Produccin de enzimas hidrolticas y actividad antagnica

de Trichoderma asperellum sobre dos cepas

de Fusarium aisladas de cultivos de tomate (Solanum
lycopersicum)

Production of hydrolytic enzymes and antagonic activity

of Trichoderma asperellum on two strains of Fusarium isolated
from tomato crop (Solanum lycopersicum)

Harold Alexander Vargas-Hoyos1* y Elizabeth Gilchrist-Ramelli2

1
Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia, Calle 67 Nmero 53-108, Medelln,
Antioquia, Colombia.

2
Corporacin Universitaria Lasallista, Carrera 51 Nmero 118 Sur-57, Caldas,
Antioquia, Colombia.

*Autor para correspondencia:

Harold Alexander Vargas-Hoyos barharold@hotmail.com

Recibido: 08/09/2014.
Aceptado: 15/04/2015.

Resumen

El gnero Trichoderma presenta distribucin mundial. Se han descrito diversas

estrategias biolgicas asociadas a su alta tasa de supervivencia en diferentes
ambientes. En el control de microorganismos fitopatgenos, el antagonismo y la
produccin de enzimas degradoras de pared celular son las ms destacadas. El
objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad antagnica de la cepa
de Trichoderma asperellum T109 contra dos aislamientos nativos del hongo
fitopatgeno Fusarium sp. (M2Raz, M3Tallo) y evaluar el efecto de diferentes fuentes
de carbono (almidn, pared celular de Rhizoctonia solani -PCRS-, quitina coloidal y
laminarina) en la produccin de glucanasas y quitinasas. La cepa T109 evidenci buena
capacidad antagnica contra ambos aislamientos fitopatgenos, ya que se observ
disminucin en su capacidad de crecimiento del 60 y 40% para M2Raz y M3Tallo,
respectivamente. Se obtuvo produccin de las enzimas lticas en todas las fuentes de
carbono evaluadas. La actividad glucanasa fue mayor en el sustrato adicionado de
PCRS. La actividad quitinasa no present diferencia significativa en todos los sustratos
evaluados. Con los resultados obtenidos se pudo confirmar la capacidad antagnica in
vitro de T. asperellum T109 contra dos cepas de Fusarium sp. aisladas de la planta del
tomate y se estableci que dicha cepa es buena productora de enzimas hidrolticas,
particularmente glucanasas, en medio mnimo suplementado con PCRS.

Palabras clave: hongos fitopatgenos, control biolgico, antagonismo in

vitro, glucanasas, quitinasas.

Abstract

The soil fungi genera Trichoderma presents global distribution. There are different
biological strategies associated to its high rate of survival on different environments.
To control phytopathogenic fungi the most featured strategies are the antagonistic and
the production of cell wall degrading enzymes. The aim of this work was to determine
the antagonism capacity of the strain T109 of T. asperellum against two native isolates
of Fusarium sp. (M2Root, M3Stem) and to evaluate the effect of different carbon
sources (starch, cell wall of Rhizoctonia solani -PCRS-, colloidal chitin and laminarin)
on the production of glucanases and chitinases. Trichoderma asperellum T109 showed
good antagonistic activity against both phytopathogen isolates, shown a reduction in
growth mycelial of 60% and 40% for M2Root and M3Stem, respectively. Both lytic
enzymes were detectated on all evaluated carbon sources. The glucanase activity was
higher on the substrate added with PCRS. Chitinase activity was not significantly
different in all substrates evaluated. These results confirm the antagonist activity in
vitro of T. asperellum T109 against phytopathogens presents on tomato crop, and it
was determined that T109 strain is a good producer of glucanases especially in
minimum media added with PCRS.

Keywords: phytopathogenic fungi, biological bontrol, in vitro, antagonism,

glucanases, chitinases.

Introduccin

La amplia gama de estrategias empleadas para la colonizacin, establecimiento y

subsistencia, favorecen la adaptacin de las especies del gnero Trichoderma, en casi
cualquier ambiente (Samuels, 2006). La velocidad de crecimiento y produccin de
propgulos (Steyaert et al., 2010), colonizacin de la rizosfera (Bentez et al., 2004;
Verma et al,. 2007), antibiosis (Harman y Lumsden, 1990; Paulitz y Belanger, 2001),
produccin de metabolitos y enzimas lticas (Antal et al., 2000; Vinale et al., 2008;
Marcello et al., 2010) son algunos de los mecanismos que emplea este hongo para
garantizar su presencia en el suelo, por lo que es considerado como el ms prevalente
de los microorganismos que interactan en la rizsfera con diferentes plantas (Harman
y Shoresh, 2007).

Los productos bioformulados de Trichoderma spp. han exhibido alto nivel de

rendimiento como antagonistas de fitopatgenos (Bentez et al, 2004; Harman et
al, 2004; Wijesinghe et al., 2010). A nivel mundial, la mayora de los bioformulados
de Trichoderma spp. se preparan a base de las especies T. viride, T. virens y en mayor
proporcin de T. harzianum (Bentez et al., 2004), siendo esta ltima especie la ms
evaluada (Harman et al., 1991; Taylor et al., 1991; De Marco et al., 2004; Lpez-
Mondjar et al., 2012). En las regiones tropicales de Sur Amrica, la especie
prevalente de Trichoderma es T. asperellum (Hoyos-Carvajal et al., 2009b), sin
embargo, es la menos estudiada (Marcello et al., 2010).

