Guias Bioquimica 2

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA II
ESTRUCTURA DE LOS INFORMES DE LABORATORIO (LIBRETA DE LABORATORIO)
INTRODUCCIN: la Introduccin en cualquier tipo de trabajo escrito es el primer contacto que tiene el lector con el
texto, en el que se plantean los temas y aspectos que comprenden el trabajo.
MATERIALES Y MTODOS: En este tem se refiere a los procedimientos utilizados para la realizacin de la prctica
RESULTADOS Y ANLISIS: Los resultados se refieren a los datos recogidos durante el desarrollo de la prctica sean
cualitativos o cuantitativos. Los grficos y tablas que se muestren deben estar numerados y tener una leyenda o ttulo.
La discusin o anlisis de resultados generalmente suele corresponder a un argumento lgico, basado en los
resultados y no una repeticin de estos. En ocasiones, puede ser til, comparar los resultados obtenidos con los
reportados en la literatura, mirar si hay discrepancia respecto a los valores aceptados o esperados, indicando las
causas y algunas sugerencias que puedan mejorar el mtodo experimental.
CONCLUSIONES: Debe hacerse una sntesis breve de los conocimientos verificados y de lo aprendido al cumplir con
los objetivos de la prctica. De ninguna manera sern fragmentos copiados de textos o conclusiones extradas de
otras experiencias realizadas. Otros aspectos a tratar son las dificultades encontradas durante la realizacin del
experimento que hayan podido influir en los resultados, si son o no vlidas las aproximaciones hechas, son entre otros,
temas que tambin pueden tratarse como discusiones de resultados.
BIBLIOGRAFA: Anotar los recursos bibliogrficos utilizados para el desarrollo de la prctica. Segn sea libro, artculo
cientfico, etc. Siguiendo normas APA, ltima actualizacin
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Y QUMICA

PRCTICA NO 1: PROPIEDADES DE LAS PROTENAS
1. OBJETIVOS
Realizar ensayos de coagulacin con soluciones de protenas, empleando diferentes solventes y aplicando
aumentos de temperatura.
Determinar el punto o temperatura de coagulacin de una protena, al efectuar variaciones en el pH de la
solucin.
Realizar ensayos de precipitacin de protenas, al mezclarlas con sales de metales pesados, o con cidos
dbiles, o neutralizando sus cargas elctricas al llevarlas a su punto isoelctrico.
2. ASPECTOS TERICOS
La estructura terciaria de una protena se denomina tambin estructura nativa y corresponde a la forma que adopta
una protena como resultado de las diferentes fuerzas que intervienen en todo el complejo estructural, tambin es
llamada Estructura'espacial'de'la'protena, esta adems depende de la secuencia de aminocidos y puede
predecirse, su dominio corresponde a la regin de la cadena polipeptdica que puede plegarse de manera estable e
independiente.
Las principales fuerzas que estabilizan a la estructura terciaria son:
1. Puentes disulfuro
2. Interacciones electrostticas
3. Puentes de hidrgeno
4. Interacciones hidrofbicas e hidroflicas
La estructura terciaria de una protena es la responsable directa de sus propiedades biolgicas, ya que la disposicin
espacial de los distintos grupos funcionales determina su interaccin con los diversos ligandos. Para las protenas
que constan de una sola cadena polipeptdica (carecen de estructura cuaternaria), la estructura terciaria es la
mxima informacin estructural que se puede obtener.
Cuando una protena se disuelve en agua, las fuerzas hidrofilias y los puentes de hidrogeno, participan positivamente
aportando un mayor grado de solubilidad entre ms efectivas sean estas interacciones. Sin embargo cuando factores

fsicos como el calor, las radiaciones, etc. o cambios qumicos como variaciones en los valores de pH y la presencia
de solventes que afecten estas interacciones, pueden producir serias alteraciones en la solubilidad. Cuando el cambio
producido sobre la estructura proteica es lo suficientemente considerable para vencer estas fuerzas
intermoleculares, puede ocurrir la destruccin o deterioro de la estructura nativa y se considera que en estas
condiciones la protena es desnaturalizada. El fenmeno fsico que se observa en este caso, es la formacin de un
coagulo o procesos de coagulacin. La temperatura o punto de coagulacin a lka cual empieza a observarse el
fenmeno puede empezar a temperaturas cercanas a los 50C, aumentando el tamao del coagulo a medida que la
temperatura aumenta.
Es importante destacar, que este proceso es irreversible, debido a que la protena una vez desnaturalizada no vuelve
a adquirir su estructura nativa original.
Otro fenmeno ampliamente utilizado como mtodo de separacin y extraccin de protenas, es la formacin de
precipitados.
Antes de mencionar este proceso conviene mencionar las cargas elctricas netas que posee una protena. Por lo
general una protena debido al gran nmero de restos cidos, bsicos, hidroflicos y el pH donde se encuentre,
presenta una resultante de cargas positivas o negativas. Un precipitado puede formarse por varias razones:
1. Cuando la protena se encuentra a un valor de pH en el cual la carga neta es cero. La protena perder solubilidad y
se precipita. Este pH se denomina punto isoelctrico o pI.
2. Si la protena se encuentra en un medio muy bsico o un pH muy por encima de su punto isoelctrico, la carga neta
de la protena ser muy negativa y la adicin de sales con metales pesados (Ag +, Cu2+, Pb2+, Fe3+ ) , producirn
complejos entre iones con la protena, los cuales son observados como precipitados o sales muy poco solubles.
(PROTENA)-n + nAg+ n(PROTENA)Ag

3. Cuando la protena se encuentra en un medio muy cido, esto es a pH muy por debajo de su punto isoelctrico. La
carga neta de la protena ser muy positiva. Es estos casos, la adicin de sales de cidos dbiles como acetato de
sodio, tanato de sodio, formarn un precipitado entre la protena con el anin de la sal.
(PROTENA)+n + nAcetato de sodio n(PROTENA)Acetato

Estos precipitados a diferencia de los coagulos son reversibles y se reconocen porque logran disolverse al agregar
un exceso de solvente.
La presencia de solventes como etanol o acetona pueden precipitar la protena, ya que causan una extraccin de agua
desde la estructura proteica, disminuyendo el contenido de agua hasta permitir su precipitacin.

La coagulacin por calentamiento se producir ms rpidamente cuando se realiza en el punto isoelctrico, debido a
la perdida de cargas elctricas en este pH. Cuando el fenmeno se realiza a pH muy diferente al punto isoelctrico,
el proceso observado se denomina floculacin. El cual puede retornar a la solubilidad al enfriar la solucin.
3. MATERIALES EMPLEADOS
Solucin de albmina de huevo, solucin de NaCl 5%, Etanol, HCl concentrado, 0, 1N, HNO 3 concentrado, NaOH
concentrado, 0,1N, 6N, Solucin Buffer pH= 4.7, Solucin HgCl2 2%, Acetato de plomo (CH3 COO)2Pb 2%, Solucin de
AgNO3 2%, Solucin de CUSO4 2%, acido pcrico, cido tnico, cido actico, solucin de ferrocianuro de potasio,
4. PARTE EXPERIMENTAL
a. Preparar una solucin de albmina: separe la clara de un huevo y despus de batirla durante unos minutos mzclela
con cinco veces su volumen de agua.
Luego filtrar la mezcla a travs de una tela apropiada y conservar el filtrado para los ensayos descritos a continuacin.
b. Determinar el punto de coagulacin de la albmina de huevo: tomar 5 tubos de ensayo limpios y secos, agregarles
a cada uno 2mL, de solucin de albmina y proceder como se indica en la siguiente tabla.
TUBO PROCEDIMIENTO OBSERVACIN

1 1 mL de NaCl 5% calentamiento gradual en bao mara. Temperatura de coagulacin
2 4mL de etanol Se produce coagulacin?
3 8 gotas de HCl concentrado, mezclar. Se produce coagulacin?
4 8 gotas de HNO3 concentrado, mezclar Se produce coagulacin?
5 8 gotas de NaOH concentrado Se produce coagulacin?
c. Determinar el punto de coagulacin de una protena (albmina de huevo), al cambiar el pH del medio. Tomar 3 tubos
de ensayo, agregarles 4.5 mL de solucin de protena y proceder como se indica en la siguiente tabla.

