Principios de las pruebas

moleculares

Dra. J.G.Avila
 Pruebas Moleculares
Son tcnicas de
laboratorio que se usan
para aislar ADN,
purificarlo, extraerlo,
amplificarlo, cortarlo con
enzimas de restriccin
en determinadas
regiones, pegarlo, etc.
 Mtodos

PCR
Microarray : tipo de chip en molcuolas orgnicas
Southern blot : detecta por hidrlisis la presencia
de una fraccin de ADN en una muestra
Western blot : Deteccin de proteias especficas
separadas por ele4ctroforesis
Northern blot : Para estudio de patrones de
expresin de una molcula de ARN
Qu es la PCR?

La Reaccin en cadena de la polimerasa es una

tcnica de la Biologa Molecular para amplificar
una varias copias de ADN a travs de varias
ordenes de magnitud generando miles a
millones de copias de una secuencia de DNA
particular
ADN
 Historia
1960 Kromberg aisl y purific la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridacin del DNA.
1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restriccin.
1967 Se descubre la ADN ligasa
Boyer Cohen y Berg desarrollan las tcnicas de clonacin
1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las tcnicas de clonacin
1975 Southern desarrolla la hibridacin del ADN con sondas especficas
1977 Mtodos de secuenciacin de ADN (Sanger y Gilbert)
1981 Primeros animales transgnicos
1981 Invencin de la PCR (Kary Mullis)
1997 Secuenciacin de genomas bacterianos completos
2001 Secuenciacin del Genoma Humano
1960 Kromberg aisl y purific la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridacin del DNA.
1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restriccin.
1967 Se descubre la ADN ligasa
1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las tcnicas de clonacin
1975 Southern desarrolla la hibridacin del ADN con sondas especficas
1977 Mtodos de secuenciacin de ADN (Sanger y Gilbert)
1981 Primeros animales transgnicos
1985 Invencin de la PCR (Kary Mullis)
1997 Secuenciacin de genomas bacterianos completos
2001 Secuenciacin del Genoma Humano Principales descubrimientos y avances de la era molecular
PCR
Consiste de ciclos repetidos de calentamiento y
enfriamiento de la reaccin para la separacin de las dos
hebras de DNA y su replicacin enzimtica

Amplificacin
exponencial : a
medida que la PCR
progresa, el nuevo
DNA generado es
usado como plantilla
para la replicacin ,
poniendo en marcha
una reaccin en
cadena en la que la
plantilla de DNA es Los primers cebadores y la DNA
amplificada polimerasa hacen posible la
amplificacin selectiva y repetida
Material
Pllantilla de DNA : Regin de DNA blanco (target) a ser amplificada
Dos primers (cebadores) : que son complementarios a la terminacin 3
de cada una de las cadenas complementarias del DNA blanco

Taq polimerasa : temperatura

ptima alrededor de 70C
Desoxinucleosidos trifosfato
(dNTPs) : a partir de los cuales
la DNA polimerasa sintetiza
una nueva cadena de DNA

Solucin buffer : ambiente qumico estable

Cationes divalentes (Mg2+),monovalentes (k)
Aceite: para cubrir el lquido mezcla de reactivos y evitar su evaporacin
durante los ciclos
 PCR pasos
1. Desnaturalizacin a 94-
96 C
2. Alineacin a 65C
3. Elongacin a 72C

http://slideplayer.es/slide/5818402/
 Estadios de la PCR

Amplificacin exponencial: En cada ciclo la cantidad

del producto es doblada. La reaccin es muy sensible,
solo se requiere cantidades diminutas de DNA para
iniciar la prueba
Nivelacin de la reaccin : La reaccin se enlentece en
la medida que se va perdiendo la actividad de la DNA
polimerasa y se van consumiendo los dems reactivos
Meseta : No mas produccin de productos por
extincin de la enzima y reactivos
Rol de la biologa molecular
en la microbiologa clnica

Dra. J.G.Avila
Aplicaciones en Medicina
Deteccin y diagnstico de
enfermedades infecciosas.
Diagnstico de
enfermedades malignas
como leucemias y linfomas
Diagnstico de
enfermedades hereditarias
Identificacin de huella
gentica (paternidad,
forense)
Etc
 Aplicaciones en Microbiologa

La aplicacin diagnstica de la PCR en microbiologa

se basa en la deteccin de agentes infecciosos y la
discriminacin de cepas no patgenas de cepas
patgenas en virtud de sus genes especficos

Permite la identificacin de microorganismos de

desarrollo lento no susceptibles de ser cultivados
como mycobacterias, bacterias anaerobias, virus.
 Aplicaciones en Microbiologa
La PCR puede ser usada para el anlisis
diagnstico y secuenciacin del genoma viral
La alta sensibilidad de la PCR permite la deteccin
temprana del virus incluso antes del inicio de los
sntomas de la infeccin. Muy importante para el
inicio temprano del tratamiento
La cantidad de virus carga viral en el paciente
puede cuantificarse mediante tcnicas de
cuantificacin de ADN basadas en PCR
Bacterias
Son los organismos ms
antiguos sobre la tierra Cmo
han hecho para sobrevivir?
La respuesta est en los
mecanismos especializados de
su gentica
Escherichia coli primera en
aparecer hace millones de aos
Una sola EC produce en 18 hrs
2000 millones de cels/ml
 Bacterias
Toda la
informacin
gentica esencial
se encuentra en
una sola molcula
de ADN circular,
bicatenario, 4000
Kpb cromosoma
bacteriano
Estructura Genoma
Longitud del genoma de E coli
es mil veces su tamao.
Adopta una estructura
terciaria de super
enrrollamiento de sentido
contrario -> fuente de energa

Macromolculas: nucletidos
unidos en forma covalente
por enlaces fosfodiester entre
C 3 5
 Las tcnicas microbiolgicas tradicionales para el
aislamiento e identificacin bacteriana (cultivo
bacteriano) toma tiempo y son poco especficas.
De otro lado el cultivo de hongos y sobre todo
virus es complicado por lo que no se realiza en
laboratorios hospitalarios
El diagnstico por medio de tcnicas moleculares
ha venido a facilitar la labor, adems de ser muy
sensibles y especficas, capaz de identificar
subtipos virales, bacterianos y hongos.
 Material de lectura
Tcnicas de Biologa Molecular : https://www.
youtube.com/watch?
v=khKuFRpnFWU&list=PLuWhs57m8BlTYOqkLvp9C0w6T45kQIu5Z&index=
36

PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa :

http://slideplayer.es/slide/5818402/

Biologa molecular en Infectologa. Parte II:

Diagnstico molecular de agentes infecciosos.
Rev Chil Infect (2003); 20 (1): 26-38
Gracias