / CV) y LDPE / (HNTs / CV-TY) se conserv en
un grado significativamente mayor (el 80% de los OE se mantuvieron durante

Fig. 3. (a) Espectros ATR-FTIR de HNTs puro, TY puro, CV puro, solucin CV-TY e hbridos HNTs / CV-
TY, presentando la regin 1400e800 cm -1. (b) espectros FTIR (modo de transmisin) de LDPE, LDPE
/ TY, LDPE / (HNTs / CV) y LDPE / (HNTs / CV-TY), presentando la regin 1400e800 cm ^ {- 1}. Se
utilizaron picos a 1115 ya 1150 cm -1 para la cuantificacin de CV y TY, respectivamente.
el procesamiento a alta temperatura). Estos resultados demuestran claramente que los OE
atrapados pueden resistir el procesamiento a temperaturas elevadas, lo que permite producir
pelculas LDPE que contienen EOs uniformes y transparentes, vase la Figura S3c (Shemesh et al.,
2015b). Adems, el contenido total de voltiles dentro de las pelculas basadas en LDPE se investig
usando TGA. Los resultados se resumen en la Tabla S1 y los termogramas respectivos se incluyen
en la Fig. S7 (Informacin de soporte). Existe una buena correlacin entre los resultados FTIR y TGA.
Hasta ahora, hemos confirmado an ms el papel crucial de los hbridos basados en HNT en retener
un alto contenido de EOs voltiles dentro de pelculas de LDPE procesadas en estado fundido
(Shemesh et al., 2015b) y demostraron que este enfoque no se limita slo a carvacrol, pero se puede
aplicar a otros OE y sus combinaciones. Adems, debe observarse que los hbridos mejoran
significativamente la calidad de las pelculas en trminos de su apariencia y propiedades pticas. A
continuacin, evaluamos la funcionalidad biolgica de los EO retenidos en las pelculas en trminos
de sus propiedades antimicrobianas y su potencial aplicabilidad para el envasado antimicrobiano
activo.

3.4. Actividad antibacteriana de las pelculas basadas en LDPE

Las pelculas de LDPE, estudiadas por la difusin de disco de Kirby-Bauer, han producido varias
zonas de inhibicin que van de 12 a 22 mm, como se muestra en la figura 5. En general, la actividad
antimicrobiana obtenida de las pelculas puede dividirse en tres regiones distintas. Al principio,
mientras que el contenido de EO est por debajo de un lmite crtico, las pelculas no

producir cualquier efecto antimicrobiano. Entonces, un aumento en el contenido de EO de,

aproximadamente, 0,9e1,5% va acompaado por un aumento significativo de la actividad
antimicrobiana. Finalmente, a concentraciones de EO superiores al 1,5%, la actividad
antimicrobiana alcanza una meseta y se independiza del contenido de EO en las pelculas de LDPE,
ya que se alcanza la mxima capacidad de difusin de los agentes antimicrobianos en condiciones
dadas. Las pelculas de LDPE conteniendo TY mostraron a menudo una actividad antimicrobiana
superior a las que contenan CV. Este efecto puede explicarse por la mayor solubilidad en agua de
TY (Burdock, 2004), lo que le permite difundirse ms rpidamente y alcanzar mayores
concentraciones en el agar (Suppakul, 2004). Es importante destacar que las pelculas de LDPE /
(HNT / CV-TY) fueron las ms eficaces (p 0,05), lo que permiti obtener mayores actividades
antimicrobianas a contenidos de EO ms bajos. Las interacciones entre CV y TY se analizaron de una
manera ms detallada utilizando el enfoque de "dosis aditividad" (Berenbaum, 1978). La figura 6 es
una representacin geomtrica de los resultados del modelo de "adicin de dosis" para pelculas
de LDPE que contienen EO, que exhibieron un dimetro de zona de inhibicin de 12 a 20 mm. Para
las zonas de inhibicin de 14e16 mm (figura 6b), utilizando la composicin de las pelculas LDPE /
TY y LDPE / (HNTs / CV) (1,2% TY y 1,3% CV respectivamente), la lnea de aditividad que predice un
cero interaccin. Sin embargo, slo se necesit 1,0% de la mezcla CV-TY para exhibir un efecto
antimicrobiano similar. Tal desviacin de la lnea de aditividad indica interacciones sinrgicas entre
carvacrol y timol. Este comportamiento se observ para todos los valores de dimetro de las zonas
de inhibicin de 12 a 20 mm (p 0,05) (figura 6aed). Por lo tanto, la combinacin CV-TY retiene su
actividad antimicrobiana sinrgica (en contacto)
Fig. 4. Imgenes HRSTEM de secciones transversales criognicas ultra-delgadas de pelculas LDPE /
(HNTs / CV-TY). Las micrografas en (a) aumentos bajos y (b) medios de la pelcula revelan
homogeneidad distribucin de HNTs dentro de la matriz LDPE; (c-e) Las micrografas de alta
ampliacin muestran HNTs cilndricos individuales incrustados en la matriz polimrica.

