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Apndice. Prctica 3. Toxicologa.

1. Definicin del proceso de estrs oxidante:


Estrs oxidativo = estrs oxidante
Es una situacin de desequilibrio entre la produccin de molculas
oxidantes frente a la presencia de antioxidantes (a favor de los primeros). Es
un mecanismo fundamental en la toxicidad de muchos xenobiticos y tambin en
muchos procesos de patognesis de numerosas enfermedades.
Acta no slo en procesos de oxidacin-reduccin, sino tambin en seales de
regulacin y transduccin en la expresin de genes a travs de mecanismos redox
(Boelsterli, 2007).
Ejemplos:
1. Ejemplo de agente causante de estrs oxidativo es la DMNQ (2,3,dimetil-1,4-
naftoquinona); en concentraciones intermedias (30 mM), menores de las que
producen muerte celular por necrosis onctica (100 mM), este compuesto bloquea
a la ornitin descarboxilasa, interrumpe la proliferacin celular y activa las
endonucleasas responsables de la fragmentacin nucleosmica y de la apoptosis.

2. Las endotoxinas de bacterias Gram negativas (lipopolisacridos, LPS), que en la


sangre se unen a protenas (LPS-BL), son potentes activadores de las clulas de
Kupffer del hgado, las cuales liberan ROS y citoquinas proinflamatorias, incluyen-
do el factor de necrosis tumoral alfa-TNF; el principal ROS producido es el anin
superxido, que se dismuta a perxido de hidrgeno. Si este no es rpidamente
inactivado por la catalasa y GS-Px; se puede agravar el estrs oxidativo.

3. De manera habitual, el oxgeno se encuentra en su forma ms estable (O2 ), con los


electrones que forman el enlace (p), antienlazante con el mismo espn, es decir, en
lo que se conoce como estado triplete, as el oxgeno es poco reactivo con una
velocidad de reaccin a temperatura fisiolgica baja; sin embargo por reacciones
puramente qumicas, por acciones enzimticas o por efecto de las radiaciones
ionizantes, se pueden producir una serie de especies qumicas o sustancias
prooxidantes (molculas o radicales libres altamente reactivos) que son capaces de
dar lugar a mltiples reacciones con otros compuestos presentes en el organismo,
que llegan a producir dao celular.
El dao o estrs oxidativo se ha definido como la exposicin de la materia viva a
diversas fuentes que producen una ruptura del equilibrio que debe existir entre las
sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de
eliminar dichas especies qumicas, ya sea por un dficit de estas defensas o por
un incremento exagerado de la produccin de especies reactivas del oxgeno.
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2. Concepto de radical libre y especies reactivas:
Radicales libres:

Desde el punto de vista qumico los radicales libres son todas aquellas
especies qumicas, cargadas o no, que en su estructura atmica presentan
un electrn desapareado en el orbital externo, dndole una configuracin
espacial que genera gran inestabilidad.

Son muy reactivos, tienen una vida media corta, por lo que actan cercano al sitio
en que se forman y son difciles de dosificar. Desde el punto de vista molecular
son pequeas molculas ubicuitarias y difusibles que se producen por diferentes
mecanismos entre los que se encuentran la cadena respiratoria mitocondrial, la
cadena de transporte de electrones a nivel microsomal, en los cloroplastos, y las
reacciones de oxidacin, por lo que producen dao celular (oxidativo), al
interactuar con las principales biomolculas del organismo.

No obstante lo expresado anteriormente, los radicales libres del oxgeno tienen


una funcin fisiolgica en el organismo como la de que participan en la fagocitosis,
favorecen la sntesis de colgeno, favorecen la sntesis de prostaglandinas,
activan enzimas de la membrana celular, disminuyen la sntesis de catecolaminas
por las glndulas suprarrenales y favorecen la quimiotaxis.

Se generan a nivel intracelular y extracelular, pueden ser producidos los


neutrfilos, monocitos, macrfagos, eosinfilos y las clulas endoteliales. Las
enzimas oxidantes involucradas son la xantin-oxidasa, la
indolamindioxigenasa, la triptofano-dioxigenasa, la mieloperoxidasa, la galactosa
oxidasa, la ciclooxigenasa, la lipoxigenasa, la monoamino-oxidasa y la NADPH
oxidasa. Tambin se producen por la administracin de paracetamol, tetracloruro
de carbono y furosemida, el humo de cigarrillos, las radiaciones ionizantes, la luz
solar, el shock trmico y las sustancias que oxidan el glutatin (GSH) como
fuentes de radicales libres.
Existen algunas circunstancias en que tambin se producen radicales libres como
son:
Dieta hipercalrica.
Dieta insuficiente en antioxidantes.
Procesos inflamatorios y traumatismos.
Fenmenos de isquemia y reperfusin.
Ejercicio extenuante.
Una vez que estos son formados, buscan el modo de conseguir una configuracin
electrnica estable, razn por la cual interactan con otras molculas a travs de
reacciones de xido reduccin (redox). En dichas circunstancias, hay una
transferencia de electrones que necesariamente implican la reduccin (ganancia
de electrones) y oxidacin (prdida de electrones) de las molculas participantes.