Bsicamente, la evaluacin del efecto de Trichoderma sp. se ha concentrado en dos

modos de accin: 1) el control y/o disminucin de la poblacin de fitopatgenos en el
suelo mediante el micoparasitismo, la competencia y la antibiosis (Elad, 2000; Avis et
al, 2008; Chacn et al, 2007; Hoyos-Carvajal et al., 2009a) y, 2) el estmulo en la
nutricin de la planta (Altomare et al., 1999). Durante el proceso de
micoparasitismo, Trichoderma sp. emplea enzimas que disuelven la pared celular de
los hongos que parasita, siendo las ms conocidas las quitinasas y glucanasas (Antal et
al., 2000; Cao et al., 2009). La competencia se desarrolla cuando en un mismo espacio
confluyen especies del antagonista y de algn patgeno, ambos con necesidades
nutritivas similares y donde la velocidad de crecimiento favorecer el desarrollo de uno
de los dos hongos (Avila-Miranda et al., 2006), la antibiosis ocurre cuando el hongo
antagonista libera diferentes compuestos que afectan directamente al patgeno
(Bailey et al., 2008; Vinale et al., 2008). A su vez, la planta puede recibir estmulo por
medio de la colonizacin radicular para mejorar su nutricin y la liberacin de
compuestos que incrementan su crecimiento, como las auxinas (Harman et al., 2004),
y por la induccin de resistencia sistmica al ataque de fitopatgenos que involucra
dos mecanismos: resistencia sistmica adquirida (RSA) o resistencia sistmica inducida
(RSI) (De Souza et al., 2008).

El tomate es el segundo cultivo vegetal de la clase magnolipsida ms importante a

nivel mundial despus de la papa (Solanum tuberosum) (Nzanza et al., 2012), con una
produccin global de aproximadamente 160 millones de toneladas para el ao 2011
(Vos et al, 2014). En 2012, China fue el mayor productor con cerca de 50 millones de
toneladas (FAOSTAT, 2014). De los principales microorganismos fitopatgenos que
pueden causar prdidas considerables en el cultivo del tomate se
encuentra Fusarium sp. agente causal de la pudricin del cuello y la raz del tomate. Se
sabe que las especies de Fusarium poseen alta capacidad de adaptacin a condiciones
desfavorables de temperatura, nutriente y pH, entre otras (Michel, 2001). Dichas
caractersticas favorecen su reproduccin e invasin a diferentes hospederos, por lo
que su erradicacin en algunos casos resulta muy difcil. Para detener la accin de este
patgeno se han evaluado mtodos de control fsico, cultural, qumico y biolgico.

Los microorganismos ms usados en el control biolgico han sido bacterias y hongos:

en el caso de las bacterias, los gneros Pseudomonas spp., Bacillus spp.
y Paenibacillus son los ms comunes; para el caso de los hongos se
destaca Trichoderma spp. (Gonzlez et al., 2004). Se ha sugerido que especies del
genero Trichoderma poseen buenas cualidades para el control de enfermedades en
plantas causadas por el hongo patgeno Fusarium sp. (Surez et al. 2008).

Teniendo en cuenta todo lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la

capacidad antagnica de Trichoderma asperellum contra aislamientos del hongo
fitopatgeno Fusarium sp. asociados al tomate de mesa (Solanum lycopersicum) en
medios de cultivo conteniendo diferentes fuentes de carbono y determinar la
produccin de enzimas hidrolticas (especficamente glucanasas y quitininasas) durante
el proceso de confrontacin de los cultivos.
Materiales y Mtodos

Cepa y condiciones de almacenamiento

Se utiliz el producto comercial Triderma a base de Trichoderma asperellum (Hoyos-

Carvajal et al., 2009b), suministrado por la empresa Biotropical S.A. Los aislamientos
de fitopatgenos fueron obtenidos de raz y tallo de cultivos de tomate que
presentaron los sntomas de la enfermedad asociada a la infeccin por Fusarium sp.,
dichas cepas fueron nombradas como M2Raz y M3Tallo. Triderma y las cepas se
mantuvieron en medio de Papa Dextrosa Agar (PDA, Bioxon) a 4C en oscuridad, hasta
su uso en las pruebas.

Pruebas de antagonismo in vitro

Se coloc un disco de 5 mm de dimetro de los fitopatgenos aislados del cultivo del

tomate (Solanum lycopersicum) en cajas de Petri con PDA con 5 a 8 das de
inoculados; en la misma caja se sembr un disco de 5 mm de dimetro del cultivo
de Trichoderma asperellum (Triderma con 8 das de crecimiento). La distancia entre
los discos fue de 3 cm. Se prepararon 10 rplicas por enfrentamiento, adems de los
controles para el antagonista y para el fitopatgeno. Los cultivos se incubaron a 26C
por 8 das.

Determinacin del Porcentaje de Inhibicin (PI)

El porcentaje de inhibicin del fitopatgeno se determin en base al crecimiento del

radio micelial (RI) de los controles (sin el antagonista) con respecto a los que
estuvieron en presencia de los antagonistas. El RI se calcul de la siguiente manera:

RI=100 * (Rc-Ri)/Rc

Donde:

Ri (radio influenciado): es el radio de crecimiento micelial del patgeno, medido en la

direccin del inculo hacia el antagonista.

Rc (radio control): es el radio de crecimiento micelial del patgeno, medido en la

direccin del radio mximo sin presencia del antagonista.

