Biotecnologa de Plantas

Desafos para la expresin de genes introducidos

1. Importancia del promotor y elementos enhancers
2. Hay dos factores principales que determina si los
genes se expresan en el momento y cantidad
adecuadas
a) Un gen debe ser introducido en todas las clulas y
ser estabble para la transferencia a su
descendencia:
i. El promotor debe ser reconocido y bien
regulado o siempre activo. Un promotor fuerte
que se usa de manera rutinario es el promotor
del virus del mosaico de la colifor (CaMV 35S) y
el promotor de la Rubisco, regulada por luz
 ii. Se debe suministrar terminacin y seal de
poliadenilacin
iii. Se pueden necesitar secuencias que dirija la
protena a un orgnulo determinado
b) Uso de codones:
i. Los genes necesitan especificar aminocidos que
coincida con los tRNA y grupos de aminocidos de
la planta
ii. Los genes se pueden modificar para que contenga
los codones adecuados (ingeniera de codones)
Dinero que mueve la Ingeniera Gentica

Inversin global estimada alrededor de

20.000 millones de euros
2/3 consiste en inversin privada
Un estudio industrial estim el mercado
potencial para productos biotecnolgicos en
278.000 millones de euros en 2005

Hindmarsh et al. 1998

 DESARROLLO DE TECNOLOGA DE
DNA RECOMBINANTE
Aislar genes

Manipular el diseo

Integrar el DNA recombinante en las clulas

de la planta

regenerar un planta completa

 PARA LA MEJORA POR INGENIERA GENTICA
SE NECESITA.....

1. Conocer los procesos que controlan la caracterstica a

mejorar
2. Identificar especies o variedades que contienen los genes
de inters (cualquier especie)
3. Aislar el gen
4. Organizar el gen para que se exprese en el lugar y modo
adecuado
5. Que la protena (si la hay) sea funcional
6. Transformar plantas y seleccionar transformantes que
expresen la protena a niveles suficientes
7. Rezar......
 DESARROLLO DE TECNOLOGA DE
DNA RECOMBINANTE

CONFERIR CARACTERSTICAS DESEADAS DE MANERA

PRECISA

CRUZAR BARRERAS DE ESPECIES

CREAR NUEVAS COMBINACIONES DNA

INTRODUCIR SLO EL GEN DE INTERS

 Expresar un gen..
PROMOTOR GEN

TRANSFORMAR PLANTAS
Promotores: regulacin

PROMOTOR GEN

RNA polimerasa
transcripcin

PROMOTOR GEN
 Promotores
Promotores fuertes

GEN

Promotores dbiles

GEN

Promotores especficos de tejidos

GEN
 DesarrollosBiotecnolgicos

GMOs - Organismos Geneticamente modificados

GMO - Un organismo que expresa caracteres que resultan

de la introduccin de DNA extrao

Tambin llamado organismo transgnico

 Trminos importantes

Mejora
Gen beneficioso aadido de misma especie
Gen aadido por cruces dentro de especies
Source: USDA

Transformacin
Gene beneficioso de otra especie
Gen aadido por ingeniera genetica
Source: USDA
 Aclaremos conceptos

Mejora clsica Biotecnologa

Mejora slo intercambia genes dentro de especies
Slo en especies afines
PERO no es lo mismo que biotecnologa

Biotecnologa aade caractersticas que no son disponibles en

estas especies
Soja no tiene un gen que degrada Roundup
El gen viene de Bacteria
 Cruce interespecfico
Wheat Rye

Triticale
Nueva especie, pero NO
un producto
biotecnolgico
 Biotecnologa Vegetal
Tradicional Recombinante
Mejora clsica Tcnicas de DNA

http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5
 Los resultados de mejora clsica son
buenos per muy lentos

corn

cob

teosinte

Tomate silvestre
(Lycopersicon pimpinellifolium )
D= 1 cm
John Doebley photo
www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg
 hbridos
(heterosis)
Mutagnesis: Nuevo caracter sin un nuevo Gen

Mutagnesis cambian la secuencia de un gen

Nuevas, caractersticas interesantes se pueden obtener

Tratemiento de Mutagnesis
Gen Normal
susceptible

ATTCGA

Gen resistente
mutante

ATTGGA
 El mercado de cosechas biotecnolgica est
dominado por cinco Pases

6%
63%
4 mha 3%
43 mha
3 mha

3%
3 mha
21%
14 mha

Estos pases suponen el 98% del mercado

15 % de incremento en cultivo biotec en 2003
a2003 growing season data. http://www.isaaa.org/Press_release/Briefs30-2003/press/b30_english.htm
Productos de Biotecnologa bacteriano y animal
Biotecnologa chymosin
enzyma usado en productos lcteos
gen de levaduras
Source: Chr. Hansen obtenidos de bacterias GE
reemplaza el enzima del hgado

bST (aomatotropina bovina)