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Dicho mecanismo genera que la produccin de radicales libres sea una reaccin
en cadena, ya que al reaccionar un radical libre con una molcula no radical
inevitablemente esta ltima pasa a ser un radical libre. Dicha reaccin en cadena
solamente se detendr cuando dos radicales libres se encuentren y reaccionen
entre s.
Clasificacin:

Radical Libre

Primarios o Secundarios u Intermediarios


inorgnicos orgnicos "estables"

Originados por la Generados por los


Se orgininan por transferencia de un radicales libres, que
transferencia de electrn de un radical resultan de la
electrnes sobre el primario a una molcula reduccin o
tomo de oxgeno. orgnica o por la reaccin metabilismo de ellos
de 2 radicales primarios
entre s.

Oxgeno singlete
Anin superxido Perxido de
Radical hidrxilo Carbono hidrgeno
xido ntrico Nitrgeno cido Hipocloroso
Oxgeno Peroxinitrito
Azufre Hidroperxidos
orgnicos.

Especies reactivas:
El trmino especies reactivas hace referencia a dos tipos de molculas: los
radicales libres y los no radicales: Este conjunto de molculas se forma como
resultado del metabolismo celular y se encuentran representados dentro de los

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sistemas biolgicos por las especies reactivas de oxgeno (ROS) y por las
especies reactivas de nitrgeno (RNS), que se originan tanto en procesos
fisiolgicos normales como en procesos patolgicos. Sin excluir que tambin
existen especies reactivas procedentes de otros elementos como cloro (RClS) y
Bromo (RBrS).

Las especies reactivas de oxgeno (ROS), como el radical superxido y el


perxido de hidrgeno, se generan durante el metabolismo aerbico celular. Las
ROS pueden ser perjudiciales debido a su capacidad para oxidar lpidos, protenas
y ADN, originando un estrs oxidativo. Asimismo, las especies reactivas de
nitrgeno (RNS), como el xido ntrico (NO) y el peroxinitrito, pueden ser
citotxicas y causar un estrs nitrosativo.

Las especies reactivas del oxgeno (EROS) pueden participar en reacciones que
llevan a la elevacin de los agentes prooxidantes.

Algunos ejemplos de estos EROS (o sustancias peroxidantes) son:

Radical hidroxilo (HO)+


Perxido de hidrgeno (H2 O2)
Anin superxido (O2 )
Oxgeno singlete (1 O2)
Oxgeno ntrico (NO)
Perxido (ROO)
Semiquinona (Q)
Ozono

Algunos ejemplos de las especies reactivas del nitrgeno son:

xido ntrico (NO)


Dixido de nitrgeno (NO2)
Trixido de dinitrgeno (N2O3)
Tetrxido de dinitrgeno (N2O4)
Peroxinitrito (ONOO-)

3. Concepto de antioxidante y ejemplos:


Un antioxidante es cualquier sustancia que a bajas concentraciones,
comparado con el sustrato oxidable, retarda o previene significativamente la
oxidacin de ese sustrato. (Halliwell y Gutteridge, 1999). Como sustrato oxidable
se pueden considerar casi todas las molculas orgnicas o inorgnicas que se
encuentran en las clulas vivas, como protenas, lpidos, hidratos de carbono y las
molculas de ADN.

Los antioxidantes impiden que otras molculas se unan al oxgeno, al reaccionar-


interactuar ms rpido con los radicales libres del oxgeno y las especies reactivas
del oxgeno que con el resto de las molculas presentes, en un determinado

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microambiente (membrana plasmtica, citosol, ncleo o lquido extracelular). La
accin del antioxidante es de sacrificio de su propia integridad molecular
para evitar alteraciones de molculas (lpidos, protenas, ADN, etc.)
funcionalmente vitales o ms importantes. Su accin la realizan tanto en
medios hidroflicos como hidrofbicos.

Actan como eliminadoras (Scavengers), con el objetivo de mantener el equilibrio


prooxidante/antioxidante a favor de estos ltimos. Los antioxidantes exgenos
actan como molculas suicidas, ya que se oxidan al neutralizar al radical
libre, por lo que la reposicin de ellos debe ser continua, mediante la
ingestin de los nutrientes que los contienen.