La toma de datos para determinar la actividad antagnica se realiz diariamente por 8

das. El experimento se repiti 2 veces.

Induccin y evaluacin de las actividades enzimticas del ingrediente activo

del bioformulado Triderma
El bioformulado de Triderma fue sembrado en medio MYG (Marcello et al., 2010),
que contiene; 0.5% extracto malta, 0.25% extracto de levadura, 1% glucosa y 2% de
agar, incubndose a 26C por 8 das. Las conidias fueron recolectadas por raspado de
la superficie y resuspendidas en agua destilada estril para ser centrifugadas a 2 000
rpm y se realizaron dos lavados, el pellet fue sembrado en medio TLE (Bara et
al., 2003; Marcello et al., 2010) que contiene 0.1% de bactopeptona, 0.03% urea,
0.2% KH2PO4, 1.4% (NH4)2SO4, 0.03% MgSO4 7H2O, 0.03% glucosa y 0.5% pared
celular de Rhizoctonia solani. El micelio obtenido fue sembrado en Medio Mnimo (MM)
suplementado con una fuente de carbono nica y diferente para cada cultivo: almidn
(MM + A), pared celular de Rhizoctonia solani (MM + PCRS), quitina coloidal (MM + Q)
y laminarina (MM + L). Los diferentes medios inoculados fueron incubados a 28C
durante 24 h, con una agitacin de 140 rpm. La biomasa obtenida fue separada por
filtracin al vaco (BUCCHI V-700, controlador BUCCHI V-850) con un papel filtro con
tamao de poro de 0.45 pm (Millipore) a una presin de 130 mbar. El medio filtrado se
congel a -20C para su posterior liofilizacin.

Las muestras liofilizadas fueron resuspendidas en solucin buffer de acetato de sodio

(50 mM, pH 5) para la determinacin de las actividades de quitinasa y glucanasa. La
actividad enzimtica se evalu siguiendo la metodologa propuesta por Bara et al.
(2003), modificada por Marcello et al., (2010), que consiste en mezclar 50 pl de la
muestra resuspendida con 100 pl de la solucin buffer de acetato de sodio
suplementado con 0.25% de laminarina para el caso de las -1, 3 glucanasas y 0.25%
de quitina coloidal para el caso de las quitinasas. Las muestras fueron incubadas en
bao mara a 40C durante 30 min. La produccin de azucares fue determinada por el
mtodo descrito por Miller (1959) utilizando N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) como
estndar. Una unidad de actividad enzimtica (UAE) fue definida como la cantidad de
enzima que produce 1 mol de glucosa por mL de extracto diluido por minuto bajo las
condiciones descritas.

Anlisis estadstico

Los tratamientos se compararon utilizando un anlisis de varianza (ANOVA, p<0.05)

seguida de la comparacin de medias de Tukey. Se realizaron evaluaciones de
homocedasticidad y normalidad de los datos utilizando los test de Levene y
Kolmogorov-Smirnov, respectivamente.

Resultados

El crecimiento de los aislamientos fitopatgenos en presencia del antagonista

disminuy a partir del da 3, alcanzando para el da 8 un dimetro de 2.42 cm para
M2Raz y 260 cm para M3Tallo (Figura 1). Al comparar el crecimiento de los
fitopatgenos en presencia del antagonista con sus respectivos controles, se
observaron diferencias significativas a partir del da 4 (Figura 1).
La velocidad de crecimiento fue significativamente diferente entre el control del
Triderma y los controles de ambos fitopatgenos (Figura 1). El valor mximo de
crecimiento de Triderma (8.02 cm) se encontr al da 5. Los controles de los
fitopatgenos M2Raz y M3Tallo presentaron un crecimiento continuo hasta el final del
experimento (da 8 con 5.75 y 5.85 cm, respectivamente).

El aislamiento de Trichoderma asperellum presente en el bioformulado

Triderma evidenci capacidad antagnica contra hongos fitopatgenos aislados del
cultivo del tomate (Figura 2). Los aislamientos fitopatgenos M2Raz y M3Tallo
presentaron disminucin en su capacidad de crecimiento en presencia del antagonista
del 60 y 40%, respectivamente (Figura 3).

Durante la evaluacin de las diferentes fuentes de carbono utilizadas como sustrato en

la produccin de -1, 3 glucanasas y quitinasas por parte de T. asperellum, se obtuvo
produccin de ambas enzimas lticas en todas las fuentes evaluadas, pero con
variacin dependiendo de la fuente de carbono evaluada (Figura 4). La mayor actividad
de -1,3 glucanasas fue detectada en los cultivos que contenan MM+PCRS (455.96
UAE), seguido de MM+Almidn (387.81 UAE), sin detectarse diferencias significativas
entre ambos sustratos. En MM+Quitina (302.50 UAE) y MM+Laminarina (283.46 UAE)
se observaron diferencias significativas con MM+PCRS y MM+Almidn (p<0.05) (Figura
4).
Para la produccin de quitinasas, no se observaron diferencias significativas entre los
sustratos evaluados. La mayor actividad -1,3 glucanasa se obtuvo al utilizar
MM+Laminarina (287.49 UAE), un 10% menos al utilizar MM+Quitina (256.90 UAE),
un 27% menos al utilizar MM+Almidn (209.83 UAE) y finalmente un 40% menos al
emplear MM+PCRS (172.43 UAE) (Figura 4).