Source: Rent Mother Nature
incrementa la produccin de la leche
gen de la vaca
protein harvested from GE bacteria
replaces cow protein originally
harvested from pituitary glands
of slaughtered cows
 Cultivo de tejidos de plantas y
aplicaciones
Cultivo de tejido de plantas
Se define como el cultivo de partes de plantas en
condiciones estriles tales como rganos,
embriones, semillas, y clulas en medio lquido o
solidificado
Clulas diferenciadas se pueden cultivar in vitro para
generar plantas enteras, con el uso de una
pequea cantidad de material
Tejido meristemtico (clulas en crecimiento) se usa
para crecer plantas con flores, y es libre de virus,
aspecto importante en la propagacin de plantas
Los pasos bsicos de cultivo de plantas son:
a) Remover una pieza de tejido de una planta,
denominado un explanto.
b) Coloca un explanto en un medio nutritivo para forzar a
las clulas del explando convertirse en indiferenciadas
y formas un callo: Desdiferenciacin.
c) El tejido que forma el callo se transfiere a otro medio
nutritivo que permite si diferenciacin en un tejido:
Rediferenciacin.
d) La planta se transfiere a sustrato.
La capacidad de una clula vegetal a producir una planta
completa se llama Totipotencia.
Hay 6 tipos de cultivo in vitro que pueden crear una planta completa:
a) Cutivo de callo cultivo de un tejido desdiferenciado de un
explanto que se desdiferencia
b) Cultivo celular cultivo de clulas o agregado de clulas
(pequeo grupo de clulas) en cultivo lquido
c) Cultivo de protoplasto cultivo de clulas vegetales que
tienen sus paredes celulares quitadas
d) Cultivo de embriones cultivo de embriones aislados
e) Cultivo de semillas cultivo de semillas para generar plantas
completas
f) Cultivo de rganos Cultivo de rganos de plantas aislados
como anteras, races, tallos, yemas etc.
B. Micropropragacin