Tabla 2
Las concentraciones de carvacrol y timol en diferentes pelculas a base de LDPE, segn lo
determinado por FTIR espectroscopia.

Fig. 5. Actividad antimicrobiana de pelculas de LDPE que contienen concentraciones variables de

CV
y / o TY como se determina por la prueba de difusin de disco Kirby-Bauer. Actividad
antimicrobiana,
presentado en trminos de valores de dimetro de la zona de inhibicin, de pelculas LDPE que
contienen CV, TY y CV-TY. Las barras de error indican la desviacin estndar obtenida de al menos
tres repeticiones (mostradas slo para zonas de inhibicin de 12 a 20 mm).
A continuacin, se estudi el comportamiento antimicrobiano de LDPE / (HNTs /CV-TY) en
comparacin con las pelculas de LDPE que contienen el individuo EO en funcin del tiempo de
almacenamiento (vase la figura 7). Todas las pelculas frescas demuestran una reduccin del
crecimiento bacteriano de 7 rdenes de magnitud, correspondiente a la inhibicin completa.
Despus de 4 semanas de almacenamiento, antimicrobiano la actividad de las pelculas de LDPE /
TY disminuy en 4 rdenes de magnitud, mientras que las pelculas LDPE / (HNTs / CV) y LDPE /
(HNTs / CV-TY) mantuvieron su desempeo inicial. La disminucin significativa de la actividad de las
pelculas LDPE / TY se atribuye al contenido inicial bajo de TY en las pelculas (post-produccin) y la
ausencia de portadores de HNT, que han demostrado tener un profundo efecto en la cintica de
liberacin de EO de LDPE (Shemesh et al., 2015b). Despus de 8 semanas de almacenamiento, el
actividad antimicrobiana de las pelculas que contienen TY y CV completamente disminuido;
mientras que las pelculas LDPE / (HNTs / CV-TY) conservan una actividad antimicrobiana media,
vase la Fig. 7. As, este ltimo los resultados ponen an ms de relieve las ventajas de utilizar CV-
TY sinrgico en lugar de los EO individuales. Estos sistemas no slo permiten reducir el contenido
de EO dentro del polmero para conseguir un rendimiento antimicrobiano deseado, pero tambin
actividad prolongada. Curiosamente, aunque el mecanismo de sinergia entre CV y TY se discuti
anteriormente, a lo mejor de nuestro conocimiento, sigue siendo desconocido
Hasta ahora, las pelculas de LDPE / (HNTs / CV-TY) han demostrado actividad in vitro de contacto
antimicrobiano contra E. coli en LB sinttico agar y caldo. Sin embargo, la evaluacin de su actividad
antimicrobiana los sistemas de alimentos reales y, especficamente, en el espacio de cabeza es muy
importante.
As, estudiamos el comportamiento antimicrobiano de nuestras pelculas usando hummus como un
modelo de alimento relevante. El E. coli cuenta en hummus, presentado en la Fig. 8, revelan que no
slo el LDPE / (HNTs / CV-TY) inhibe completamente el crecimiento bacteriano, pero tambin
reduce la poblacin a un nivel indetectable. Las pelculas de LDPE / (HNTs / CV) mientras que son
activos, muestran una inhibicin bacteriana significativamente inferior, permitiendo que E. coli
crezca de 102 a 103 CFU mL1. en contraste, las pelculas cercanas a LDPE y LDPE / TY no muestran
efecto antimicrobiano, como E. coli en estos sistemas crecen de 102 a 107 UFC mL1. En particular,
el excelente antimicrobiano del sistema CV-TY. prevenir los brotes causados por los alimentos, que
son altamente deterioro microbiano.