Al comparar la produccin de ambas enzimas hidrolticas en cada sustrato, se

encontraron diferencias significativas para MM+Almidn y MM+PCRS, en donde la
mayor actividad enzimtica se correspondi a -1, 3 glucanasa, siendo casi 2 veces
ms que la actividad de quitinasa. Cuando se emplearon los sustratos MM+Quitina y
MM+Laminarina no se observaron diferencias entre las actividades enzimticas,
especialmente en el ltimo sustrato (Figura 4), lo que supone la presencia de
complejos enzimticos activos en estos aislamientos.

Discusin
La curva de crecimiento del antagonista refleja una tpica forma exponencial, llegando
a su fase estacionaria al da 5, lo cual confirma la habilidad de este microorganismo de
adaptarse a condiciones de crecimiento in vitro y de colonizar rpidamente un espacio
determinado (Hoyos-Carvajal et al., 2008; Vargas-Hoyos et al., 2012; Singh et
al., 2014; Ruano-Rosa et al., 2014) lo que favorece la inhibicin del crecimiento de los
hongos fitopatgenos, hecho que se evidenci desde los primeros das del
enfrentamiento (Figura 1).

El aislamiento de la especie T. asperellum presente en el bioformulado evaluado

(Triderma), mostr tener actividad biolgica in vitro contra aislamientos
de Fusaruim sp. aislados del cultivo de tomate , lo cual coincide con evaluaciones
previas de Bentez et al., (2004); Marcello et al., (2010) y Vargas-Hoyos et al., (2012)
quienes concluyeron que, entre varias especies evaluadas, T. asperellum present la
mejor capacidad inhibitoria.

Las evaluaciones de cultivo dual evidenciaron sobrecrecimiento de T. asperellum sobre

los aislamientos de Fusarium sp., coincidiendo con lo reportado por Michel (2001),
quien describe que de 25 cepas de Trichoderma spp., 21 crecieron sobre el
fitopatgeno Fusarium oxysporum. En este mismo trabajo se reporta que 23 de las
cepas evaluadas detuvieron el crecimiento de Fusarium subglutinans y F. oxysporum.

Se ha descrito que las especies de Fusarium sp. poseen gran capacidad de adaptacin
a diferentes ambientes y un amplio intervalo de hospederos, adems de tolerar gran
cantidad de factores desfavorables (Michel, 2001). Con los resultados de las
evaluaciones in vitro del presente trabajo, se puede sugerir que los aislamientos de
este gnero poseen cierta afinidad especfica con las parte de la planta de tomate que
infectaron, para el caso del aislado obtenido de la raz de las plantas del tomate
(M2Raz), ste debi estar sometido a mayor estrs ecolgico y de interaccin con
diferentes microorganismos dentro de los cuales posiblemente estaba Trichoderma sp.,
lo que le permite soportar la presin por espacio nutrientes en condiciones
particulares. Por su parte, el aislado de tallo de plantas de tomate est en un tejido
ms estable y alejado de otros microorganismos del suelo que puedan competir por
nutrientes, hacindolo ms susceptible al estar en contacto con otros cultivos.

La actividad enzimtica de hongos del gnero Trichoderma ha sido ampliamente

evaluada y reportada (Busto et al., 1996; Rana et al., 2003; Djonovic et al., 2007;
Lopes et al., 2012), asimismo, se ha descrito el papel que esta desempea en la
propiedad micoparastica de este microorganismo (Bara et al., 2003; Grn et
al., 2006; Marcello et al., 2010). Durante el proceso de
micoparasitismo, Trichoderma sp. secreta gran cantidad de enzimas degradadoras de
pared celular las cuales actan directamente sobre los hongos fitopatgenos facilitando
la entrada del microorganismo antagonista, quin obtiene los nutrientes y degrada el
microorganismo invadido (Almeida et al., 2007; Ramada et al., 2010). Se ha
encontrado que las quitinasas y glucanasas estn directamente relacionadas en los
mecanismos de micoparasitismo de las especies de Trichoderma sp. (Kubicek et
al., 2001; Harman et al., 2004; Silva et al., 2012).

Los resultados del presente estudio mostraron la fuente de carbono afect la

produccin total de glucanasas (Figura 4), determinndose una mayor actividad
enzimtica en el medio mnimo suplementado con pared celular de Rhizoctonia
solani (MM+PCRS), lo que coincide con Bara et al., (2003) y Silva et al., (2012),
quienes evaluaron la actividad -1,3 glucanasa de aislamientos de Trichoderma
asperellum en diferentes sustratos y encontraron la mayor actividad enzimtica cuando
se emple PCRS. En ambos trabajos, las tres mayores actividades enzimticas fueron
halladas en orden decreciente en los medios suplementados con PCRS, Almidn y
Quitina, esto coincide completamente con los hallazgos obtenidos en este trabajo
(Figura 4) y muestra un patrn de comportamiento similar en el aislado de T.
asperellum presente en el bioformulado Triderma.

Los glucanos unidos por enlaces -1-3 son los componentes ms abundantes de las
paredes celulares de los hongos (Harman, 2000). Reportes anteriores sugieren que
bajo la induccin de PCRS, el tipo de productos de hidrlisis producido por T.
asperellum requiere de exo--glucanasas (Bara et al., 2003) especficamente de dos
1,3--D-glucanasas extracelulares. Sin embargo, an es poco lo que se conoce de
estas enzimas, slo que se controlan mediante una represin catablica y que cada
aislamiento con diferente fuente de carbono, puede presentar un perfil de produccin
particular.