1. Plantas de inters se clonan a travs de un proceso

de cultivo in vitro denominado propagacin clonal in
vitro o micropropagacin

2. Forma parte de una industria muy importante puesto

que tiene el potencial de crear muchas ms plantas a
partir de un material inicial (por ejemplo olivos)
Hay 4 etapas en la micropropagacin:
Etapa 1 Iniciacin de un explanto estril, esterilizacin de
la superficie del tejido para prevenir contaminacin, y
tranferencia de explantos a un medio nutritivo.
Etapa 2 Iniciacin del tallo, que es la multiplicacin del
tejido del tallo a partir de explantos en un segundo tipo
de medio nutritivo.
Etapa 3 Iniciacin de raz, que es la multiplicacin de un
tejido de raz de explantos en medio nutritivo.
Etapa 4 Transferencia de las plantas a un medio estril u
otro sustrato bajo condiciones controlas para crecer
plantas completas.
Nutrientes como vitaminas, sacarosa, y hormonas vegetales pueden
controlar el cultivo del tejido. Por ejemplo alterando las cantidades de
las hormonas auxinas y citoquinicas induce multiples tallos para formar
un cultivo.
Embriones somticos (embriognesis somtica)
a) Produce estructura embrion-like llamados embrioides de tejidos de
plantas.
b) Hormonas como auxinas afecta el desarrollo normal y forma embrioides
de tejidos normales.
c) Los callos tambin se pueden usar, cambiando las hormonas para inducir
la formacin de embriones, y cada embrioide puede formar una nueva
planta.
d) Tambin se pueden producir en cultivo lquido, usando clulas
individuales o tejido de plantas:
i. Las paredes celulares se degradan con enzimas para formar
protoplastos.
ii. Se regenera la pared celular, comienza la divisin celular, y se forma
agragaciones celulares.
iii. Las agragaciones celulares se cultivan en un medio slido para formar
tallos y races.
e) Este es el mtodo preferido para produccina gran escala, usando
bioreactores para producir millones de embrioides.
f) Embrioides tambin se pueden empaquetar como semillas artificiales, que
se encapsulan para la distribucin y se protegen con un complejo de agar
y otros geles.
Productos qumicos de plantas
a) Metabolitos primarios y secundarios son tiles para las
plantas para funcionar como proteccin de mamferos,
insectos, y patgenos. Muchos de estos compuestos son
usados en medicina y alimentacin.
b) Ms del 25% de los productos farmacuticos en Europa
vienen de plantas y el 75% de la poblacin mundial dependen
de medicina obtenida de hierbas
c) En muchos casos el desarrollo de una droga comienza con la
identificacin de una hierba medicinal ampliamente usada
normalmente por indgenas. Es compuesto qumico (principio
activo) es aislado, sintetizado qumicamente y testado en
ensayos clnicos.
Cultivo celular:
i. Produce compuestos qumicos sin la necesidad de usar
plantas tropicales y subtropicales para crecer plantas
completas, que pueden daar el medio ambiente
ii. Puede producir mayoras cantidades de metabolitos que
plantas completas en condiciones controladas como un
bioreactor
iii. Shikonina, un producto qumico que se usa en muchas
cremas, cosmtidos y tintes se ha producido en grandes
bioreactores que producen entre 1.5 y 4.0 gramos de
shikonina por litro de cultivo
iv. Muchos procesos de produccin requieren mucho tiempo
(hasta 10 aos) y costa mucho desarrollar, por lo tanto las
ventas deben amortizar los costes
v. Los genes se pueden introducir en plantas de manera que
permita a las clulas de plantas producir metabolitos qye no
producen normalmente
vi. Puede ser perjudicial para pases en desarrollo, que se
basa en la extraccin de metabolitos de plantas en lugar
que producirlos
Otros usos del cultivo de tejido
1. Fusion de protoplastos
a) Protoplastos se generan por digestin de la
pared celular
b) Dos protoplastos de dos especies no
relacionadas se fusionan por productos
qumicos o electroporacin
c) El material gentico se mezcla junto, y las
clulas hbridas se criban buscando
caracteres de inters
Variacin somaclonal
a) La variabilidad gentica producida por cultivo de tejidos. Esta
variabilidad puede ser explotada para mejora caractersticas
de cosechas y plantas ornamentales, tales como maz, trigo,
cebada, y patata
b) Caracteres tales como tolerancia a sal y metales pesados,
resistencia a insectos, y mejora de la calidad de semilla se
puede generar por un proceso de seleccin
c) La variabilidad gentica se produce por cambios en el
nmero cromosmico debido a reorganizaciones
cromosmicas, amplificacin gnica, y la activacin de
transposones. Como resultado, planta hijas difieren de
parentales. El manteniemiento de caracteres deseables es
esencial
Colecciones de Germoplasma
a) El material gentico de una planta, que puede contener
caractersticas importantes e incrementar el valor de una
planta, como resultado de mayor tolerancia a sequa y plagas
b) Germoplasma antiguo se usa para introducir nuevos
caracteres tales como resistencia a enfermedades en plantas
actuales
c) El germoplasma va desapareciendo debido a la perdida de
cultivo tradicional, eliminacind de viejos cultivos, y el uso de
plantas modernas en lugar de plantas antiguas
d) Banco de genes
 Introducir genes en plantas
1) Infectar clulas de plntas con plsmidos como
vectores que llevan el gen de inters

2) Disparar balas microscpicas que contienen en su

superficie el gen directamente a la clula
 Ingeniera gentica de plantas
Transformacin de plantas y Agrobacterium tumefaciens.
1. Una bactera comn de suelo que causa tumor en
agalla
2. La bacteria entra por lugares donde la planta ha sido
daada
3. La bacteria tiene un plsmido llamado plasmido Ti
que contiene genes llamados genes vir (virulencia)
que codifica una protena que transfiere una regin
del plsmido llamado T-DNA a clulas donde se pa
producido el dao
4. Una vez que las clulas vegetales son infectadas,
las hormonas vegetales estumula el crecimiento de
las clulas tumorales
5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los
genes vir eliminados, de manera que el DNA extrao
puede ser insertado en genoma de plantas,
transformando la misma
6. Un mtodo de transformacin general:
a) Clulas de un disco de hoja, plntulas, o yemas, y
protoplastos reciben el DNA y las clulas crecen
b) Se usa un medio de seleccin de aquellas clulas
con el nuevo caracter
c) Las clulas transformadas se cultivan en un medio
slido para formar un callo
d) Las hormonas son modificadas para promover la
formacin de tallos y races
e) Se examinan las plantas modificadas para determinar
si se expresa el gen introducido
 Agrobacterium
Bacteria patogena de plantas
Causa enfermedad crown
gall
Plasmido Ti en cepas patogenas
T-DNA transferido a celulas de la
planta T-DNA