1 0,5 mL de HCl 0.1N calentar gradualmente en bao mara. Temperatura donde observa el
cambio
2 0,5 mL solucin buffer pH 4.7. Calentar gradualmente hasta Temperatura donde observa el
que hierva ala bao mara. cambio
3 0,5 mL de NaOH 0.1N calentar gradualmente en bao mara Temperatura donde observa el
cambio
d. Retirar los tubos 1 y 3, enfrindolos y agregar a cada uno 5 mL de Buffer pH= 4.7. Observe los resultados. Calentar
gradualmente en bao mara, observe Se forma precipitado?
e. Precipitado de protenas con iones metlicos. Tomar 5 tubos de ensayos limpios y secos, adicionar a cada uno de
ellos 2 mL de solucin de albmina y proceder como se indica en la siguiente tabla.


1 8 gotas de HgCl2 2% Observa precipitado?
2 8 gotas de solucin de (CH3 COO)2Pb 2%, acetato de plomo Observa precipitado?
3 8 gotas de solucin de FeCl3 2% Observa precipitado?
4 8 gotas de solucin de AgNO3 2% Observa precipitado?
5 8 gotas de solucin de CUSO4 2% Observa precipitado?
Adicionar 20 gotas de NaOH 6 N y anote las nuevas observaciones.
f. Precipitados de protenas con reactivos cidos. Tomar tres tubos de ensayos limpios y secos, adicionar a cada uno
de ellos2 mL de solucin de protena y proceder como se indica en la siguiente tabla.

1 8 gotas de cido pcrico Observa precipitado?
2 8 gotas de cido tnico Observa precipitado?

3 5 gotas de cido actico ms 8 gotas de ferrocianuro de Observa precipitado?
potasio
Anote las nuevas observaciones, despus de adicionar:
1. Exceso de reactivo.
2. NaOH diluido.

PRCTICA NO 2: FOTOCOLORIMETRA
1. OBJETIVOS
Analizar los principios generales de la tcnica de fotocolorimetra

Manejar adecuadamente el fotocolormetro
Determinar el espectro de absorcin de un compuesto y seleccionar su longitud de onda ptima o de mxima
absorcin.
2. ASPECTOS TERICOS
La fotocolorimetra es un mtodo ptico de anlisis que mide la cantidad de luz absorbida por una sustancia
coloreada. Como cualquier otro mtodo espectroscpico, se basa en la medida de la intensidad y la longitud de onda
de la radiacin electromagntica que ha atravesado la materia o que sta emite.
Se fundamenta en las leyes de Beer y de Lambert: La ley de Lambert dice: "Cuando un rayo de luz monocromtico
(de una nica longitud de onda) pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente al
aumentar la longitud del medio absorbente:
I = Io . e-k.l .
La ley de Beer dice: "Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentracin:
I = Io e- e . c .
La unin de ambas leyes nos da la ley de Beer-Lambert:
I = Io e- e . c. l
El fotocolormetro lo que determina es la absorbancia o densidad ptica, que es: A = log Io/I = e . c. l
Cuando se comparan dos soluciones una conocida o estndar y otra desconocida. La ecuacin A/c= cosntante
puede utilizarse para relacionar ambas soluciones.
Siendo c= A/2,3e.l
Por lo tanto:

=


Despejando la concentracin C de la muestra, se obtiene :

Cmuestra= *Amuestra
Esta ecuacin es fundamental en clculos fotocolorimtricos. La representacin grfica de la concentracin vs

absorbancia, corresponde a una lnea recta que pasa por el origen y la pendiente puede obtenerse calculando las
absorbancias para muestras estndar o conocidas.
3. MATERIALES EMPLEADOS: fotocolormetro, solucin de albmina y reactivo del biuret.
4. PARTE EXPERIMENTAL:
1. MANEJO DEL FOTOCOLORMETRO
a) Calibrar el instrumento segn las siguientes recomendaciones:
Seleccionar la longitud de onda

Colocar la celda o tubo que contiene la solucin blanco, la cual se prepara mezclando 2 mL del reactivo de
biuret con 2mL de agua destilada.
Colocar el tubo que contiene la solucin problema.
B) Determinar el espectro de absorcin de un compuesto:
Coloque la longitud de onda del fotocolormetro en 420nm

Preparar dos tubos o celdas con solucin suficiente ( del tubo o celda), en una agua y en la otra solucin
de albumina coloreada con el reactivo del biuret.
Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, lmpielos externamente con papel o tela
adecuada.
Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.
Coloque el tubo con la solucin problema y anote la absorbancia o tramitancia indicada en el instrumento
Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm ( contine tomando lecturas
hasta alcanzar una longitud de onda de 620nm
Dibuje la grfica absorbancia vs longitud de onda. Observe que se presentar una longitud de onda en la cual
habr una mayor absorcin. Esta longitud de onda debe ser una constante, la cual ser tenida en cuenta
para posteriores anlisis de soluciones de albmina.

5. CUESTIONARIO
a) En qu consiste la reaccin del Biuret?

b) Cules son las leyes cuantitativas de la absorcin de luz?
c) Cmo se construye una recta de calibracin?
d) Qu es desarrollar un mtodo cuantitativo?
e) Qu es el Lmite de Deteccin (LOD)?
f) Qu es el Lmite de Cuantificacin (LOQ)?

PRCTICA NO 3: CURVA DE CALIBRACIN PARA SOLUCIONES DE ALBMINA
1. OBJETIVOS
Adquirir habilidades ene le manejo del instrumento (GENESYS 10S UV-Vis).

Obtener experiencia en curvas de calibracin para otras sustancias.
Utilizar la curva de calibracin de albmina para determinar cuantitativamente la concentracin en una
muestra problema.
2. ASPECTOS TERICOS
Los compuestos que contiene dos o ms enlaces peptdicos produce un color violeta caracterstico con soluciones
diluidas de sulfato de cobre CuSO4 en solucin alcalina ( de NaOH o KOH). El color se debe al compuesto de coordinacin
formado al existir enlaces qumicos, entre los pares de electrones libres del tomo de nitrgeno, presentes en los
enlaces peptdicos de las cadenas polipeptdicas, con el ion cobre, presentando un mximo de absorcin a 540 nm.
Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones Cu +2 y las diferentes protenas son similares pero no
idnticas por lo tanto se puede utilizar una protena como patrn de calibracin.
La curva de calibracin obtenida por este mtodo, se har utilizando como patrn una solucin de albumina, cuya
concentracin es 8 mg/mL, preparada con solucin salina al 0,9%.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Solucin de albmina de concentracin 8 mg/mL (Solucin patrn), reactivo del
biuret, solucin salina al 0,9 % y espectrofotmetro GENESYS 10S UV-Vis.
a) Rotular 8 tubos de ensayo y colocar las siguientes soluciones, como se indica en la tabla siguiente tabla 3-1.