Enzimas antioxidantes:

Catalasa (CAT): (alta concentracin en hgado y rin, baja concentracin


en tejido conectivo y epitelios, prcticamente nula en tejido nervioso y se
localiza a nivel celular); presenta 2 funciones fundamentales: cataltica y
peroxidativa y forma parte del sistema antioxidante CAT/SOD que acta en
presencia de altas concentraciones de perxido de hidrgeno.

Cataliza la reduccin del perxido de hidrgeno a agua:

H2O2 2H2O + O2

Y tambin puede actuar como peroxidasa:

H2O2 +RH2 2H2O + R

Glutatin peroxidasa (GPx): es una enzima selenio dependiente, cataliza


la reduccin de perxido de hidrgeno a lipoperxido (L-OOH), usa como
agente reductor el glutatin reducido (GSH) y se localiza en: citosol
(eritrocitos), lisosomas (neutrfilos, macrfagos y otras clulas del sistema
inmune). Existen 3 formas de GPx: GPx-c o forma celular: tiene mayor
afinidad por el perxido de hidrgeno que por el lipoperxido; GPx p o
forma extracelular: presenta afinidad semejante para ambos sutratos; GPx-
PH: Tiene afinidad especfica para los lipoperxidos. Las formas GPx-c y
GPx-p no son capaces de utilizar los lipoperxidos

GSSG = glutatin oxidado

Superxido dismutasa (SOD): est formada por un grupo de enzimas


metaloides: CuSOD y Zn-SOD: contienen cobre y cinc en su sitio activo y

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se encuentran en el citosol y en el espacio intermembranoso mitocondrial;
Mn-SOD: contiene manganeso y se localiza en la matriz mitocondrial; Fe-
SOD: contiene hierro y se localiza en el espacio periplasmtico de la E.
Coli. Estas enzimas dismutan el oxgeno para formar perxido de
hidrgeno y su principal funcin es la proteccin contra el anin
superxido.

2O2- + 2H+ - H2O2 + O2

Otros antioxidantes:

4. Reaccin de Fenton
Henry John Horstman Fenton (1894): Se produce al catalizar el perxido de
hidrgeno con metales de transicin, generalmente hierro, dando como resultado
la generacin de radicales altamente reactivos del hidroxilo (OH-).
Este ltimo radical es altamente oxidante.
Su uso prctico est en el tratamiento de contaminantes del tipo de los fenoles, el
formaldehdo, el BTEX, los pesticidas, etc.

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Tcnica Felton?
Surge como una forma adecuada de tratar una gran variedad de efluentes1
industriales muy contamiantes. Hasta ahora su aplicacin en la industria era
limitada debido a que resultaba un porceso costoso para el tratamiento de
residuos.
La tcnica es un proceso de oxidacin avanzado que consiste en la
descomposicin cataltica de agua oxigenada en presencia de sales de hierro en
un medio cido. Los radicales libres generados en la descomposicin, son los
encargados de degradar los contamianates presentes en las aguas residuales.
El proceso Fenton supone una alternativa eficiente y rentable para el tratamiento
de efluentes industriales, de cara a reducri tanto el contenido en materia orgnica
como su toxicidad.
El proceso como tal, trata la carga contamianate con una combinacin de
perxido de hidrgeno y sulfato ferroso (reactivo de Felton), a presin
atmosfrica, temperatura entre 20-40C y en condiciones cidas.

ATENCIN!
5 FRMULAS BSICAS EXPLICAN EL PROCESO COMPLETO:

Reacciones 1 y 2: son las principales y ms importantes. Reaccin 1:


describe cmo se produce un radical y un ion de hidroxilo mientras el hierro

1 Efluente: lquido residual que fluye de una instalacin.

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se oxida./ Reaccin 2: describe la recuperacin de hierro usando el mismo
perxido de hidrgeno y produciendo un radical.
Reacciones de 3 a 5: describen un proceso adicional al de la frmula 2 en
el cual el hierro oxidado est reducido usando radicales orgnicos.
La reaccin de Fenton funciona mejor a un pH menor de 3 porque a
este nivel el hierro funciona mejor como cataltico y a niveles
superiores el hierro empieza a precipitar como Fe(OH)3.
El radical de hidroxilo tiene una alta capacidad oxidativa (2.80 V) y puede romper
fcilmente enlaces de molculas. Esta capacidad oxidativa es ms elevada que la
de muchos otros oxidantes como cloro, oxgeno o perxido de hidrgeno y le
facilita a degradar muchos compuestos orgnicos y inorgnicos.
5. Concepto de peroxidacin de lpidos:
La peroxidacin lipdica representa un mecanismo importante de dao tisular
asociado al envejecimiento y enfermedades asociadas. Es en general, el producto
del ataque de los EROS a los cidos grasos polinsaturados que dorman parte de
los fosfolpidos de la membrana celular. Los objetivos de este proceso son:

a) Formar radicales libres lipdicos que peroxiden, a su vez, a otros lpidos,


entre ellos a los constituyentes de la membrana celular. Esta peroxidacin
puede ser interferida por la vitamina E; como resultado de la peroxidacin
se produce lesin de la membrana y liberacin de malonildialdehdo.