Plasmido Ti
El ingeniero de la naturaleza:
Agrobacterium tumefaciens
 Ingenera gentica de plantas con
Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens: usado
rutinariamente.
Contiene T-DNA
(plsmido bacteriano)
Los genes se integran en
el DNA bacteriano
cuando se transfiere el T-
DNA
Induccin del tumor
por A. tumefaciens
El tumor de A.tumefaciens puede ser
grandecito
 Biologa de A. tumefaciens
Bin conocido que produce el tumor de agalla
A.tumefaciens es una
bacteria que vive en el
suelo (en la rizosfera)
donde usa nutrientes que
provienen de las races
Infecta a travs de heridas
son atradas
quimiostticamente a ellas

www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm

T-plasmido bacteriano produce Dao en plantas produce

receptores para actosiringona acetosiringone
 Las bases de ingeniera gentica
mediada por Agrobacterium
T-DNA de A. tumefaciens se excinde e integra en el
genoma de plantas como parte de una infeccin natura
Cualquier DNA insertado en el T-DNA ser tambin
integrado
 Genes importantes condificados por
el plsmido Ti
1. Citoquininas
(hormona vegetal esencial en divisin celular y crecimiento
tumoral)

2. Enzimas para la sntesis de cido indolactico (auxina)

Hormona vegetal (induce elongacin de tallo y hoja, induce partenocarpia y previene
envejecimiento)

3. Enzimas implicadas en sntesis y liberacin de metabolitos

de plantas: las opinas
(derivados de aminocidos)
las grocinopinas (derivados fosforilados de azcares)
Nopaline

Opinas y agrocinopinas son NUTRIENTES de A.tumefacies.

No puden ser usados por otras especies bacterianas
Proporciona un nicho nico para A .tumefaciens
 Cytoquininas son hormonas vegetales
derivadas de la purina adenina

Zeatina es una de de las citoquininas cuya

sntesis puede ser codificada por el
plsmido Ti

Aislada del maz

Expresin especfica celular de citoquinica
en clula infectada por A.tumefaciens
 Opinas son nutrientes que se usan para
detectarse entre bacterias
Las clulas de plantas comienzan a secretar
Las opinas
del T-DNA bacteriano transferido

opina difunde en clulas de alrededor y

sirve como molculas seal para la
conjugacin de Agrobacterium

(Quorum sensing)
 Plsmido Ti
Regin
T-DNA
DNA entre bordes
L y R es
Transferido a una
planta como
Genes que
producen ssDNA
tumor

Catabolismo de Opinas
Genes codificados
Region por el T-DNA se
Vir (virulencia) pueden sustituir
ORI
por otros genes
 Vectores basados en plsmidos
Ti

Sistemas binarios Vectores co-integrativos

Necesita 2 vectores: Necesita 3 vectores

Plmido con el Ti desarmado

Plsmido Ti desarmado
capz de infectar
Con gen de inters Forma
(sin genes vir) plsmido co-integrado Vector intermedio
despus de Con regin T-DNA y el gen
Vector helper recombinacin de inters
para infeccin homloga sobre T-DNA (trasferido por conjugacin)
(con genes vir) Vector helper Para
trasferencia del plsmido
intermedio al Agro
 Vectores co-integrativos
(plsmido ti hbridos)

Rramente
usados

DESVENTAJAS:
1) Se requiere mucha homologa entre plsmido Ti y plsmido de E. coli (vectores
intermedios basados en pBR322) lo que hace que sean dificil de construir y usar

2) Transferencia ineficiente comparados con vectores binarios

 Vectores binarios
Regin T DNA eliminada
Gen de inters

Marcador de seleccin
en planta

Plsmido
Disarmed Regin de HELPER
Ti
Marcador de seleccin
plasmid Virulencia
en bacteria

ori para E.coli ori para A. tumefaciens ori para Agro

DESVENTAJA: Segn la orientacin, los plsmidos con dos orgenes de replicacin

pueden ser inestables en E. coli

VENTAJA: Se usan vectores pequeos, lo que incrementa la eficiencia de transferencia

de E. coli a Agrobacterium.