Los resultados obtenidos para determinar la actividad quitinasa mostraron que no

existi diferencia significativa para los diferentes sustratos evaluados (Figura 4). En
todos los casos se encontr actividad, lo cual coincide con Lpez-Mondejar et
al., (2012), quienes al evaluar un aislamiento de T. harzianum en diferentes sustratos,
encontraron actividad quitinoltica en todo los casos, siendo mayor al utilizar quitosn.
Por otro lado Almeida et al. (2007), evaluaron 15 aislamientos de Trichoderma sp. y en
todos ellos observaron actividad quitinoltica al inducir con PCRS. En nuestro caso, los
aislamientos cultivados en esta fuente de carbono presentaron la actividad enzimtica
ms baja, sin embargo no fue significativamente diferente al resto de los sustratos
evaluados.

Se sabe que durante el proceso de micoparasitismo y posterior contacto

de Trichoderma sp. con el micelio del fitopatgeno, se libera un complejo de enzimas
hidrolticas en las cuales confluyen entre otras, las glucanasas y quitinasas (Michel,
2005; Silva et al., 2012) resultando en una actuacin sinrgica y ms eficiente para
ejercer biocontrol (Almeida et al., 2007). Por los resultados obtenidos, el aislamiento
de T. asperellum present ambos tipos de actividad, por lo cual se convierte en una
buena fuente de enzimas hidrolticas con potencial biotecnolgico. Por ello, resulta
primordial ahondar en este tipo de conocimientos bsicos que permitirn profundizar
en el entendimiento de la biologa de los aislamientos antagonistas y de esta manera
potenciar su efectividad contra microorganismos fitopatgenos.

En este trabajo se confirm la capacidad antagnica in vitro de aislados

de Fusarium sp. del cultivo del tomate y una cepa de Trichoderma asperellum T 109.
Se determin que el aislamiento de T. asperellum presente en el bioformulado
Triderma produce enzimas hidrolticas, particularmente glucanasas, involucradas en
su capacidad antagnica in vitro. Los sustratos empleados para la evaluaciones in
vitro, sugieren la existencia de rutas comunes de activacin de las funciones
enzimticas, pero se requiere realizar investigaciones futuras en las cuales se pueda
dilucidar el mecanismo particular llevado a cabo para cada enzima hidroltica, con el fin
de seleccionar el mejor sustrato y maximizar la produccin de compuestos bioactivos.

Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo logstico a la Corporacin para Investigaciones
Biolgicas, a la directora del laboratorio Central de Servicios, Gabriela Jaramillo. A la
empresa Biotropical S.A. por el acompaamiento en el proceso investigativo y por
permitir el uso de su formulado. Este trabajo se realiz gracias al soporte financiero de
Colciencias: Proyecto # 221350227265 Contrato 521 de 2011.

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Cintica Enzimtica del Bagazo de Caa para la
Produccin de Glucosa Utilizando la Enzima Trichoderma
Iongibrachiatum

Enzyme Kinetics of Sugarcane Bagasse for Glucose Production

using Enzyme Trichoderma longibrachiatum

Diofanor Acevedo(1)*, Clemente Granados(1) y Eliana M. Guerrero(2)

(1) Universidad de Cartagena, Facultad de Ingeniera, Departamento de Ingeniera de

Alimentos, Avenida el Consulado, Calle 30 No. 48-152. Cartagena, Bolvar-Colombia
(e-mail: diofanor3000@gmail.com).
(2) Universidad de San Buenaventura, Facultad de Ingeniera Qumica, Calle Real de
Ternera No. 30-966. Cartagena, Bolvar-Colombia.

* Autor a quien debe ser dirigida la correspondencia

Resumen

Se ha estudiado la hidrlisis enzimtica del bagazo de caa utilizando la enzima

Trichoderma longibrachiatum. Siguiendo la cintica de velocidad propuesta por
Michaelis-Menten, de los datos de V0 y S0 obtenidos a concentraciones de 30, 40 y 50
mg/mL de bagazo de caa con dosificaciones de enzima constante de 0.210, 0.420 y
0.840 mg/mL se calcularon los valores de Km y Vmax. A concentracin de sustrato de 50
mg/mL y de enzima de 0,840 mL se obtuvo la mayor concentracin de glucosa (0.1902
mg/mL). El valor de Km para la enzima fue de 22.8 mg/mL lo que indica que tiene poca
afinidad con el sustrato. Los valores de Vmax para las diferentes dosificaciones de
enzima fueron de 0.08495, 0.1034 y 0.1176 mg/mLs.