b) Ser reducido por la enzima glutationperoxidasa (selenio dependiente) y el


concurso de glutatin, glutationreductasa, NADPH y G-6-Pdeshi-
drogenasa, a alcoholes grasos. La GSperoxidasa se encuentra en el citosol
y en las mitocondrias.
Los lpidos peroxidados forman hidroperxidos lipdicos que pueden seguir dos
caminos (Figuras 6.5 y 6.6).

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Desarrollo:
Tres etapas:
1. Iniciacin de la peroxidacin lipdica, en la que un radical libre ataca a un
carbono de la cadena aliftica de un cido graso, ocurre la abstracin de
hidrgeno del grupo metileno (-CH2-) unido a un carbono flanqueado por
dobles enlaces de un cido graso poliinsaturado, con la formacin de una
especie radiclica (radical alqulico: L). El hecho de que exista un doble
enlace, debilita los enlaces carbono-hidrgeno del tomo de carbono
adyacente a dicho doble enlace. Los radicales formados se estabilizan por
resonancia con el doble enlace.

2. Fase de propagacin, en la que ocurre una reaccin en cadena con la


extensin del dao y la formacin de ms especies radiclicas. La especie
radiclica formada en la primera fase reacciona con el oxgeno y forma un
radical peroxilo (LOO) que puede reaccionar con otros cidos grasos
poliinsaturados adyacentes y originar un hidroperxido o lipoperxido
(LOOH) y un radical alqulico; as se produce una reaccin en cadena y el
dao a un nmero creciente de cidos grasos.
El LOO puede abstraer hidrgeno de molculas con enlaces dbiles como el OH
cromanol del a-tocoferol y se producen una serie de reacciones en las que

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intervienen el ascorbato y el glutatin reducido que permiten la regeneracin de la
vitamina E.
1. Fase de terminacin o descomposicin, en la que hidroperxidos formados
se descomponen en etano, pentano, aldehdos reactivos y cetonas. Los
aldehdos formados, como el malonildialdehdo y el 4-hidroxinonenal,
pueden reaccionar con protenas y cidos nucleicos, lo que determina
efectos citotxicos, genotxicos y mutagnicos, as como un papel
patognico en varias enfermedades .
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6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en
funcin del procedimiento experimental, prestar particular atencin a las
tablas 2 y 5:
Los antioxidantes se clasifican ms a fondo como solubilidad en el agua
(hidroflica) o en los lpidos (hidrofbicos). Los antioxidantes solubles en agua
reaccionan con los oxidantes en el citosol de la clula y el plasma de sangre. Por
otra parte los antioxidantes lpido-solubles protegen las membranas celulares
contra la peroxidacin del lpido.

Antioxidantes a utilizar:
cido felrico = poco soluble en agua pero muy soluble en alcoholes.
Alopurinol = posee poca solubilidad en alcoholes y agua.
Vainillina = posee una solubilidad en agua de 1g / 100 mL pero soluble en
alcoholes ( 1 g / 3 mL).
BHT(butilhidroxitolueno) = este antioxidante es insoluble en agua, pero
soluble en metanol.
7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o
complete lo solicitado en los incisos 7a 7c:
a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies
qumicas que se determinan espectofotometricamente en las
pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura del radical
superoxido, respectivamente:
b. Propsito de la adicin secuencial de xantina, EDTA, solucin
amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y
Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de
captura de radical superoxido.
c. Identificar las especies reactivas de oxgeno, indicando si son
radicales o no.

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8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo
solicitado en los incisos 9a 9c:
a. Propsito de la adicin de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo
de FOX2.
b. Propsito de la adicin de cido hexenico en los tubos de captura
de radical OH-
c. Proposito de la adicion de H2O2
d. Identifique la reaccin de Fenton en el diagrama.
http://ehscc.umich.edu/wp-content/uploads/OxidativeStressSPN.pdf
http://bvs.sld.cu/revistas/mil/vol31_2_02/MIL09202.pdf
http://www.scielo.org.co/pdf/nova/v10n18/v10n18a08.pdf
file:///Users/MariaLucila/Downloads/pdf928.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/endoc/er-2006/er064c.pdf

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