No se requiere recombinacin intermolecular

 Promotores usados para la expresin
en plantas transgnicas
35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV

CaMV es un genoma circular de doble

cadena dsDNA

CaMV 35S es un promotor muy fuerte

(constitutivo o ectpico) que es activo en la
mayora de tejidos de dicotiledoneas
Pasos en la creacin de una planta transgnica
1. Los dos plsmidos se transfieren a Agrobacterium
2. Un cultivo vegetal se infecta con el Agro
3. Productos de los genes Vir escinden el T-DNA y lo transfieren
al cromosoma de la planta
L-Border Polilinker Gen de resistencia a Kan R-Border

Gen de inters
4. Seleccin de clulas transformadas en Kan
5. Confirmar la presencia del transgen por PCR
6. Una planta completa se puede crecer de clulas
transformadas !!!
Callo
Tejidos especializados de plantas
que se forman en una herida; se
forma un cambiun para sellar la
herida de manera progresiva

Clulas del Callo

Son las m fciles de transformar
(sus paredes son muy delgadas)

Protoplastos (sin paredes

celulares son ms fciles de
transformar, pero es ms deficil de
obtener una planta completa
 Los callos se producen por manipulacin de
concentraciones externas de hormonas vegetales
Hormonas vegetales fundamentales

Auxinas Citoquininas
Relacionadas estructuralmente a
Auxina natural es el cido indolactico (IAA) la adenina

Producida por tejidos de crecimiento

Meristemo apical es el sitio principal activo, especialmente races,
de sntesis de auxinas embriones y frutos
auxina < CITOQUININA TALLOS
AUXINA > citoquinina RACES
auxinA = citoquinina callo indiferenciado
 Producir callo transformar callo
estimular tallo por adicin de citoquinina

+ citoquinina

Procedimento fcil
(segn especie) para
dicotiledneas

Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999

 Monocots no son fciles de manejar
callo es difcil de iniciar, callus A.tumefaciens no es
una bacteria patognica para monocots
1. Se elimina el pericarpo y se obtienen embriones
inmaduros (0.5 - 1.0 mm)

2. Los embriones inmaduros

se colocan en un medio de
induccin de callos

La transfomacin se
realiza con una pistola
de genes
Medio muy osmtico
prepara el callo para
transformacin
 DNA con el gen de inters y resistencia a antibitico
cubre partculas de oro

Los callos se
colocan en una
cmara de vaco, la
presin de Helio
dispara el DNA
hacia las clulas Partculas de oro
Arma de genes
recubiertas con el
DNA

Los callos se dejan Cmara de vaco

en medios con alto
osmtico durante
20 horas despus
del disparo
plantsciences.montana.edu/ .../transform1.htm
3. Bombardeo de partculas usando una pistola de genes que usa Helio

Metodologa
Gas de Helio

Discos de
ruptura

macroprojectiles

Clula vegetal
Partculas recubiertas
con el DNA

1. Bombardeo de clulas con partculas de oro

2. Detectar actividad con protenas marcadoras

- No requiere cultivos celulares o pretratamiento de cultivos

- Es la que se emplea normalmente para la transformacin de monocots
Despus del disparo los callos se sitan en un medio
de seleccin por varias semanas

Los callos se transfieren a medio para inducir la

produccin de tallos
Despes de inducir pequellos tallos se
transfieren a a contenedores con medio que
induce la foramacin de races
 Las pequeas plantas se transplanta a suelo y
se aclimatan bajo condiciones de alta humedad

Con los procedimientos actuales solo entre un 10-20% de las plantas

actuales son trangnicas,y por tanto se deben comprobar en la expresin
del transgen
4. Electroporacin metodologa
Optimizaci
Optimizacin de mutiples variables

Desidad de protoplasto
2 x 106mL-1 Eliminacind de
paredes celulares no
siempre necesario

Concentracin plsmido
200g/mL
1.5 kV

Tamao plsmido
3-6 Kb
Concentracin de iones
KCl 125 mM

Examinar clulas para la actividad de transgen

(por ejemplo expresin GUS)
 http://home.ust.hk/~rocklab/dc3gus/
Gen reportador gen cuya expresin es fcil de
ABA-inducible expression
observar. Usada para reportar la expresin del gen
- regulacin y localizacin

gen GUS (uidA)

-glucuronidasa
X-Glc Precipitado azul
cido 5-bromo-4-cloro-3-inolil
--D-glucurnico
Guard cells Roots
Protena fluorescente verde (GFP)

Protena de la medusa Aequorea victoria.

GFP se produce en muchos organismos heterlogos
Muchas variantes disponibles comercialmente (protena fluorescente
roja)

Gen de la kuciferasa (luc)

A. thaliana C24 wild type (left) Aequorea victoria
35S-mgfp4-ER transformed (right)

La mosca de fuego de norte amrica libera luz verde durante la oxidacin del sustrato luciferina
Cmaras CCD pueden detectar bioluminiscencia en tiempo real