Palabras clave: cintica enzimtica, bagazo de caa, Trichoderma longibrachiatum,

Michaelis-Menten

Abstract

The enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse using enzyme Trichoderma

longibrachiatum has been studied. Following the kinetic rate proposed by Michaelis-
Menten, data of V0 and S0 obtained at concentrations of 30, 40 and 50 mg / mL of
bagasse with constant dosages of enzyme of 0.210, 0.420 and 0.840 mg/mL, values of
Kmand Vmax were calculated. With substrate concentration of 50 mg/mL and 0.840 mL
of enzyme, the greater glucose concentration was obtained (0.1902 mg/mL). The
value of Km for the enzyme was 22.8 mg/mL, indicating that it has little affinity for the
substrate. Vmax values for different enzyme dosages were 0.08495, 0.1034 and 0.1176
mg/mLs.
Keywords: enzyme kinetics, bagasse, Trichoderma longibrachiatum, Michaelis-Menten
model

INTRODUCCIN

El gnero Trichoderma son hongos saprofitos del suelo y la madera, de crecimiento

muy rpido. Las especies de este gnero se encuentran ampliamente distribuidas por
todas las latitudes, y se presentan naturalmente en diferentes ambientes,
especialmente en aquellos que contienen materia orgnica o desechos vegetales en
descomposicin. En los ltimos aos se han incrementado los estudios de campo para
su uso en cultivos de hortalizas y ornamentales. No obstante, la informacin sobre su
empleo en la produccin agrcola es insuficiente y dispersa. La capacidad de producir
diversos metabolitos y de adaptacin a diversas condiciones ambientales y sustratos,
confiere a Trichoderma la posibilidad de ser utilizado en la industria biotecnolgica. Los
productos a partir de cepas seleccionadas de Trichoderma pueden ser aplicados bajo
diferentes condiciones (Martnez et al., 2013). Estudios anteriores han determinado el
enorme potencial de los aislados de hongos T. longibrachiatum en la degradacin de
los HAP de alto peso molecular tales como BAA y dems estudios de la industria
biotecnolgica (Rosales et al., 2013).

En los ltimos aos, ha habido una tendencia creciente hacia la utilizacin ms

eficiente de los residuos agroindustriales, incluyendo el bagazo de la caa de azcar.
Varios procesos y productos han sido reportado que utilizan bagazo de caa como
materia prima. Estos incluyen la produccin de la disolucin de pulpa, pasta de papel,
el etanol y energa, adems es un material lignocelulsico con potencial para la
disolucin de la produccin de celulosa, especialmente cuando se integra en los
procesos de biorrefinera (Wolf, 2011). El bagazo es la fibra residuo restante cuando se
presiona la caa de azcar para extraer el azcar. El bagazo se compone de fibra y
mdula, la fibra es de paredes gruesas y relativamente largo (1,4 mm) (Aigbodion et
al., 2010). El bagazo es un residuo lignocelulsico abundante se encuentran
tpicamente en los pases tropicales que procesan la caa de azcar, tales como Brasil,
India, Cuba, China y Nigeria (Aigbodion et al., 2010). Las fibras de bagazo (BF) son
generalmente gruesas y rgidas. Se utiliza como combustible para calderas por la
fbrica de azcar o como una materia prima para la fabricacin de productos de pasta
y de papel (Agunsoye y Aigbodion, 2013). Consta de aproximadamente el 40-50% de
celulosa y 20-30% de hemicelulosa y 18-25% de lignina. Debido a su bajo contenido
en cenizas (1-3%), el bagazo ofrece numerosas ventajas en comparacin con otros
residuos de los cultivos, tales como paja de arroz, paja de trigo (Freitas y Colodette,
2014). El bagazo de caa de azcar es un material lignocelulsico con potencial para la
disolucin de la produccin de celulosa, especialmente cuando se integra en los
procesos de biorrefinera (Wolf, 2011).

Caspeta et al., (2014) estudiaron la hidrlisis enzimtica con cargas de alto contenido
en slidos para la conver-sin de bagazo de agave a etanol. Estos reportaron un
mtodo eficaz que permite la produccin de jarabes con concentraciones de glucosa
altos, as como los altos rendimientos de biomasa en azcaresconversin de los
residuos de bagazo de agave utilizando hidrlisis enzimtica con cargas de alto
contenido en slidos realizados en un biorreactor de peg-mezclador a escala de
laboratorio. Y por otro lado Sposina et al., (2013) estudiaron el uso de celulasa-
celobiohidrolasa libre de mezcla para la hidrlisis de la celulosa microcristalina y el
bagazo de caa de azcar tratada previamente por moliendal, encontrando que los
tratamientos previos que alteran la estructura nativa y/o la composicin y/o
cristalinidad de la pared celular vegetal aumentan la hidrlisis enzimtica. En general,
1 tonelada mtrica de caa de azcar genera 280 kg de bagazo de caa,
aproximadamente el 50% de este residuo se utiliza en las fbricas de
azcar/destileras como la fuente de energa mientras que el restante se convierte en
abono o utilizan en la industria de papel (Peng et al., 2009).

El principal problema en el uso de celulosa de bagazo es su estructura cristalina que

hace que sea difcil para hidrolizar (Panagiotopoulos et al., 2013).Para la hidrlisis
enzimtica del material lignocelulsico, la mayora de los estudios utilizaron las
enzimas comerciales caros que se suman al coste de la fermentacin y por lo tanto
limitan la comercializacin de la produccin de hidrgeno a base de celulosa (Stork et
al., 2009). La hidrlisis enzimtica y la fermentacin se pueden llevar a cabo por
diversos enfoques pero con ciertos compromisos y desventajas. Hay varios estudios
relacionados con la cintica enzimtica de caa de azcar (Lo et al., 2008, Pattra et
al., 2008, Lo et al., 2009 y Fangkum y Reungsang, 2011), pero esta no se ha
estudiado utilizando la enzima T. Longibrachiatum, como se presenta en este trabajo.