TUBOS SOLUCIN ESTNDAR DE ALBMINA SOLUCIN SALINA REACTIVO DEL BIURET

(mL) (mL) (mL)
1 BLANCO 0 2 2
2 0,1 1,9 2
3 0,3 1,7 2
4 0,5 1,5 2
5 0,7 1,3 2
6 0,9 1,1 2
7 S.P - - 2
8 S.P - - 2
b) Preparar cada tubo como est indicado en la tabla, tomando en cuenta que los dos ltimos tubos corresponden a
las soluciones problema, que sern entregados a cada mesn. Luego de preparado lo ltimo que se le agrega es el
Biuret y se deja en reposo durante 15 minutos.
c) Colocar en el espectrofotmetro la longitud de onda de mxima absorbancia obtenida en la experiencia sobre el

espectro de una solucin de albmina. Registre la absorbancia para cada uno de los tubos.
d) Calcule la concentracin en cada uno de los tubos aplicando la frmula de dilucin (C iVi=CfVf) y tabule los resultados
de absorbancia y concentracin
e) Grafique los resultados de absorbancia y concentracin tabulados en (d). La lnea resultante corresponde a la curva
de calibracin. .
f) Se pueden utilizar como muestras problemas, soluciones Colocar el tubo que contiene la solucin problema.
5. CUESTIONARIO
g) Que se entiende por curva de calibracin?

h) Cul es la importancia de una curva de calibracin?
i) Por qu el reactivo de Biuret se agrega despus de todo lo dems?
j) Determine la concentracin de las soluciones problema para cada caso, tanto con la formula como con la
grfica y compare resultados.
6. BIBLIOGRAFA
Harris, P. M.; Mack, E. (Jr.) and Blake, F. C. 1928. The atomic arrangement in the crystal of orthorhombic iodine. Jour.
Amer. Chem. Soc. 50: 1583
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
http://es.scribd.com/doc/18666577/8-Determinacion-de-Proteinas-Sericas

PRCTICA NO 4: CUANTIFICACIN DE PROTENAS APLICANDO EL MTODO DE PATRN DE BIURET
1. OBJETIVOS
Separar en una muestra de suero sanguneo, las globulinas de las protenas totales.
Calcular la concentracin de protenas totales, globulinas y albminas en una muestra de suero sanguneo
2. ASPECTOS TERICOS: Para clasificar a las protenas se toma en cuenta su composicin y su solubilidad; se ha
establecido que las protenas simples son las que nicamente contienen alfa-aminocidos; las protenas conjugadas
contienen alfa-aminocidos y adems otras sustancias como fosforo, carbohidratos, lpidos, metales, etctera; y por
ltimo, las protenas derivadas son los productos de degradacin de las simples y las conjugadas.
PROTEINAS SIMPLES: Se incluyen en este grupo a las Albminas, Globulinas, Glutelinas, Prolaminas o gliadinas,
Histonas, Escleroproteinas y Protaminas.
PROTEINAS CONJUGADAS: Fosfoprotenas, Glucoprotenas, Nucleoprotenas, Cromoprotenas, Metaloprotenas, y

Lipoprotenas.
PROTEINAS DERIVADAS: Protenas derivadas primarias ( Proteanas, Metaprotenas y Protenas coaguladas);

Protenas derivadas secundarias (Proteosas, Peptonas y Pptidos)
Las protenas tambin se pueden clasificar de acuerdo a una caracterstica especial establecida mediante la
aplicacin de rayos X: Protenas Fibrosas y Globulares.
Fibrosas: La mayor parte o casi toda la protena est organizada de manera paralela a un slo eje, las
protenas fibrosas son generalmente fuertes mecnicamente, Son generalmente insolubles, Generalmente
tiene un papel estructural. Como piel, tejido conectivo, fibras (pelo, lana, seda) , secuencia favorece tipo
especial de estructura 2ria propiedades mecnicas especiales ,alfa Queratinas, Beta-Queratinas,
Fibrona, Colgeno, Elastina
Globulares: Las hemoprotenas son un grupo de protenas especializadas que contienen al grupo
prosttico hemo unido fuertemente a la cadena polipeptdica. El papel de este grupo est determinado por
el medio creado por el arreglo particular de la estructura tridimensional de la protena que lo contiene. Por
ejemplo, el grupo hemo de los citocromos funciona como un acarreador de electrones a medida que es
oxidado o reducido. Por el contrario, el grupo hemo de la catalasa es parte del sitio activo cataliza la ruptura
del perxido de Hidrgeno. En la hemoglobina y la mioglobina, que son las dos hemoprotenas ms
abundantes en los mamferos, el grupo hemo funciona uniendo reversiblemente al oxgeno.
La alteracin en el plasma de los valores normales de estas protenas se denomina disproteinas y estn
relacionados con diferentes casos clnicos. Las protenas suricas totales deben estar entre unos valores
considerados normales de 6 a 8 gramos por 100 mL de suero. Donde las albuminas tienen un promedio de 4
g/100 mL y las globulinas un promedio de 3g/100mL.
Las protenas estn presentes en todas las clulas y en los distintos lquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L),
orina (100-200 mg/L), lquido cefalorraqudeo (15-45 mg/dL). En las protenas plasmticas se pueden diferenciar:

Protenas plasma-especficas: componentes habituales del plasma.

Protenas no plasma-especficas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras clulas. Las
protenas plasma-especficas (albmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hgado, pero
tambin en: clulas plasmticas, ganglios linfticos, bazo y mdula sea. La concentracin total como la de
las distintas fracciones pueden verse alteradas. As, la determinacin de las protenas totales sirve para el
diagnstico de:
Afecciones hepticas
Afecciones de la mdula sea
Otras afecciones del metabolismo o nutricionales
El Mtodo del Biuret En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un color
purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se utiliza una solucin de albmina.
Protena + Cu+2 Complejo Cu-Protena (prpura) Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del
cogulo o el plasma de las clulas antes de 3h. Si el paciente est acostado durante la extraccin el resultado ser
menor.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Solucin acuosa de NaCl al 0,9%, Solucin saturada de sulfato de amonio ( 750 g en 1
Litro de agua), Solucin patrn de de albmina ( 0,45 g en 100 mL de solucin salina), Solucin de biuret, muestra de
suero sanguneo humano, centrfuga y Espectrofotmetro Genesy 10S UV/visible)
A) SEPARACIN DE LAS GLOBULINAS DEL SUERO
1. Colocar en un tubo de centrifuga 1 mL de suero sanguneo y 4 mL de agua destilada.

2. Agregar a la solucin anterior 5 mL de sln saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando suave pero
constantemente.
3. Se deja reposar por 10 minutos la solucin obtenida en el inciso 2 y luego centrifugue a 2000rpm, por espacio de
15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.
4. Separar el lquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de sln salina. Conserve esta
solucin para determinar el porcentaje de globulinas.
B) PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE PROTENAS TOTALES
1. Medir 1 mL de suero sanguneo y diluirlos hasta completar 20 mL agregndole solucin salina.
C) MEDICIN DE LA ABSORBANCIA EN LAS SOLUCIONES QUE CONTIENEN PROTENAS.
1. Se dispone de 4 tubos de ensayo y se deben preparar de acuerdo a la tabla 4.1.

