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Objetivos
Explicar el concepto microbiolgico de indicador de contaminacin.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante el recuento
de mesfilos aerobios y la bsqueda de microorganismos coliformes totales,
coliformes fecales y Escherichia coli.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales.
Aplicar las tcnicas de cuantificacin de microorganismos totales y comparar con
las tcnicas de determinacin de viables.
Introduccin
La determinacin de la calidad bacteriolgica reviste gran importancia en el mbito de
la salud pblica ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo
evitando as epidemias gastrointestinales.
El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o
por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patgenos
(principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la
disentera (Shigella dysenterieae) o el clera (Vibrio cholerae) entre otros.
Para detectar ese peligro potencial, se utilizan indicadores de contaminacin que renen
las siguientes caractersticas:
Por todo ello, el aspecto ms importante del anlisis bacteriolgico del agua es la
determinacin de coliformes que puede hacerse por el mtodo del nmero ms
probable (NMP) o por el mtodo de filtracin de membrana (FM), el primero es el mtodo
oficial en nuestro pas.
Existen otros mtodos microbianos que son indicadores de otros tipos de contaminacin:
Streptococcus de origen fecal, que son ms abundantes que los coliformes en el tracto
intestinal y heces de los animales, pero sobreviven menos que los coliformes porque
prcticamente no se multiplican en el agua, por ello su predominio en el agua indica
contaminacin fecal proveniente de animales o contaminacin relativamente reciente.
Clostridium perfringens que tambin se encuentra en la flora normal intestinal y, por ser
esporulado, resiste la presencia de sustancias txicas que se encuentran en aguas
residuales de industrias; por eso es indicador de contaminacin fecal en este tipo de
aguas, en las que otros microorganismos no sobreviven.
El Cdigo Sanitario Mexicano establece que el agua potable debe contener menos de
20 coliformes por litro (es decir menos de 2/100mL) determinados por el mtodo del NMP,
y que la cuenta de mesfilos aerobios no debe exceder de 200 colonias/mL de agua
determinadas en agar triptona glucosa extracto de levadura a 35C durante 24 horas.
Muestreos
Muestreo 1
Materiales
Muestra
Agua almacenada
Reactivos
Solucin de tiosulfato de sodio 10%
Etanol
Algodn
Metodologa
Muestreo 2
Materiales
Muestra
Hielo raspado (sin sabor)
Reactivos
Solucin de tiosulfato de sodio 10%
Metodologa
a) Toma de la muestra
1 sesin
Tcnicas de Dilucin y vaciado en placa, NMP, y Filtracin.
Materiales
Medios de cultivo
1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estndar.
5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin (3X)
1 caja con Agar Bilis Rojo Violeta
Muestras requeridas
Agua de sabor (10mL)
Hielo raspado (600mL)
Metodologa
Esquema 1
1mL 1mL
Muestra
Homogenizar
Agar cuenta
estndar Control
37C
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37C 44.5C
24 48 h 24 48 h
-
1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con caldo
lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin. Rotular.
2. Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
c) Tcnica de filtracin:
1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta con los siguientes datos:
1515-11-# de equipo
Filtracin (muestra)
dd/mm/aa
7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recin inoculada e incubar a
37C durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubacin revisar los resultados y guardar en
refrigeracin.
2 sesin
Resultados de tcnicas de NMP, Dilucin y vaciado en placa, y Filtracin.
Materiales
Por equipo
2 gradillas
2 asas
Por grupo
3 cuentacolonias
Medios de cultivo
5 tubos con 10.0mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%
5 tubos con 10.0mL de caldo EC
2 cajas con agar EMB
Metodologa
1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.
Materiales
Por equipo
2 gradillas
2 asas
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
Medios de cultivo
1 caja con Agar Cuenta Estndar o BHI
2 tubos con medio SIM
4 tubos con caldo RMVP
2 tubos con Agar Citrato de Simmons
Solucin salina isotnica
Metodologa
1. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
2. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 horas.
3. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:
Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con
morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa
y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa
microscpica y pruebas bioqumicas.
4. Incubar las placas a 35C por 18-24 horas.
5. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos
cortos o cocobacilos Gram-negativos.
A partir de las cajas de agar cuenta estndar, selecionar una colonia, resuspenderla en
2mL de solucin salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.
4 sesin
Tcnicas Redox, Turbidimetra y Microscopia.
Materiales
Por equipo
2 mecheros
1 gradilla
1 microscopio
1 objetivo micromtrico
1 ocular micromtrico
1 juego de colorantes de Gram
1. Agitar la muestra de leche transferir 10mL a cada uno de dos tubos de ensayo
2. Agregar 1mL de azul de metileno tiocianato a uno de los tubos con leche y 1mL de
resarzurina al otro tubo, mezclar bien y colocar en un bao de agua a 37C (o en la
incubadora)
3. Despus de 10 minutos, asegurar los tapones e invertir lentamente los tubos tres
veces para distribuir la capa de crema
4. Observar cada 30 minutos y continuar la incubacin hasta que registre decoloracin
del colorante.
5. Anotar los resultados obtenidos prcticamente, de acuerdo con la siguiente
clasificacin:
Azul de metileno
Calidad Tiempo de incubacin en el que se presenta Nmero de bacterias/mL
la decoloracin
Excelente No se decolora en 5.5 h < de 500 000
Buena Se decolora entre las 2 y 5.5 h 500,000 a 4 000 000
Mala Se decolora entre los 20 minutos y 2 h 4 a 20 millones
Muy mala Se decolora en 20 minutos > de 20 millones
Resarzurina
Calidad Coloracin de la resazurina
Excelente Violeta
Buena Violeta rosado
Mala Rosa
Muy mala Decoloracin total
e) Tcnica turbidimtrica.
1. Inocular 24 horas antes cuatro de los cinco matraces de caldo nutritivo con una
cepa de levadura e incubar a 28C en agitacin.
2. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de levaduras, insertar el tubo
lateral en el nefelmetro y tomar la lectura en Unidades Klett, emplear como blanco
el matraz sin inocular.
3. Determinar las Unidades Klett en el resto de los matraces y en la curva de Mac
Farland.
4. Graficar la curva de Mac Farland: UK en el eje Y y nmero de microorganismos en el
eje X.
5. Determinar la ordenada al origen (0) y la pendiente de la recta.
6. Determinar el nmero de microorganismos en las muestras problema.
7. Asignar un matraz por mesa y a partir de este realizar tres diluciones decimales.
8. Inocular por duplicado 0.1mL de la dilucin 10-3 en una caja con agar PDA y
extender con varilla de vidrio.
9. Incubar a 28C durante 48 horas.
UK
1mL
0.1mL
Cuenta de Breed
Disposicin de desechos
1. Esterilizar los tubos en los que prepar las suspensiones bacterianas y posteriormente
lavarlos.
2. Despus de realizar las lecturas correspondientes, sellar las cajas de Petri de plstico y
colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A
Bibliografa complementaria
Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American
Public Health Association. 20th edition. Washington.
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la
cuenta de bacterias aerobias en placa.
Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de
bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable.
Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo
para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias.
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 8 Edicin.
Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory
manual. 7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th
edition. Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
Mac Faddin, Jean F. 2003. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias
de importancia clnica. 3 edicin. Mdica Panamericana, Argentina. QR67 M3318
2003
Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6 th
edition. McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology: an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007