Fig. 6. Actividad antimicrobiana de pelculas de LDPE que contienen concentraciones variables de

CV y / o TY de acuerdo con el modelo de 'adicin de dosis'. Las grficas resumen las concentraciones
de CV y TY en pelcula requerido para producir un valor de dimetro de la zona de inhibicin de (a)
 12-14 mm; (b) 14 - 16 mm; (c) 16-18 mm y (d) 18e20 mm. La lnea continua representa interacciones
cero entre
los OE. Obsrvese que las lneas de puntos indican los lmites de desviacin estndar y las barras de
error para pelculas de LDPE / (HNT / CV-TY) en (a) son menores que el smbolo de datos.

Fig. 7. Actividad antibacteriana frente al tiempo de almacenamiento de pelculas LDPE / (HNTs / CV-
TY) en comparacin a los sistemas LDPE / TY, LDPE / CV (*) y LDPE / (HNTs / CV). Las pelculas se
almacenan en la habitacin la temperatura y su actividad antimicrobiana en medios lquidos se
miden peridicamente. La reduccin del registro de 7 implica la inhibicin completa del crecimiento
bacteriano. La reduccin del registro de 0 corresponde a ninguna actividad antimicrobiana. Todos
los experimentos se realizaron por triplicado.

Fig. 8. Recuento de E. coli en hummus despus de la inoculacin con (102 CFU mL1) e incubacin
con la respectiva pelcula en un ensayo de espacio de cabeza (sin contacto directo) durante 22 h a
37 C. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

4. Conclusiones
Este trabajo demuestra que una mezcla de CV y TY, atrapada dentro de los HNT, se pueden
combinar en estado fundido con LDPE para producir altas calidades antimicrobianas, preservando
al mismo tiempo las interacciones sinrgicas entre CV yTY. La incorporacin de CV y TY mezcla
dentro de los HNTs aumenta en gran medida su estabilidad soportar temperaturas elevadas,
resultando en un alto contenido de
estas EO dentro de las pelculas de LDPE. Las pelculas exhiben un antimicrobiano superior actividad
contra E. coli (tanto en los ensayos de contacto como en los ensayos de microatmsfera) en
comparacin con las pelculas a base de LDPE que contienen los OE individuales, que se atribuye a
las interacciones sinrgicas entre CV y TY. Demostramos el potencial aplicabilidad de estas pelculas
como envases antimicrobianos activos en una sistema de modelos alimentarios pertinentes, como
una extensin de hummus. El CV-TY que contiene las pelculas han erradicado completamente E.
coli dentro
hummus, mientras que el rendimiento de las pelculas de referencia fue significativamente inferior.
Por lo tanto, la tecnologa presentada potencial para el desarrollo de envases activos altamente
potentes para mejorando su seguridad y prolongando su vida til. El uso de combinaciones
sinrgicas de EOs permite lograr un antimicrobiano deseado rendimiento a concentraciones ms
bajas de los componentes activos.
As, la tecnologa presentada puede potencialmente minimizar el efecto organolptico de los OE y
permiten controlar la liberacin de los antimicrobianos voltiles del envase para obtener una
actuacin.