2. Se agita cada tubo y se dejan reposar por 30 minutos.
3. Se llevan cada uno de los tubos al espectrofotmetro fijado en una longitud de onda de 540 nm. Utilizando la tabla
4.1

TABLA 4.1
TUBOS Blanco Patrn Globulinas Protenas Absorbancia
totales
Sln salina
Sln patrn
Sln de
globulinas
Suero diluido
1:20
Sln de Biuret
D) CALCULOS PARA DETERMINAR EL PORCENTAJE DE PROTEINAS EN LA MUESTRA DE SUERO
1. DILUCIN DEL PATRN: Calcule el porcentaje final de la solucin patrn de protenas aplicando la siguiente frmula:
2. CONCENTRACIN DE PROTENAS TOTALES DEL SUERO: relacionar los resultados de absorbancia de las
soluciones patrn con las de protenas totales y calcular el porcentaje de estas ltimas:
(%) ( )
(%) =
( )
Esta concentracin corresponde a 1 mL de sln de suero sanguneo, el cual fue diluido primero 20 veces y luego 5 veces
de manera que el resultado final debe ser:
(%)
3. CONCENTRACIN DE GLOBULINAS: relacionar los resultados de absorbancia de las soluciones patrn y de

albmina obtenida con el porcentaje de la solucin patrn y calcule el porcentaje de la sln de globulinas.
(%) ( )
(%) =
( )
Este porcentaje corresponde a la preparacin segn la tabla 4.1, que fue obtenida por dilucin 1:5:5. Por lo tanto la sln
original debe tener una concentracin 25 veces mayor es decir:
(%)

4. CONCENTRACIN DE ALBMINA EN SUERO: el porcentaje de albmina se determina restando de las protenas

totales el resultado de las globulinas.
5. CUESTIONARIO
1. Explique por qu en el mtodo de Biuret la absorbancia de una protena se lee a una longitud de 540 nm.
2. Cul mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?. Por qu?.
3. Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la cuantificacin de protenas en: suero, orina,
durante una purificacin enzimtica, en un extracto bacteriano concentrado, en preparaciones de membranas
plasmticas solubilizadas con SDS, en preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn X-100.
Justifique su respuesta
6. BIBLIOGRAFA
Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). Principles of Biochemistry, Worth Publishers, 2 edicin.
D. Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial Mdica Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid,
2007.
Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol
Chem. 177: 751766.

PRCTICA NO 5: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LPIDOS
1. OBJETIVOS
Identificar algunos lpidos contenidos en la yema de huevo.

Aplicar la tcnica cromatografica para esta separacin.
Reconocer los lpidos separados mediante el empleo de un revelador, el cual puede variar con la clase de
lpido.
Comparar los lpidos separados con muestras patrones o tambin por sus valores de Rf.
2. ASPECTOS TERICOS: Los lpidos de la yema de huevo estn exclusivamente asociados con los ensambles
lipoprotenicos. Estn hechos 62% de triglicridos, 33% de fosfolpidos y menos de 5% de colesterol. Los
carotenoides representan menos del 1% de los lpidos de la yema, y le dan el color a la misma. Las protenas estn
presentes como protenas libres o como apoprotenas (incluidas en los ensambles lipoprotenicas). Las interacciones
entre los lpidos y las protenas resultan de la formacin de lipoprotenas (baja y alta densidad), que representan el
principal componente de la yema. De tal manera, en base a su materia seca, la yema est constituida de cinco
componentes mayores: 68% de lipoprotenas de baja densidad (LDL), 16% de lipoprotenas de alta densidad (HDL),
10% de protenas globulares (livetinas), 4% de fosfoprotenas (fosvitin), y 2% de protenas menores.
La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase mvil. Varios tipos de cromatografa son posibles,
dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: slido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-lquido
y gases-liquido (fase vapor). En nuestro caso el tipo de fue cromatografa utilizada fue de capa fina o columnas (placa
con silica-gel). Es una tcnica muy importante para la separacin rpida y el anlisis cualitativo de muestras en
pequea cantidad. El solvente asciende por capilaridad por un soporte de vidrio (cromatoplaca) que tiene adherido el
adsorbente de espesor variable. En un extremo de la placa se siembra la muestra en forma puntual y luego se
introduce en una cuba que contiene el solvente de desarrollo, el cual asciende y permite que se lleven a cabo los
equilibrios de adsorcin- desadsorcin. La placa se deja hasta que el solvente llegue al extremo superior, y terminado
el desarrollo, se retira la placa, se seca, se revela y evala.
Todas las tcnicas cromatograficas dependen de la distribucin de los componentes de la mezcla entre dos fases
inmiscibles: una fase mvil, llamada tambin activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en
relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede
ser un slido o un lquido.
La aparicin de los lquidos se reconocen con la ayuda de un revelador, el cual reacciona qumicamente con la
estructura lipdica, apareciendo un producto coloreado. La identificacin de la estructura lipdica se realiza
comparndola con muestras patrones de lpidos puros, o por vapores de sus constantes Rf, el cual se define como la
relacin entre las distancias del solvente y el compuesto.

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, as como
las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturacin, etc"). Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que
resulta mejor correr duplicados de la misma Placa.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Extracto lipdico de la yema de huevo, placas recubiertas con slica gel, cubas
comatograficas, cloroformo, triolena, lecitina, colesterol, yodo, mezcla de H2SO4 y anhdrido actico.
a) Se utiliza un extracto lipdico preparado previamente a partir de la yema de huevo.
b) Se aplican gotas de cada una de las siguientes muestras sobre una placa cromatogrfica, con ayuda de un capilar
como se indica en las siguientes figuras 5.1
Tiempo 0 Despus de 10 minutos
Muestra 1: gotas de Trioleina.
Muestra 2: gotas de solucin patrn de lecitina.
Muestra 3: gotas de solucin patrn de colesterol.
Muestra 4: gotas de solucin de extracto lipdico de yema de huevo
c) Preparar la cmara cromatogrfica agregando el eluente formado por la siguiente mezcla: acetato de etilo-eter de
petrleo 1:9.
d) Tapar la cmara a fin de saturar el ambiente con vapores del solvente.
e) Una vez secas las manchas de las diferentes muestras sobre la placa, colocarla dentro de la cmara sumergiendo
la base de la placa dentro de del solvente, pero sin tocar las manchas segn se indica en la figura 5.1
f) Unos grupos se deben revelar en el cromatograma utilizando una cmara de yodo(I2). Otros se deben revelar con
cido sulfrico y anhdrido actico. La placa debe calentarse en la estufa por 5 minutos.
g) Calcular el valor de Rf para cada una de las manchas, el cual se calcula midiendo la distancia desde el origen hasta
donde llega la mancha d ( mancha) y la distancia desde el origen hasta donde llega el solvente d(solvente). Luego se
dividen estas dos distancias, as:

h) Complete la siguiente tabla:
SUSTANCIA Rf CON I2 Rf CON H2SO4 Y ANHIDRIDO ACTICO

Trioleina
Lecitina
Colesterol
Trioleina
MUESTRA Lecitina
PROBLEMA Colesterol
5. CUESTIONARIO
k) Mencione el rgano en el cual se lleva a cabo la sntesis de colesterol en los mamferos.
b) Considerando estos componentes moleculares: glicerol, cido graso, fosfato, alcohol de cadena larga e
hidrato de carbono, responda a lo siguiente
l) Cules estn presentes en las ceras?

m) Cules estn presentes en los acilglicridos?
n) Cules estn presentes en los fosfolpidos?
c) Realizar los Clculos correspondientes del factor de retardo Rf. Explique claramente sus resultados.
6. BIBLIOGRAFA
http://themedicalbiochemistrypage.org/es/cholesterol-sp.php
http://www.ecured.cu/index.php
https://sites.google.com/a/ps.edu.pe/biologiaps/bioquimica/lipidos/clasificacion-de-los-lipidos