MATERIALES Y MTODOS

Materia prima: Cuatro mil cien gramos (4100 gramos) de bagazo de caa proveniente
del municipio de Sahagn (Crdoba) fueron triturados con el fin de disminuir su
tamao y as hacer el material mas accesible a la hidrlisis (Sposina et al., 2013).
Siguiendo la metodologa de Pattra et al., (2008) se almacen en un medio refrigerado
y posteriormente se tamiz obteniendo tamaos de partcula menores de 2,4 mm. Se
sec el bagazo en un horno a 80 C durante 24 horas.

Hidrlisis enzimtica: La enzima que utilizada corresponde a un preparado comercial

de celulasa cida suministrado por DYADIC INTERNATIONAL, INC. Con la
denominacin comercial ROCKSOFTTM SUPER ACE, producto # 120. Es un preparado
de celulasa lquida proveniente de una cepa de T. longibrachiatum. La enzima fue
utilizada en su forma comercial. Los tratamientos enzimticos sobre el bagazo se
realizaron en condiciones ptimas de trabajo para la enzima, correspondiente a la
temperatura de 40 C y pH de 6 (Controlado por pH Indikator papier Universalin
dikator pH 1/10 marca Merck), manteniendo agitacin constante durante la hidrlisis,
para lo que se utilizaron recipientes de 1000ml (Schott Duran), donde se adicionaron
15, 20 y 25 g de bagazo en 500 ml de agua destilada. Este recipiente fue sumergido
en un bao termosttico a 40 C para mantener la temperatura constante durante
todo el proceso. Cuando se alcanz la temperatura dentro del recipiente se agreg el
complejo enzimtico con dosificaciones de 0,210, 0,420 y 0,840 mL a concentraciones
de bagazo de 30, 40 y 50 mg/mL con agitacin constante durante 5 horas. Las
experiencias se efectuaron por duplicado, siendo el resultado final la media de los
resultados obtenidos. El seguimiento de la velocidad de la hidrlisis enzimtica fue
controlado por medio de la determinacin del contenido de glucosa soluble producido
en el bao residual a diferentes tiempos. Para ello se utilizo GLUCOSA
OXIDASA/PEROXIDASA (enzimtica-espectrofotomtrica), como reactivo sensible. Se
emple glucosa anhidra como reactivo patrn para la obtencin de la curva de
calibrado del mtodo. Se utiliz un espectrofotmetro Spectronic 20D+ para la lectura
de la absorbancia.
Preparacin de la curva de calibrado y determinacin del contenido de glucosa: La
curva de calibrado se determin tomando como referencia el reactivo anhidro de
glucosa. Se prepararon disoluciones con concentraciones conocidas de 0,4 a 0,004 mg
de glucosa/mL, determinndose la absorbancia segn el procedimiento analtico
experimental descrito por Guerrero (2004). Para determinar el contenido de glucosa de
las muestras extradas durante la hidrlisis enzimtica, se procedi de la misma forma
que para la preparacin de la curva de calibrado, aplicando el mtodo de anlisis sobre
la muestra del bao cada hora durante 5 horas. Las muestras fueron sometidas a
filtrados para que no existieran partculas suspendidas con el objetivo de mejorar la
lectura en el espectrofotmetro.

Velocidad inicial de reaccin (V0), constante de Michaelis-Menten (Km) y velocidad

mxima de reaccin Vmax: Habiendo obtenido las curvas de concentracin de glucosa
en funcin del tiempo se sigui con la obtencin de los datos de V 0 para cada una de
las concentraciones de sustrato inicial (S0) conocidas. Para esto se debe tener en
cuenta que la medida de la V0 se debe hacer cuando la reaccin enzimtica esta en el
estado de saturacin, en donde los centros activos de la enzima se encuentran llenos
de sustrato para evitar el error introducido por el deterioro de la enzima, por lo tanto
la V0 se realizo antes que se consumiera el 10% de sustrato que es la pendiente de la
curva de avance a un tiempo menos de 30 minutos. Como la dosificacin de enzima es
muy pequea y la S0 es muy grande al comienzo de la reaccin se considera que la
concentracin de enzima-sustrato es constante para toda la reaccin. Siguiendo la
cintica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten, de los datos de V0 y
S0 obtenidos a concentraciones de 30, 40 y 50 mg/mL de bagazo de caa con
dosificaciones de enzima constante de 0,210, 0,420 y 0,840 mg/mL se calcularon los
valores de Km y Vmax. Para las representaciones grficas Michaelis-Menten se utiliz el
programa Hiperbolic Regresin Setup.

ANLISIS DE RESULTADOS

Curva de calibrado y de avance de la reaccin

En la Figura 1 se representa grficamente la curva de calibrado para los valores

medios de la absorbancia. Come se puede observar, la curva de calibrado tiene un
comportamiento lineal dentro de los mrgenes establecidos experimentalmente. A
partir de la Ecuacin (1), proveniente del despeje de la concentracin de glucosa de la
ecuacin lineal facilitada por la curva de calibrado se obtuvieron los datos de
concentracin de glucosa en el proceso de hidrlisis. En la Figura 2 se muestran las
curvas de avance de la reaccin que representa la velocidad de formacin del producto
en funcin del tiempo con dosificacin de enzimas de 0,210, 0,420 y 0,840 mL a
diferentes concentraciones de bagazo (30, 40 y 50 mg/mL).

(1)
 Fig. 1: Curva de calibrado del mtodo analtico empleado para la
determinacin de glucosa.

Fig. 2: Avance de reaccin del bagazo de caa a una

dosificacin de enzima del (a) 0,210 ml, (b) 0,420 ml y (c)
0,840 mL.