PRCTICA NO 6: CATLISIS ENZIMTICA E INORGNICA
1. OBJETIVOS
Comparar la accion cataltica de la enzima catalasa, con la de un catalizador inorgnico como el cloruro de
manganeso al descomponer el perxido de hidrogeno.
Observar el efecto de la temperatura sobre la accin catalitica de una enzima y comparar el mismo efecto
de temperatura sobre un catalizador inorgnico.
Observar la accin de un inhibidor
Medir la actividad cataltica en base a la produccin de calor
2. ASPECTOS TERICOS: Las enzimas son sustancias que modifican la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas.
Activadores: Son iones que aceleran la velocidad de un reaccin, y a menudo son indispensables para que se realice
una funcin enzimtica. Frecuentemente son cationes: Mg+2, Ca+2, Mn+2, K+, Na+, etc.
Inhibidores: Son sustancias que disminuyen la velocidad de una reaccin que es catalizada por enzimas.
Moduladores: Son sustancias que actan sobre grupos de enzimas oligomricas con caracterstica de cooperatividad
funcional; en las condiciones de la vida de la clula influyen sobre la velocidad de las reacciones enzimticas. Pudiendo
ser positivos si estimulan la velocidad de la reaccin y negativos si la inhiben.
La complejidad de los sistemas enzimticos celulares es muy variable; los ms sencillos estn formados por una
apoenzima, un sustrato y un producto; algunos muy complejos son isoenzimas con varias molculas proteicas que
poseen dos sustratos, dos productos, un grupo prosttico, una coenzima, un activador y diferentes moduladores, cada
uno especfico para cada un de las isoenzimas.
Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Los
enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un
nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. Los enzimas son protenas que catalizan reacciones
qumicas en los seres vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reaccin,
aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que slamente aceleran las
que espontneamente podran producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones
que sin catalizador requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Perxido de Hidrgeno (H2O2), papas, sangre, dixido de manganeso (MnO2), y cianuro
de sodio (NaCN).
a) Rotular 3 tubos de Ensayo, y agregar a cada uno las siguientes sustancias:
Tubo 1: 3 mL de sangre al 1%
Tubo 2: Una pocin de papa triturada previamente.
Tubo 3: Una pequea porcin de MnO2

b) Agregar a cada uno de los tubos 2 mL de H2O2 al 3%. Observar la intensidad de la reaccin por burbujeo de oxigeno
(O2) y la liberacin de calor. Preferiblemente colocar los tubos en bao mara a 37 C por 5 minutos.
C) Colocar otros tubos con las mismas sustancias catalticas en un bao mara con agua a ebullicin durante 10
minutos, retirarlos, enfriarlos y adicionarles 2 mL de H2O2 al 3%. Llevarlos nuevamente a la bao de 37 C por 5
minutos y observar los resultados.
d) Repetir el numeral C, utilizando un bao de hielo en lugar de agua hirviendo.
e) Agregar a cada uno de los tubos, 5 gotas de NaCN y 2 mL de H2O2 al 3%, y compare las reacciones anteriores,
colocando los tubos en bao a 37 C durante 5 minutos y observe los resultados.
f) Mida la actividad cataltica en base a la produccin de calor. Anote la temperatura inicial en cada tubo, luego de
agregar 2 mL de H2O2 al 3%, y observe cada 30 segundos las variaciones de temperatura. Tabule los resultados y
grafique la temperatura registrada contra el tiempo.
5. CUESTIONARIO
Para que dejaron de reposar los tubos de ensayo durante 5 minutos antes de aadir la solucin enzimtica?
A que se deben diferencias en el comportamiento de la reaccin enzimtica en cada tubo?
Cul es la temperatura ptima para la enzima?. Por qu?
Porque la enzima quedo desactivada con la temperatura del agua hirvindose?
A que se debe baja actividad enzimtica en la temperatura del hielo?
Que es la solucin patrn?
Que otros factores del medio pueden afectar la reaccin enzimtica?
6. BIBLIOGRAFA
PLUMMER D. Bioqumica Prctica. Chelsa Collage. University of London. Editorial McGraw- Hill Latinoamricana S.A.
Bogot Colombia. 1981.
Lopez y Anzola . Guas de laboratorio de Bioqumica. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogot.

PRCTICA No 7: TIROSINASA (PARTE 1)
1. OBJETIVOS:
Extraer la enzima tirosinasa de diferentes fuentes ( banano, manzana, papa, aguacate)

Determinar la actividad de la tirosinasa, utilizando como sustrato la L-DOPA.
Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa en diferentes fuente, y sometida a diferentes
condiciones como: calor y presencia de un inhibidor.
2. ASPECTOS TERICOS: En esta prctica, utilizaremos como modelo la enzima tirosinasa. Tirosinasa es una oxidasa
responsable del proceso de melanizacin en animales y del pardeamiento en vegetales. Su actividad cataltica es doble,
ya que cataliza dos tipos de reacciones que se pueden considerar consecutivas:
a) Actividad monofenolasa o cresolasa: consiste en la hidroxilacin de fenoles sustituidos (generalmente en
posicin para) a o-difenoles.
b) Actividad difenolasa o catecolasa: se trata de la oxidacin de o-difenoles a o-quinonas.
En animales, el sustrato precursor es la L-tirosina (de ah el nombre de tirosinasa) y los productos de reaccin son
el L-dopa (o-difenol correspondiente a la tirosina) y la dopaquinona. Esta ltima en muy reactiva y rpidamente
evoluciona a dopacromo. El dopacromo evoluciona lentamente hasta melanina, pasando por intermedios 5,6-
dihidroxiindol (carboxilado o no) y 5,6-indolquinona. Las estructuras de todos estos compuestos se indican en la figura
siguiente:
COO Tirosinasa HO COO Tirosinasa O COO
HO
NH 3 O2 HO
NH 3 O2 O
NH 3
L-tirosina L-dopa L-dopaquinona
(rpida)
O HO
COO COO
N HO N
HO
-CO2 H
L-dopacromo Leucodopacromo
(lenta)
HO HO
E
DHI U
COO DHICA
HO N HO N
H M H
E
L
Tirosinasa
A
N
I
O O
N
IQ A
COO IQCA
O N O N
H S H

En animales, la fuente principal de tirosinasa es la piel, y ms concretamente unas clulas especializadas de sta, los
melanocitos, responsables de la sntesis de melanina. Las diferencias de color entre las diferentes razas, y entre el
color de piel y pelo dentro de un mismo grupo tnico, se deben, entre otros factores, a diferencias en la cantidad y
tipo de pigmentos melnicos presentes en cada individuo. Tambin son determinantes otros factores como el tamao
y la capacidad de transporte extracelular de los grnulos de melanina que se forman en los melanocitos. La alteracin
de la actividad tirosinasa puede dar lugar a modificaciones de la pigmentacin como el albinismo. Por otra parte, la
malignizacin de melanocitos produce un tipo de cncer de piel conocido como melanoma. Una de las lneas de
investigacin que se desarrollan en el Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular B e Inmunologa est
relacionada con la Bioqumica de la Melanizacin y el estudio de la tirosinasa de melanocitos normales y malignos. En
esta prctica, por simplicidad, se utiliza tirosinasa de champin, una fuente donde es muy abundante y relativamente
fcil de obtener.
La enzima tirosinasa es una metaloprotena que contiene dos tomos de cobre en el centro activo. Por tanto resulta
inhibida por muchos agentes quelantes, con afinidad por los iones metlicos. Sin embargo, en esta Prctica nos
centraremos en un anlogo del sustrato, que acta como inhibidor competitivo. El inhibidor utilizado es la L-mimosina,
un anlogo del L-dopa que se obtiene de semillas de algunas leguminosas. Causa inhibicin del crecimiento del pelo,
alopecia y, posiblemente, otros efectos txicos.
El dopacromo, formado tras la oxidacin del dopa, es un compuesto coloreado que hace posible la medida de la
actividad tirosinasa por mtodos colorimtricos. Aunque el pico de absorcin en el ultravioleta es ms intenso, el pico
ancho en la regin visible, centrado alrededor de 475 nm y responsable de la coloracin del compuesto, permite una
medida colorimtrica ms cmoda al tener menores requerimientos tcnicos, y es el que se utiliza normalmente para
determinar la actividad enzimtica de tirosinasa: puesto que la enzima transforma el dopa incoloro en dopacromo con
absorcin a 475 nm, la actividad enzimtica es directamente proporcional al incremento de absorbancia por minuto
a esa longitud de onda. La Absortividad molar del dopacromo a 475 nm es de 3700 M -1 cm-1.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Tampn fosfato 0,1 M, pH = 7,2 , L-dopa 0,03 en buffer pH= 6,0, fuentes de tirosinasa
de banano y aguacate, arena para la trituracin de la fruta, fotocolormetro, hielo para conservar la enzima e impedir
su degradacin.
a) Colocar entre 10 y 15 gramos de la fruta en el mortero preenfriado con 30 mL de buffer fosato o,1 M 8pH=7,2). Si
emplea banao medir 60 mL.
b) Triturar la mezcla anterior agregando arena.
c) filtrar el extracto de la fruta
d) Centrifugar el filtrado durante 5 minutos
e) Colocar la solucin sobrenadante en un vaso con hielo.
f) Diluir cada uno de los anteriores extractos en la siguiente proporcin:
Banano a 4 Volmenes
Aguacate a 4 volmenes
Manzana sin diluir
Papa a 4 volmenes

TUBOS EXTRACTO ENZIMTICO BUFFER NaCN L-DOPA AGUA DESTILADA

BLANCO 1 mL 4mL - - 1mL
1 1mL T Ambiente 4mL - 1mL -
2 1mL (bao mara) 4mL - 1mL -
3 1mL 4mL 2 gotas o un 1mL -
cristal
pequeo
g) Antes de tomar cualquier lectura, prepare el blanco. Leer la absorbancia en el espectrofotmetro, fijando la
longitud de onda en 445 nm. Tome esta lectura como la absorbancia a tiempo cero. Repitan las lecturas de absorbancia
cada 10 minutos, hasta completar unas seis lecturas.
h) Tabule los resultados de absorbancia contra tiempo.
i) Grafique los resultados de absorbancia y tiempo. La pendiente obtenida con estos datos y considerando una
tendencia lineal corresponder a la velocidad inicial a esta concentracin de sustrato y de enzima.
j) Repita las indicaciones sealadas son los pasos desde g hasta i, para tubos 1, 2 y 3.
k) Calcule la actividad de la tirosinasa y expresela en absorbancia por minuto y por mL de solucin de enzima. Compare
los diferentes casos: a condiciones normales, en agua hirviendo y con cianuro de sodio como inhibidor.
l) Compare la actividad de la tirosinasa en las diferentes frutas y seale la que tenga mayor concentracin de enzima.
CUESTIONARIO
Qu significa estado estacionario?
En la representacin de actividad frente a cantidad de enzima, ha obtenido una lnea recta en todo el rango?
Caso de que sea as, cree que la variacin ser lineal para cualquier adicin de enzima?
Sumar los volmenes aadidos a cada tubo y compararlos. Por qu cree que todos suman 3 ml?
Transformar el incremento de absorbancia en moles de dopacromo formado por unidad de tiempo. Utilizar
esto para expresar las velocidades de reaccin.
Cul es la definicin de Katal?
Cules son los valores de Vmax y KM obtenidos en presencia y ausencia de mimosina? Es posible calcular,
con los datos experimentales disponibles, el valor de Ki para mimosina?
Exprese el valor de Vmax utilizando Katales y U como unidades. Qu valor le parece ms cmodo?
Cmo puede explicarse la diferencia observada en las actividades residuales, siendo as que la
concentracin del inhibidor se mantiene constante?
Qu compuesto cree que presenta mayor afinidad por la enzima, el dopa o la mimosina?
Si empleramos tampn fosfato a pH = 5.5, cabra esperar los mismos valores de Vmax y KM? Por qu?
Qu valores de Vmax y KM podramos haber obtenido en presencia de mimosina si sta fuera un inhibidor no
competitivo? Intente dar valores dentro de un rango razonable.

6. BIBLIOGRAFA
Cox, M.M. y Nelson, D.L (2009). (5 edicin). Lehninger. Principios de Bioqumica. Ed.: Omega.
Stryer, L., Berg, J.M., Tymoczko, J.L. (2008). (6 edicin). Bioqumica. Ed.: Revert.
Feduchi, E., Blasco, I., Romero, C. y Yaez, E. (2011) Bioqumica Ed. Mdica Panamericana.

Mckee, T., Mckee, J.R. (2003). Bioqumica. Ed.: McGraw-Hill Interamericana.
PLUMMER D. Bioqumica Prctica. Chelsa Collage. University of London. Editorial McGraw- Hill Latinoamricana S.A.
Bogot Colombia. 1981.
Lopez y Anzola . Guas de laboratorio de Bioqumica. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogot.

PRCTICA No 8: TIROSINASA (PARTE 2)
1. OBJETIVOS:
Determinar el valor de Km para la tirosinasa utilizando diferentes mtodos, entre ellos la curva hiperblica
de michaelis menten y la ecuacin delos inversos o de lineweaver burk.
Determinar el tipo de inhibidor.
Comparar los resultados cinticos obtenidos pero en presencia de inhibidores.
2. ASPECTOS TERICOS:
La grfica obtenida con los resultados de velocidad inicial diferentes concentraciones de sustrato, corresponde a la
curva hiperblica de Michaeles Menten, representada en la figura cuya ecuacin es la siguiente.
[]
=
+ []
Con esta grfica se pueden determinar los valores de Vmax y la constante de michaeles- menten Km. Cuando una
enzima presenta valores altos de Vmax indica que tiene para esa concentracin una actividad muy elevada. Referente
al valor de Km , es conveniente que este valor sea pequeo ya que a valores ms bajos de Km mayor ser la afinidad
de la enzima por el sustrato, por lo tanto se requerir poca cantidad de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad
mxima ( Vmax).
Los valores de Vmax y Km pueden tambin obtenerse graficando el inverso de la velocidad inicial contra el inverso de
la concentracin del sustrato (1/Vi vs 1/[S]). Correspondiendo en este caso a una lnea recta. Como se indica en la
figura siguiente.

El tipo de inhibidor se deduce al comparar los resultados de Vmax y Km y con inhibidor as:
Inhibidor competitivo, la Vmax no cambia pero el Km sin inhibidor es menor que con inhibidor.
Inhibidor no competitivo, el Km no vara pero el valor de Vmax sin inhibidor es mayor que con inhibidor.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Sln de fosfato 0,1 M en buffer (pH=7,2), Sln de L-DOPA 0,03 M en Buffer(pH=6), fuentes
de tirosinasa ( banano, aguacate), areana para trituracin de la fruta, lienzo o tela para filtrar, mortero,
espectrofotmetro, sln de NaCN 0,1 mM, hielo.
a) Utilizar una solucin de sustrato (L-DOPA) cuya concentracin inicial [S] debe ser aproximadamente 0,03.
b) Preparar concentraciones finales de sustratos diluyendo volmenes vi de sustrato, de acuerdo a la tabla segn la
tabla , con 1 mL de extracto enzimtico y completando con sln buffer (pH=6). El volumen final vf de la solucin debe
ser 5mL.
c) Para calcular la nueva concentracin de sustrato aplicar la frmula general de dilucin.
[]
[] =