A travs de cada uno de estos diagramas se puede ver claramente como la velocidad
de formacin del producto en la primera hora es mayor que en las horas siguientes.
Esto se debe a que al adicionar la enzima al bagazo los centros activos de esta se
encuentran desocupados, y en esos momentos entran en contacto con el bagazo todos
los centros activos de la enzima, reaccionando con el sustrato que se encuentra en
mayor proporcin, provocando que se genere un rpido incremento en la velocidad de
formacin del producto (Goldbeter, 2013; Tnafriri y Edelman, 2007). Al transcurrir el
tiempo la cantidad de sustrato que la enzima puede llegar a degradar va
disminuyendo, generando a la ven una reduccin en la velocidad de formacin de
producto. Tambin se observ que al incrementarse la concentracin de sustrato,
manteniendo la dosificacin de enzima constante, la concentracin de glucosa o la
velocidad de formacin de producto aumentan, debido a que existe una mayor
cantidad de sustrato que la enzima puede llegar a degradar. Se pude observar
claramente que la mayor concentracin de glucosa obtenida se encuentra a una
concentracin de sustrato inicial [So] = 50 (mg/mL) y una dosificacin de enzima de
0,840 mL con un resultado de 0,1902 mg/mL. Tambin se puede analizar que al
incrementar la dosificacin de enzima manteniendo la [So] constante, la concentracin
de glucosa va aumentando.

Clculo De la V0 de la reaccin enzimtica y valores de Km y Vmax.

Los datos de V0 obtenidos a concentraciones de 30, 40 y 50 mg/mL con dosificaciones

de enzima constante de 0,210, 0,420 y 0,840 mg/mL se muestran en la Table 1. A
travs de estos valores de V 0 y [S0] s grafica la ecuacin de Michaelis-Menten, para l
clculo de los valores de Km y Vmax los cuales se observan en la Figura 3. En la Table
2 se presentan de forma resumida los datos de K m y Vmax para las dosificaciones de
enzima segn la ecuacin de Michaelis-Menten.

Tabla 1: V0 para una dosificacin de enzima de 0,210 ml a diferentes concentraciones

es de bagazo.
 Fig. 3: Representacin grfica de la ecuacin de
Michaelis-Menten para el clculo de Km y Vmax a
dosificaciones de enzima de (a) 0,210, (b) 0,420 y
(c) 0,840 mg/mL.

En cada una de las representaciones graficas de la ecuacin de Michaelis-Menten en

donde se mantiene la dosificacin de enzima constante variando la [So] de sustrato, se
obtiene una curva hiperblica, en donde al principio un aumento en la concentracin de
sustrato produce un incremento rpido en la velocidad de reaccin, pero si se sigue
aumentando la [So] la velocidad de reaccin comienna a disminuir. La velocidad de
reaccin que se obtiene a altas [So] se define como la V max de la reaccin ennimtica
bajo condiciones especificas de pH y temperatura. El valor de la V max en cada una de
las grafica nos indica que los centros activos de la enzima se encuentran saturados de
sustrato a altas concentraciones de este (Bajner y Strehler, 2012) . En la Table 2 se
observa como a una mayor dosificacin de enzima la V max es mayor. Esto se debe a
que existe una mayor cantidad de sitos activos disponibles que deben saturarse de
sustrato (Castro et al., 2013) .

Tabla 2: Datos de Vmax y Km segn Michaelis-Menten.

Con estas representaciones grafica de la ecuacin de Michaelis-Menten se puede hallar

los valores de Km, que representa la concentracin de sustrato a la que el 50% de los
sitios activos de la enzima estn ocupados con sustrato. En estas condiciones, la
velocidad observada debe ser igual a la mitad de V max. Al aumentar la concentracin de
enzima resulta un incremento en la Vmax por lo tanto las tres curvas son semejantes en
su forma, pero a mayor cantidad de enzimas tenemos curvas mas elevadas, esto se
debe a que la velocidad solo depende de la concentracin de sustrato. Los valores de
Vmax nos indican la velocidad de catlisis cuando la enzima se encuentra saturada de
sustrato (Goldbeter, 2013).

El valor de Km tiene un valor propio para cada enzima siendo as el parmetro que la
caracterina, por lo que este valor no tiene una variacin significativa. K m mide la
afinidad de la enzima con el sustrato, as para valore bajos, nos indica que la enzima
se une con fuerna al sustrato, saturndose rpidamente el catalinador con pequeas
cantidades de sustrato. Para este anlisis los valores de K m son muy altos lo que indica
que la afinidad entre el bagazo y la enzima es baja por lo tanto las concentraciones de
glucosa obtenida no son muy altas para este estudio (Goldbeter, 2013).

CONCLUSIONES

Al aumentar la concentracin de sustrato [S0] manteniendo la dosificacin de enzima

constante, la velocidad de formacin del producto [Glucosa] aumenta. Para este
estudio de hidrlisis ennimtica la dosificacin de enzima mas adecuada fue la de
0,840 mL. Segn los datos obtenidos se observ que al aumentar la dosificacin de
enzima, la concentracin final de glucosa despus de 5 horas aumenta. La afinidad que
existe entre la enzima y el sustrato es muy baja debido a los valores altos de K m que
se encontraron.

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Recibido Ene. 17, 2015; Aceptado Abr. 19, 2015; Versin final recibida May. 21, 2015