Los volmenes iniciales vi de la solucin que deben tomarse se indican en la tabla siguiente:
SUSTRATO [S]f 1/[S] Vi(abs/min) 1/Vi Vi(I=0,1mM) 1/Vi(I=0,1mM)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
d) Una vez preparadas las soluciones de sustrato, tome las lecturas de absorbancia con intervalos de 5 minutos.
Primero se utiliza el blanco ( 1mL de extracto enzimtico, 4mL de buffer 8pH=6.0) y 1 mL de agua destilada en lugar de
sustrato)
e) Repita el paso d) pero agragando gotas de NaCN 0,1 mM

f) Luego de obtenidos los resultados grafique absorbancia vs tiempo. Se obtendr una lnea recta, cuya pendiente
corresponder a la velocidad inicial.
g) Determine los diferentes valores de Vi en absorbancias /minuto con sus inversos 1/Vi .
h)Grafique los valores 1/Vi vs 1/[S]con inhibidor y sin inhibidor. Determine los valores de Km y Vmax.
i) Analice los resultados de Vmax y Km obtenidos en el paso h) y determine el tipo de inhibidor al cual pertenece el
NaCN en presencia de esta enzima.
5. CUESTIONARIO
Explique la importancia de la tirosinasa y que efecto causan los inhibidores.
Consulte y escriba las reacciones de conversin del aminocido tirosina en el pigmento melanina.
6. BIBLIOGRAFA
SOLIVA-FORTUNY, R. C., ELEZ-MARTNEZ, P., SEBASTIN- CALDER, M. &
MARTNBELLOSO, O. 2002. Kinetics of poliphenol oxidase activity inhibition and browning of avocado pure preserved
by combined methods. Journal of Food Engineering. 55: 131-137.
SONG, K.K., LIN, J.F., CHEN, Q.X.2005. Inhibitory effects of 4-isopropylsalicylaldehyde on mushroom tyrosinase.
0.1016/j.foodchem.2005.08.021
NAL, M.U. 2007. Properties of polyphenol oxidase from Anamur banana (Musa cavendishii). Food Chemistry, 100: 909-
913.
WESCHE-EBELING, P. & MONTGOMERY, M.W. 1990. Strawberry Polyphenoloxidase: Purification and Characterization.
Journal of Food Science, 55 (5): 1315-1319.

PRCTICA No 9: FOSFATASA ALCALINA (I)
1. OBJETIVOS:
Obtener una curva de calibracin del para-nitrofenol (PNP), que represente las variaciones de absorbancia
de una solucin que contenga esta sustancia a diferentes valores de concentracin, esto es Absorbancia vs
[PNP].
2. ASPECTOS TERICOS: La fosfatasa alcalina (FAL) cataliza la hidrlisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP) a pH 10,4
liberando p-nitrofenol y fosfato, segn la siguiente reaccin:
p-Nitrofenilfosfato + H2O p-Nitrofenol + Fosfato FAL
La velocidad de formacin del p-Nitrofenol, determinado fotomtricamente, es proporcional a la concentracin

cataltica de fosfatasa alcalina en la muestra ensayada.
La fosfatasa alcalina es una enzima, implicada en el transporte de metabolitos a travs de las membranas celulares,
que hidroliza el enlace ster fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico a pH bsico liberando fosfato
inorgnico. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos,
hgado, placenta, intestinos y rin. Se han descrito distintas isoenzimas de la fosfatasa alcalina, con leves diferencias
en su estructura. La concentracin de esta enzima en suero vara en funcin de la edad:
Adultos 40 a 140 U/L

Nios menores de 2 aos 85-235 U/L
Nios entre 2 y 8 aos 65-120 U/L
Nios entre 9 y15 aos 60-300 U/L
Adolescente 16-21 aos 30-200 U/L
Las causas ms probables del aumento de los niveles de concentracin de la fosfatasa alcalina son por consumo
abusivo de alcohol, anemia, cncer de huesos, cncer de prstata, colestasis, enfermedades de huesos, enfermedades
de hgado, enfermedades renales, por la enfermedad de Paget. Pueden observarse elevaciones moderadas debido a
la presencia de fracturas seas o debido a una hepatitis infecciosa. Mientras que las causas ms probables de la
disminucin de los niveles de esta enzima son el cretinismo y el dficit de vitamina C.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Buffer de Glicerina 0,05 M(pH=10,4), solucin de PNP (3x10-5 M), solucin de fosfato
disdico (Na2HPO4) 0,5M, espectrofotmetro.
4. PARTE EXPERIMENTAL: Se realizara una curva de calibracin para determinar los valores de Km y Vmax, cuando
la fosfatasa alcalina presente en una muestra de suero sanguneo, catalice la hidrolisis de l PNPP, esta reaccin puede
ocurrir sin o con inhibidor, empleando como inhibidor fosfato disodico y cpomo activador el ZnCl2 en donde el ion Zn+2,
es un activador de la fosfatasa.
Se utiliza como sustrato el p-nitrofenilfosfato (PNPP). La fosfatasa alcalina cataliza la hidrlisis del PNPP a p-nitrofenol
(PNP) y fosfato, en un medio bsico. La reaccin se detine con NaOH y la absorbancia del PNP se puede medir en un
espectofotmetro a 405 nm.

1. A partir de la sln de PNP 3x10-5 M, preparar por dilucin cinco soluciones disponiendo para ello de 5 tubos
de ensayo limpios y secos. Proceder como se indica en el siguiente esquema.
TUBO 1 2 3 4 5 BLANCO
Dilucin de PNP 1:2 1:4 1:8 1:16
(con buffer de
glicina)
mL de PNP diluido 3 3 3 3 3 0
mL de Na2 HPO4 1 1 1 1 1 1
0.5M
Buffer de glicina 0 0 0 0 0 3
Cuando se habla de dilucin, se refiere a que del tubo 1 se toman 3 mL y se le agregan al tubo 2, de este se toman tres
y se le agregan al siguiente, y as sucesivamente.
La primera parte de la prctica consiste en la obtencin de la curva de calibrado del p-nitrofenol (pNF), que se
utilizar en la prctica de fosfatasa alcalina II para calcular la [pNF] producido en la reaccin enzimtica.
5. CUESTIONARIO
-Calcular la concentracin de pNF en cada tubo teniendo en cuenta que: VC = VC, donde:
V = Volumen de pNF que se aade a cada tubo.
C = Concentracin de la disolucin de partida ([pNF] = 0,625 mM)
V= Volumen total en cada tubo.
C= Concentracin final de pNF en cada tubo.
-Representar grficamente las A405 frente a la concentracin de pNF en cada tubo y trazar la recta de calibrado.
6. BIBLIOGRAFA
MARTNBELLOSO, O. 2002. Kinetics of poliphenol oxidase activity inhibition and browning of avocado pure preserved
by combined methods. Journal of Food Engineering. 55: 131-137.
SONG, K.K., LIN, J.F., CHEN, Q.X.2005. Inhibitory effects of 4-isopropylsalicylaldehyde on mushroom tyrosinase.
0.1016/j.foodchem.2005.08.021

WESCHE-EBELING, P. & MONTGOMERY, M.W. 1990. Strawberry Polyphenoloxidase: Purification and Characterization.
Journal of Food Science, 55 (5): 1315-1319.

PRCTICA No 10: FOSFATASA ALCALINA (II)
1. OBJETIVOS: Determinar los valores de Km y Vmax para la fosfatasa alcalina presente en un suero sanguneo y
utilizando como sustrato PNPP.
2. ASPECTOS TERICOS: Las fosfatasas alcalinas son un grupo de isoenzimas que catalizan la liberacin de cido
fosfrico de algunos steres monofosfricos, a un pH elevado:
R-O-PO3H2 + H2O R-OH + H3PO4

Existen diferentes fosfatasas alcalinas en los diferentes tejidos (hueso, rin,
hgado, placenta, tejido tumoral). La actividad fosfatasa alcalina presente en
suero puede ser, por tanto, una mezcla de isoenzimas de los tejidos. Los niveles
de fosfatasa alcalina en suero se ven elevados en enfermedades seas y
hepticas; fue la primera enzima del suero que se estudi en una enfermedad
heptica y ha sido utilizada ampliamente para el diagnstico diferencial de la
ictericia, enfermedades seas y en algunos procesos cancerosos.
La fosfatasa alcalina es un
ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida
por un mtodo colorimtrico. Este se basa
en la transformacin de un sustrato, elp-
nitrofenilfosfato (p-NFP), en p-nitrofenol (p-NF),
producto de color amarillo que en solucin alcalina
absorbe a 405 nm.
3. MATERIALES EMPLEADOS: Buffer de Glicerina 0,05 M(pH=10,4), solucin de PNPP (5x10-3 M), solucin de fosfato
disdico (Na2 HPO4) 0,5M, espectrofotmetro, sln acuosa de ZnCl2 (6x10-4 M), solucin enzimtica o suero sanguneo 1:4
con la sln del buffer de glicina pH=10,4.
4. PARTE EXPERIMENTAL: 1. A partir de la solucin de PNPP 5x10-3 M, peparar por ilucion 5 soluciones disponiendo
para ello de 5 tubos de ensayo limpios y secos. Proceder como se indica en el siguiente esquema

El contenido de cada uno de los tubos se describe en la siguiente tabla incluyendo el tubo blanco.
TUBO 1 2 3 4 5 BLANCO
Agua destilada 0 0 0 0 0 0,5
Dilucin de PNP 1:2 1:4 1:8 1:16
(con buffer de
glicina)
mL de PNPP diluido 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0
Buffer de glicina 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Sln de ZnCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
2. proceda a agregar la enzima de la siguiente forma:
a) Lleve los tubos a bao de agua a 37 C .
b) Un minuto despus de agregar la enzima al tubo 1 , proceda en la misma forma con el tubo 2 y consrvelo en el
bao mara a 37 C , durante 15 minutos.
c) un minuto despus de adicionada la enzima al tubo 2, proceda de la misma forma con el tubo 3.
d) de igual forma proceda con los tubos 4 y 5 con intervalos de 1 minuto dejndolos por espacio de 15 minutos cada
uno, de igual manera hacerlo con el blanco.
3. Cumplidos los quince minutos para cada tubo, suspenda la reaccion adicionando 1 mL de Fosfato disdico (Na2 HPO4)
0,5M en cada tubo y tome la respectiva lectura 8405 nm)
4. Tabule los resultados obtenidos e incluya en la tabla los valores de Vi.
5. Elabore la grafica Vi vs [S] y determine los valores de Km y Vmax.
6. obtenga los valores inversos de Vi y [PNPP] Y grafquelos. Determine los valores de Km y Vmax comprelos con los
obtenidos en la grafica (tem 5).
5. CUESTIONARIO
a. Describa y explique el tipo y subtipo al cual pertenece la fosfatasa alcalina.
b. Qu funcin cumple el Na2HPO4 en la mezcla de reaccin?
c. Qu significado tiene el que la Reaccin se lleve a cabo con un buffer pH: 10.4?

d. Por qu la absorbancia mxima del PNP se mide a = 410nm?

e. Explique: Por qu el ion Zn+2 acta como un activador de la fosfatasa alcalina?
f. Por qu razn el p-nitrofenilfosfato es incoloro y el p-nitrofenol es coloreado?
6. BIBLIOGRAFA
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf
http://www.aditivosalimentarios.com/index.php/codigo/339i/fosfato-monosOdico
http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/7.pdf

Guias Bioquimica 2

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Guias Bioquimica 2

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MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA II

ESTRUCTURA DE LOS INFORMES DE LABORATORIO (LIBRETA DE LABORATORIO)

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA Y QUMICA

PRCTICA NO 1: PROPIEDADES DE LAS PROTENAS

Las principales fuerzas que estabilizan a la estructura terciaria son:

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(PROTENA)-n + nAg+ n(PROTENA)Ag

(PROTENA)+n + nAcetato de sodio n(PROTENA)Acetato

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TUBO PROCEDIMIENTO OBSERVACIN

TUBO PROCEDIMIENTO OBSERVACIN

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TUBO PROCEDIMIENTO OBSERVACIN

Adicionar 20 gotas de NaOH 6 N y anote las nuevas observaciones.

TUBO PROCEDIMIENTO OBSERVACIN

2 8 gotas de cido tnico Observa precipitado?

Anote las nuevas observaciones, despus de adicionar:

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Analizar los principios generales de la tcnica de fotocolorimetra

La unin de ambas leyes nos da la ley de Beer-Lambert:

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Despejando la concentracin C de la muestra, se obtiene :

Esta ecuacin es fundamental en clculos fotocolorimtricos. La representacin grfica de la concentracin vs

3. MATERIALES EMPLEADOS: fotocolormetro, solucin de albmina y reactivo del biuret.

1. MANEJO DEL FOTOCOLORMETRO

a) Calibrar el instrumento segn las siguientes recomendaciones:

Seleccionar la longitud de onda

B) Determinar el espectro de absorcin de un compuesto:

Coloque la longitud de onda del fotocolormetro en 420nm

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a) En qu consiste la reaccin del Biuret?

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PRCTICA NO 3: CURVA DE CALIBRACIN PARA SOLUCIONES DE ALBMINA

Adquirir habilidades ene le manejo del instrumento (GENESYS 10S UV-Vis).

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TUBOS SOLUCIN ESTNDAR DE ALBMINA SOLUCIN SALINA REACTIVO DEL BIURET

c) Colocar en el espectrofotmetro la longitud de onda de mxima absorbancia obtenida en la experiencia sobre el

g) Que se entiende por curva de calibracin?

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PRCTICA NO 4: CUANTIFICACIN DE PROTENAS APLICANDO EL MTODO DE PATRN DE BIURET

PROTEINAS CONJUGADAS: Fosfoprotenas, Glucoprotenas, Nucleoprotenas, Cromoprotenas, Metaloprotenas, y

PROTEINAS DERIVADAS: Protenas derivadas primarias ( Proteanas, Metaprotenas y Protenas coaguladas);

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Protenas plasma-especficas: componentes habituales del plasma.

A) SEPARACIN DE LAS GLOBULINAS DEL SUERO

1. Colocar en un tubo de centrifuga 1 mL de suero sanguneo y 4 mL de agua destilada.

B) PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE PROTENAS TOTALES

1. Medir 1 mL de suero sanguneo y diluirlos hasta completar 20 mL agregndole solucin salina.

C) MEDICIN DE LA ABSORBANCIA EN LAS SOLUCIONES QUE CONTIENEN PROTENAS.

1. Se dispone de 4 tubos de ensayo y se deben preparar de acuerdo a la tabla 4.1.

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D) CALCULOS PARA DETERMINAR EL PORCENTAJE DE PROTEINAS EN LA MUESTRA DE SUERO

3. CONCENTRACIN DE GLOBULINAS: relacionar los resultados de absorbancia de las soluciones patrn y de

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4. CONCENTRACIN DE ALBMINA EN SUERO: el porcentaje de albmina se determina restando de las protenas

2. Cul mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?. Por qu?.

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PRCTICA NO 5: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LPIDOS

Identificar algunos lpidos contenidos en la yema de huevo.

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a) Se utiliza un extracto lipdico preparado previamente a partir de la yema de huevo.

Tiempo 0 Despus de 10 minutos

Muestra 1: gotas de Trioleina.